DE2202220B2

DE2202220B2 - Biotechnisches Verfahren zur Her stellung einer Amylase

Info

Publication number: DE2202220B2
Application number: DE2202220A
Authority: DE
Inventors: Ernest Wendell Boyer; Morton Blakeman Ingle
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1971-03-12
Filing date: 1972-01-18
Publication date: 1973-09-27
Also published as: DE2202220A1; US4061541A

Description

Amylasen sind Enzyme, welche die Hydrolyse von Kohlenhydraten unter Bildung von Fragmenten, wie Glukose, Maltose, Maltotriose, katalysieren. Diese Amylasen sind geeignet zur Verflüssigung von Stärke und zur Entfernung von stärkehaltigen Verunreinigungen bzw. Flecken auf Stoffen und Kleidung. Bekannte Amylasen besitzen eine optimale Aktivität unter sauren Bedingungen, und diese Aktivität kann durch chelatbildende Mittel verschlechtert werden. Die Enzymaktivität derartiger bekannter Amylasen ist daher etwas vermindert, wenn sie zusammen mit chelatbildende Mittel enthaltenden Detergentien unter alkalischen Bedingungen verwendet werden.

Aus der deutschen Patentschrift 2 025 748 ist ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Amylasen bekannt, die auch unter alkalischen Bedingungen verwendet werden können. Diese Amylasen besitzen jedoch ihre maximale Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 7 (also im Sauren) und zeigen bei einem pH-Wert von 9 nur noch etwa 50°/₀ ihrer maximalen Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 7.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Amylase zu finden, die ihre maximale Aktivität unter alkalischen Bedingungen besitzt. Außerdem ist es wünschenswert, daß die Amylase unter alkalischen Bedingungen gegenüber chelatbildenden Mitteln unempfindlich ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Amylase, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie durch aerobes Züchten des Bacillus NRRL B-3881 in einem für die Herstellung von Amylase unter aerobem Züchten eines Bacillus üblichen Nährmedium und durch Abtrennung aus der Fermentationsbrühe erhalten worden ist. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung dieser Amylase durch aerobes Züchten eines Amylase bildenden Bacillus in einem hierfür üblichen Nährmedium und durch Abtrennung der Amylase aus der Fermentationsbrühe, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Bacillus NRRL B-3881 einsetzt.

Die erfindungsgemäß erhaltene Amylase behält nach einstündiger Behandlung bei 32°C und bei einem pH-Wert von 9,2 in Gegenwart von Äthylendiamintetraessigsäure oder von Natriumpyrophosphat die gesamte Aktivität (vgl. das Beispiel 1). Ferner stellt es einen entscheidenden Vorteil dar, wenn die Fermentation bereits nach 21 Stunden mit einem guten Ergebnis hinsichtlich der erhaltenen Amylase-Aktivitäten beendet werden kann (s. das Beispiel 1), und nicht bis 7 Tage, wie es in den Beispielen der deutschen Offenlegungsschrif12 025 748 der Fall ist, benötigt. Der erfindungsgemäß einzusetzende Mikroorganismus wurde nach dem bekannten Verfahren als ein Bacillus klassifiziert. Er fällt nicht unter die bekannten Arten, und es wird angenommen, daß er einen neuen Stamm innerhalb der Gruppe der Bacillen darstellt. Der spezielle Bacfllus-Stamm, der für die Herstellung der neuen Amylase eingesetzt wird, wurde aus

ίο dem getrockneten Schlamm einer Abwasseranlage isoliert. Eine Probe des Stamms wurde bei der Northern Utilization Research and Development Division, Agricultureal Research Service of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt

und erhielt die Nummer NRRL B-3881. Diese Kultur ist uneingeschränkt erhältlich.

Dieser Stamm besitzt die folgenden Eigenschaften:

Vegetative Stäbchen:

0,9 bis 1,0 μπι zu 3,0 bis 4,0 μπι; Enden abgerundet; normalerweise in Ketten (2 bis 6 pro Kette); nichtkettenförmig auf Sojabohnenagar; normalerweise aktiv beweglich (wahrscheinlich peritrichös flagelliert); grampositiv mit einer gramvariablen Form, die schmal, gedreht und gebogen ist, wenn sie bei einem pH-Wert unterhalb von 8,0 wächst;

Sporangien:
deutlich geschwollen; keulenförmig;

Sporen:

0,5 bis 0,8 μηι mal 1,0 bis 1.5 μπι; oval; terminal bis subterminal; brechend; gute Sporulation nur in alkalischem stärkehaltigem Medium;

Kapsel:

erstreckt sich 0,5 bis 0,9 μπι von der Zelloberfläche aus;

Kolonien:

dünn oder dick, je nach dem Medium; ausgebreitet; große Kolonien (1 cm) bei einem pH-Wert von 9,0 bis 10,0, sehr kleine Kolonien bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,0; undurchsichtig; ungeteilt.

Weitere Kennzeichen:

Trypton-Hefeextrakt-Dextrose-Agar, pH 7,0:
langsames Wachstum, kleine Kolonien.
Nährbrühe, pH 9: leichte bis mäßige Trübung, flockiges bis schleimiges Sediment.
Nährboden Agarschrägen mit 1,0 °/₀ Na₄P₂O₇ · 10H₂O: keine Sporulation, Kolonie glänzend, Form unregelmäßig, Erhöhung gewölbt, Rand gelappt.

Nährmedium Agarschrägen, pH 7,0: kein Wachstum.

Natriumchloridbrühe: wächst stark in der Lösung mit 12 % NaCl mit einer dicken Haut an der Oberfläche; wächst langsam in der Lösung mit 15% NaCl ohne Haut an der Oberfläche.
Sojabohnenagarschrägen: wächst stark, Zellen nicht kettenförmig, keine Sporulation.
Hydrolyse von Stärke: positiv, weiter Hydrolysebereich.

Erzeugung von Acetylmethylcarbinol: negativ bei 37°C.

pH-Wert der Glukosebrühe: anfangs pH 10, am Ende pH 8,98.

Hydrolyse von Gelatine: positiv, weiter Hydrolysebereich.

Hydrolyse von Kasein: schwache bis gar keine Hydrolyse.

Bildung von Indol: negativ.

Urease: negativ.

Reduktion von Nitrat zu Nitrit: negativ.

Reduktion von Methylenblau: positiv, reoxidiert in 5 bis 7 Tagen.

Fermentationscharakteristika bei pH 10,0

Kohlenhydrat

Glukose

Saccharose

Lactose

Maltose

Mannit

Arabinose

Xylose

Glwerin

Sorbit

Salicin

Vergleich

(kein Kohlehydrat)

Wachstum

1 +

2+ 3+

3 + 4-f 3 + 4+

4-r

2^

3 +

gering

Endfarbe des Mediums

klar

Dunkelgelbbraun

klar

Gelb

Helleelb

klar"

klar

Bei allen untersuchten Kohlenhydraten wurde Säure, aber kein Gas gebildet.

Der Bacillus NRRL B-3881 wird in gefrorener Lakmusmilch gehalten und kann in einem Medium wachsen, das geeignete Nährstoffe, wie Kohlenhydrate, Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält. Kohlenhydrate bzw. Kohlenhydratquellen sind Maisstärke, Dextrose, Stärkesirup, Lactose, Milchfeststoffe, Weizenkleie, Maltose und ähnliche Stoffe. Stickstoffquellen sind Sojamehl, ein Fermentpräparat mit guter proteolytischer Wirksamkeit, das üblicherweise als Nährstoff für Mikroorganismen verwendet wird (Trypton). Hefeextrakt, Fleischextrakt, Aminosäuren, