DE1936437A1 - Verfahren zur Herstellung von Proteasen und die dadurch hergestellten Proteasen - Google Patents

Description

Patentanwalt» DIpI-Ing. R. Beetz u. Dipl.-Ing. Lamprecht 5O1-14.771P 17.7.1969

MOndMHi 22, Staliwdorfslr. 10

Societe Industrielle pour la Fabrication des Antibiotiques S.X.P.A., POTEAUX (Prankreich)

Verfahren zur Herstellung von Proteasen und die dadurch hergestellten Proteasen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Proteasen, die in alkalischer Umgebung aktiv sind, und die durch das Verfahren hergestellten Proteasen.

Es ist bereits bekannt, daS zahlreiche Mikroorganismen während ihrer Fermentation in verschiedenen Umgebungen bestimmte enzymatische Substanzen erzeugen können* von denen einige, im allgemeinen Proteasen genannt, eine mehr oder weniger groSe eiweifauflösende oder proteolytisohe Wirkung haben, Proteasen werden gegenwärtig auf den verschiedensten Gebieten verwendet. Sie können sum Beispiel in der Humantheragie, aber ebenso industriell in Wasohmitteln verwendet werden. Ebenso sind sie bereits Waschlaugen zugesetzt' worden; die Proteasen müssen dann Jedoch ihre Aktivität in der Umgebung, der sie ausgesetzt sind, beibehalten, wobei die Umgebung im allgemeinen alkalisch oder sogar stark alkalisch ist.

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Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein einfaches und leistungsfähiges Verfahren zur Herstellung dieser Proteasen anzugeben.

/ Ein Verfahren zur Herstellung von Proteasen, die in alkalischer Umgebung aktiv sind, ist gemäl der Erfindung daduroh gekennzeichnet, dal zuerst eine aerobe Fermentation eines Stamms des Bacillus Subtllis nach Tracy in einem Nährboden vorgenommen wird, der mindestens eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und assimilierbarem Stickstoff sowie mineralische Bestandteile aufweist, wobei der pH-Wert des Nährbodens 7*5 - 9,5 am Anfang der Fermentation beträgt, dal am Ende der Fermentation die unlöslichen Bestandteile des Nährbodens abgetrennt werden, dal dann die erhaltene klare flüssige Phase mit Mineralsalzen behandelt wird, die die in der flüssigen Phase enthaltenen Proteasen ausfällen können, und dal schlieJlich der erhaltene Niederschlag isoliert wird.

Vorzugsweise benutzt nan als Kohlenstoffquelle Maisstärke und/oder Kartoffelmehl und als Stickstoffquelle Sojaölkuchenmehl und/oder Mäismazerationeflüssigkeit. Die mineralischen Bestandteile können sehr verschiedener Natur sein, sie sollten aber in der Hauptsaohe duroh Natriumchlorid und CaIciuiakarbonat \ gebildet werden» Der Änfangs-pH-Wert des Mährfes&ene wird, falls notwendig, verzugsweise auf etwa 9eingestellt. Die - , Fermentation wird für 25-48 h bei starker Belüftung und teei einer Temperatur von 28 — 40 ⁰C, vorzugsweise 36 ⁰C, durchgeführt.

Wenn die Fermentation beendet ist* werden die unlöslichen Beatandteile dureh Absentrifugieren ©der Filtration der Fementatiengflüssigkelt abgetrennt·-GemKi* einem beverzusten*Aus-

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führungsbeispiel der Erfindung wird zur Ver'b^serung der Qualität der erhaltenen klaren Flüssigkeit der Nährboden am Ende der Fermentation auf einen pH-Wert von etwa 4,5 gesäuert, vorzugsweise mit Essigsäure «der Schwefelsäure oder einer Mischung von beiden Säuren, wonach man die unlöslichen Bestandteile des Nährbodens abtrennt/ die klare Flüssigkeit erhält und das Ausfällen vornimmt. Wenn diese Vorgänge nicht schnell" durchgeführt werden können, w~ird vorzugsweise die klare Flüssigkeit nach ihrer Gewinnung neutralisiert, um eine gute Stabilität der Proteasen zu gewährleisten. -"--."

Das Ausfällen, dem die klare Flüssigkeit unterzögen wird, die wie oben beschrieben erhalten wurde, wird mit Hilfe von Mineralsalzen wie Alkalisulfat oder Ammoniumsulfat oder einem Gemisch dieser Salze bei bestimmten pH-Werten durchgeführt*

Das Ausfällen, dem die wie oben beschrieben erhaltene saure Flüssigkeit unterzogen wird, wird vorzugsweise durchgeführt, indem zuerst der Flüssigkeit ein ausfällendes Mineralsalz zugesetzt wird, wonach das Reaktionsgemisch bis zu einem pH- ' Wert von 8,4 unter Umrühren alkalialert wird. Das Ausfällen kann auch so vorgenommen werden, dal zuerst die klare Flüssigkeit durch eine starke Base wie Natriumhydroxyd bis zu einem pH-Wert von etwa 11 alkalisiert wird, wonach die ausfällenden Mineralsalze jeweils unter Schütteln des Gemisches zugesetzt werden.

Schlieilich kann direkt aus der Fermentationsflüssigkeit, aus der die unlösbaren Bestandteile entfernt sind, und bei des der erhaltenen klaren Flüssigkeit eigenen pH-Wert ausgefällt werden.

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Es ist auch möglich, der Flüssigkeit kleine Mengen löslicher Calciumsalze als Stabilisatoren zuzusetzen, und zwar unabhängig ?οη den Bedingungen, unter denen das Ausfällen durchgeführt worden ist.

Am Ende des Ausfällens trennt man den erhaltenen Proteasenniederschlag ab, im allgemeinen durch Abzentrifugieren oder Trocknen, so'dal der gröfte Teil der für das Ausfällen verwendeten Salze isoliert wird« Man kann das erhaltene Präparat auch in einem Heizschrank unter Vakuum oder in einem Fliefbett trocknen.

Das Verfahren gemäf der Erfindung kann vorzugsweise unter folgenden Bedingungen durchgeführt werden: .

Der Nährboden wird auf einen pH-Wert von etwa 9 zu Beginn der Fermentation eingestellt, die Fermentation wird etwa Jo h lang bei einer Temperatur von etwa yj G durchgeführt, danach wird die Fermentation beendet, der Nährboden wird auf einen pH-Wert von 4,5 ± Q, 1 mit Essigsäure gebracht, ansehliefend werden die unlöslichen Bestandteile des Nährbodens entfernt, wonach der so erhaltenen klaren Flüssigkeit Ammeniunisulfat in einer Menge von mindestens 100 g /1 klarer Flüssigkeit zugesetzt wird, dann wird der pH-Wert des Nährbodens auf 8,4 i 0,1 mit Natriurahydroxyd eingestellt, anschliefend wird der Nährboden für mindestens j30 min langsam geschüttelt und schlief lieh der erhaltene Niederschlag isoliert und getrocknet.

Die durch das Verfahren gemäf der Erfindung erhaltenen Proteasen haben sich in wässriger Lösung als stabil und in alkalischer Umgebung als sehr proteolytisch gezeigt. Zur Erläuterung dieser Eigenschaften sind die unten angeführten Versuchsergebnisse für die Stabilität und die proteolytisehe Aktivität für Präparate gewonnen worden, die gemäf dem im

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BADORlOfNAL

Ausführungsbeispiel k weiter unten beschriebenen Verfahren erzeugt wurden.

A) Die Stabilität wurde in wässriger Lösung einerseits bei verschiedenen pH-Werten und andererseits bei verschiedenen Temperaturen untersucht.

Aus einem Präparat mit einer bestimmten proteolytisehen Aktivität wurden wässrige Lösungen dieses Präparates hergestellt, die eine Aktivität von 5 Casein-proteolytisehen Einheiten/ml hatten. Am Ende der Untersuchung wurde die übrig gebliebene proteolytisohe Aktivität bestimmt und in Prozent der anfänglichen proteolytischen Aktivität ausgedrückt. Die proteolytische Aktivität wurde immer gemäi dem Verfahren von Kunitz (Journal gen. Physiol. 30, 291, 19^7) durch Einwirkung des Präparates auf Casein bestimmt, wobei die Reaktion in einem Carbonatpuffer mit einem pH-Wert von 10,5 während 10 min bei 4o ⁰C durchgeführt wurde..

a) Stabilität in Abhängigkeit vom pH-Wert.

Wässrige Lösungen, die anfangs mit 5 Casein-proteolytisehen Einheiten/ml titriert wurden und unterschiedliehe pH-Werte zeigten, wurden für J> h auf 25 ⁰C gehalten. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben:

Tabelle I

pH-Wert der 5 6 7,5 8 9 10 11 12 Lösung

Aktivität r^.l

am Ende des Ver- 90 95 99 99 98 95 90 65 suchs

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Es ist ersichtlich, dal die Lösungen in einem groÄen pH-Bereich, insbesondere von 7*5 - 9, stabil waren.

b) Stabilität in Abhängigkeit von der Temperatur.

Anfangs mit 5 Caseln-proteolytischen Einheiten/ml titrierte Lösungen wurden auf einen pH-Wert von 10,5 gepuffert und bei verschiedenen Temperaturen während 10 min und 20 min gehalten. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben.

•	- 40	-Tabelle II	60
Temperatur	100 ". ■ - - . -	50	- 66
Aktivität nach 10 min	98	98	55
Aktivität nach 20 min	90

Es ist ersichtlich, dal die Aktivität zwisohen 4o und 50 ⁰C praktisch erhalten geblieben ist.

B) Die Aktivität wurde untersucht> indem die Menge des Caseins, aufgelöst durch eine Lösung «it gegebenem Titer des Präparates, in Abhängigkeit vom pH-Wert, der Temperatur und der Kontaktdauer,'bestimmtwurde.

a) Aktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert..,

Auf das Casein wirkten titrierte Lösungen des Präparates

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ein, die auf verschiedene pH-Werte gepuffert worden waren. Nach 10 min Reaktionszeit bei 4o ⁰C wurden die löslichen Proteine des Gemisches gemessene Man beobachtete, dafi die proteolytische Aktivität bei einem pH-Wert von 10,5 ^aro größten war. Diese maximale Aktivität wurde gleich 100 % gesetzt, und die für die verschiedenen pH-Werte erhaltenen Ergebnisse sind in Prozent dieser maximalen Aktivität angegeben (vergleiche die folgende Tabelle III): .

Tabelle III

pH-Wert 8 9 10 10,5 Π

Proteolytische

Aktivität C£] 60 80 95 100 87

b) Aktivität in Abhängigkeit von der Temperatur.

Man lief titrierte Lösungen des Präparates, die auf einen pH-Wert von 10,5 gepuffert worden waren, auf das Casein für 20 min bei verschiedenen Temperaturen einwirken. Die maximale Aktivität wurde bei einer Temperatur von 6o ⁰C gemessen. Diese. maximale Aktivität wurde gleich 100 % gesetst, und die für andere Temperaturen erhaltenen Ergebnisse sind in Prozent dieser maximalen Aktivität ausgedrückt (vergleiche feigende Tabelle IV): ^;

Reaktionstemperatur Aktivität [β]

Tabelle IV	50	60	70
■50 -*Q	74	100	20
20 42

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BAD ORtOtNAL

c) Aktivität In Abhängigkeit von der Kontaktdauer

Man lief titrierte Lösungen des Präparates, die auf einen pH-Wert von 10,5 gepuffert worden waren, auf das Castfln verschieden lang einwirken. Es wurde festgestellt, dafi naoh 20 min Reaktionszeit die proteolytisehe Aktivität doppelt so grol als wie nach 10 min war. Es wurde anschlieiend festgestellt, daf naoh 60 min Kontaktzeit die Aktivität nur den vierfachen Wert der Aktivität nach 10 min betrug. Daher ist die Aktivität anfangs proportional zu der Kontaktzeit, was jedoch bei längerer Kontaktzeit nicht mehr der Fall ist, wie im übrigen normalerweise für typische enzymatlsche Reaktionen festgestellt wird.

Es wurde schlieflieh festgestellt, dal die Präparate selbst bei gewöhnlichen Temperaturen unter normalen Lagerbedingungen' stabil waren.

Es sollen jetzt verschiedene Ausfuhrungsbeispiele des Verfahrens gemäl der Erfindung beschrieben werden.

Ausführungsbeispiel· 1

Aus einem Stamm des Bacillus Subtilis naoh Tracy, der lyophilislert worden war, wird eine erste Kultur in einem Nährboden mit folgender Zusammensetzung erzeugt: Pepton: 6 g, Glukose: 1 g, Fleischextrakt:. 2 g, enzymatischer Hefeextrakt: 4g, Gelose: 10 g. Wasser q.s. auf 1 1 Gemisch. Mit dieser ersten Generation werden Bit Hilfe eines Platinbogens 55 ml eines Nährbodens geimpft, der folgende Zusammensetzung hat: Sojaölkuchenmehl: 45 g, Maisstärke: 10 g, Calciumcarbonate 5 gj Natriumsulfat: 7 g* Specköl: 2,5 g, Wasser q.s. auf Nährboden. Dieser Nährboden wurde 20 min lang bei 121 ⁰C in

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einem Autoklaven vor der Impfung sterilisiert". Die 55 ml Nährboden werden in ein 500 ml-Becherglas gefüllt, das naeh Impfung auf" einen Drenschüttler gesetzt wird (220_iSchüttelungen/min_J, 7 om Exzentrizität). Die Inkubationszeit betrügt23 - 24 h bei" 28 ⁰C. Ansohlielend werden 10 $ der so erhaltenen Vorkultur in ein 500 ml-Becherglas gegeben, das Jk,5 ml eines Nährbodens, im folgenden Nährboden 343 A genannt, mit folgender Zusammensetzung enthält: Sojaölkuchenmehl: 50 g, Maismazerationsfiüssigkeit: 5 g» Stärke: 25 g, Natriumchlorid: 1,6 g, Calciuracarbonat: 6g,_r Wasser q.s. auf .1 1 Nährboden.. Dieser Nährboden wurde vor dem Impfen mit Soda auf einen pH-Wert von 9 eingestellt und 20 min lang bei 121 C in einem Autoklaven sterilisierte Nach dem Impfen läÄt man die Mischung 48 h lang bei 28 ⁰C fermentieren, und das Becherglas wird auf einen kechanisehen Schüttler, geschüttelt (220 Schüttelungen/min, Exzentrizität 7 om).

Es werden wie eben beschrieben 10 500 ml-Beehergläser hergestellt, man gleit den Inhalt der Beohergläser zusammen, und erhält etwa 300 ml fermentierte Flüssigkeit, deren proteolytische Aktivität duroh Einwirkung auf Casein nach dem Verfahren von Kunitz (Journ. Gen. Physiol. 30, 291, 1947) titriert wird, wobei die Reaktion durch einen Carbonatpuffer bei. einem pH-_: Wert von 10,5 während 10 min bei 40-..°C durchgeführt wird. Der gemessene Titer beträgt 40. Casein-proteolytisehe Einheiten/ml (angegeben entsprechend den internationalen Vereinbarungen), Die 300 ml, fermentierte Flüssigkeit werden bei eigenem pH-Wert 1 h lang zentrifugiert; l80 g Ammoniumsulfat und 500 mg , Caloluniazetat werden der erhaltenen klaren. Lösung zugesetzt, und es wird ,30 min lang geschüttelt,, und ansohlieiend 40 min lang zentrifugiert.. Dererhaltene Niederschlag wird abgetrennt, trockengeschleudert und unter Vakuum Vollständig getrooknet. Es werden 2,4 g eines Präparates erhalten, das 2 800 Caseln-

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- ίο -

proteölytisctie Einheiten/g zeigt.
XusfÜhrüngsbelspiel 2

Mit einer* Verkultur, die auf dem gleichen Nährboden* und "* unter den gleichen Bedingungen wie im' AusfÜnrurigsbeispiel 1 erhalten würäe, wird in einer Menge von δ", 5 Gewichtsprozent ein 20 ml-Fermentlergefäl geimpft/das 12 ί Nährboden 343 A ent-' hält. Man lält für 35 h bei 37 ⁰C unter Schütteln bei 500 Schüttelungen/min und bei einer Belüftung; von 0,5" 1 Luft/Ί ν min fermentieren. Am Ende der Fermentation zeigtder Nährboden 25 Casein^proteolytische Einheiten/ml. Er wird anschlielerid auf einen pH-Wert von "4,5 mit 20#iger Essigsäure gesäuert und lh lang zentrifugiert. Die auf der Oberfläche schwimmende Substanz wird auf einen pH-Wert vbii 11 mit Hilfe von 5 η-Soda eingestellt und rait Ammoniumsulfat in * einer Menge Von 2 000 g für 10 1 Nährbeden versetzt. Das Geraisch wird wieder 30 min lang geschüttelt und 4o min lang zentrifugiert. Der gesammelte Niederschlag wird bis zur Abtrennung der Ammoniurasulfatlösung .trockengescnleudert und.dann unter Vakuum vollständig getrocknet. Man erhält 35 g eines-Präparates mit 5 ÖOO Casein-proteolytlschen Einheiten/g.

Ausführungsbeispiel "5

Mit einer Vorkultur, die auf dem gleichen Nährboden und unter den gleichen Bedingungen wie im AußfÜhrungsbeispiel 1 erhalten wird, wird in einer Menge von 7*5 Volumenprozent der Vorkultur, bezogen auf das Volumen des erzeugenden Nährbodens, eine 2 000 !-küvette, die 600 1 erzeugenden Nährboden ' (Nährboden 342 A) enthält, geimpft. Man läit für etwa 30 h unter Sohütteln bei 270 Schüttelungen/iBin, einer Belüftung von 18 nr Luft/h und einer Temperatur von 37 ⁰C fersienti er en.

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- li -

Am Ende der Fermentation zeigt der Nährboden 34 Casein-proteoly-* tische Einheiten/ml. Er wird Jetzt auf einen pH-Wert von 4,5 duroh 20$ige Essigsäure gesäuert und filtriert. Das FiItrat wird auf einen pH-Wert von 11 duroh Soda eingestellt, und man setzt anschlielend 20 kg technisches Ammoniumsulfat einer Fraktion von 100 1 zu. Das Gemisch wird 30 min lang geschüttelt, und zentrifugiert. Der erhaltene Kuchen wird an Luft getrocknet und schwach erhitzt, Mein erhält 2,5 kg eines Präparates mit 7 100 Casein-proteolytischen Einheiten/g.

Ausführungsbeispiel 4

Mit einer Vorkultur, die auf dem gleichen Nährboden und unter den gleichen Bedingungen wie für das Ausführungsbeispiel 1 erhalten wird, impft man in einer Menge von 7*5 Volumenprozent der Vorkultur, bezogen auf das Volumen des erzeugenden Nährbodens, eine 3 000 1-Küvette, die 1 000 1 erzeugenden Nährboden 343 A enthält. Man läft die Fermentation JO h lang unter Sthütteln bei 270 SohÜttelungen/min und einer Belüftung von l8 nr Luft/h ablaufen, wobei die Temperatur 37 ⁰C beträgt. Am Ende der Fermentation zeigt der Nährboden etwa 40 Casein-preteolytische Einheiten/ml. Man säuert ihn bis auf einen pH-Wert von 4,5 mit Hilfe von 80^iger Essigsäure und filtert ihn. Man setzt dem FiItrat Ammoniumsulfat in einer Menge von 200 kg pro einer Fraktion von 1 000 1 FiItrat zu. Man schüttelt, und nach dem Auflösen stellt man den pH-Wert auf 8_a4 i 0,1 mit Hilfe von Natriuahydroxyd ein und schüttelt das Gemisch 1 h lang. Man zentrifugiert und sammelt den gebildeten Niederschlag, den man bei 50 ⁰C in einem Flleibett trocknet. Man erhält 4 kg eines Präparates, das 7 000 Caseinproteolytische Einheiten/g zeigt.

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Ausführungsbeispiel 5

Mit einer ersten Generation des Bacillus Subtilis nach Traoy, der wie zu Beginn des Ausführungsbeispiels 1 erläutert gewonnen wird, impft man mit Hilfe eines Platinbogens 55 ml eines Nährbodens, der folgende Zusammensetzung hat (im folgenden Nährboden 110 M genannt): Sojaölkuchenmehl: 30 g, Maisstärke: 10 g, Calciumcarbonate 5 g, Natriumchlorid: 1,6 g, Maismazerationsflüssigkeits 3 g* Speeköl: 2,5 St Wasser q.s. auf 1 1 Nährboden· Vor der Impfung ist der pH-Wert des Nährbodens auf 7,2 dureh Zusatz v©n In-Soda eingestellt und bei 121 ⁰C sterilisiert worden. Die 55 ml Nährboden, die in einem 500 ml-Beoherglas enthalten sind, werden anschlieiend auf einem Schwlngsohüttler geschüttelt (90 Sehwingungen/min, 10 cm Amplitude) und einer Inkubation von 21 h bei 28 ⁰C unterworfen. Man iapftschlieflich mit dieser Vorkultur in einer Menge von 0,1 Volumenprozent 60 1 Nährboden 110 M, die in einem 100 1-Fermentiergefäf enthalten sind. Man lift die Fermentation für 18 h bei 28 °C unter Sehütteln bei 400 Schüttelungen/min und einer Belüftung v©n 1 1 Luft/1 Nährboden »min ablaufen. Man erhält dadurch eine zweite Verkultür·

Mit der zweiten Vorkultur und in einer Menge v©n 10 prözent der Yorkultür werden 600 1 eines erzeugenden Nährbodens " geimpft, der sich in einem 1 000 1-Fermenti er ge fäÄ befindet und folgende Zusammensetzung hat: Sojaölkuehenaehl: 50 g, Maismazerationsflüssigkeit: 5 gi KartoffelBsehls 30 g, Matrium-. Chlorid: X₁ 6 g, CaIeiumcarbonat: 5 Ü» Wasser q. B, auf 1· 1 Nährboden ₀ Der pH-Wert dieses Nährbodens ist vorder Impfung auf 9 durch Zusatz normaler Soda eingestellt und sterilisiert Man läft die Fermentation 35 h- iaxig bei einer Temperatur 35 ^eC bei einem Schütteln τβη 250 Sohüttelungen/iüin und einer Belüftung Ton l8 vP Luft/h ablaufen. Am Ende der Ferfietitatien zeigt der Nährbeden etwa 35 Casein-preteolytisehe

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Man setzt jetzt dem Nährboden 80#ige Essigsäure bis zu einem pH-Wert von 6 zu, ansohlieSend 25#ige Schwefelsäure bis zu einem pH-Wert von etwa 4,4. Man filtert das Gemisch, wonach man den pH-Wert des Filtrats auf 11 mit 40$iger Soda einstellt. Man setzt 60 kg Ammoniumsulfat und 60 kg Natriumsulfat diesem Filtrat zu, das man auf einer Temperatur von 33 ⁰C unter langsamem Schütteln während 30 min hält, Jeweils bei Einstellung des pH-Wertes auf 8,5 - 0,3· Anschließend trennt man den gebildeten Niederschlag durch Abzentrifugieren ab, wonach er unter Vakuum bei 50 ⁰C getrocknet wird. Man erhält 3,2 kg eines Präparates, das 5 200 Casein-proteolytlsche Einheiten/g zeigt.

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Claims (2)

1. Patentansprüche

   f\J Verfahren zur Herstellung von Proteasen, die in einer alkalischen Umgebung aktiv sind, bei dem eine aerobe Fermentation eines Stamms des Bacillus Subtilis in einem Nährboden, der mindestens eine Quelle assimilierbaren Kohlenstoffs und eine Quelle assimilierbaren Stickstoffs sowie mineralische Bestandteile hat, bei einer Temperatur von 28 - 4o ⁰C durchgeführt wird, wonach die unlöslichen Bestandteile des Nährbodens abgetrennt werden und die kläre Flüssigkeit behandelt wird, um von ihr die Proteasen zu isolieren, d a d u r c h ge k en η ze i c h η et, daß der Stamm des Bacillus Subtilis nach Tracy ist, daß der pH-Wert des Nährbodens anfangs 7*5 9/5 beträgt, daß die Abtrennung der unlöslichen Bestandteile des Nährbodens durchgeführt wird, nachdem der Nährboden auf einen pH-Wert von etwa 4,5 durch Essig- und/oder Schwefelsäure gesäuert worden ist, und daß die Proteasen der klaren sauren,. Flüssigkeit durch Ausfällen mittels mineralischer Salze bei einem pH-Wert von mindestens 8,4 isoliert werden«
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch.gekennzeichnet, daß die Mineralsalze Alkalisulfate oder Ammoniumsulfate sind.

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   3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Nährbodens anfangs etwa 9 beträgt, daß die Säuerung auf einen pH-Wert von etwa 4,5 durch Zusatz von Essigsäure bis zu einem pH-Wert von 4,5 - 0,1 vorgenommen wird, und daß das ausfällende Mineralsalz Ammoniumsulfat ist, das in einer Menge von mindestens 100 g/l klarer Flüssigkeit zugesetzt wird.

   4, Proteasen, hergestellt durch ein Verfahren naoh einem der vorhergehenden Ansprüche.

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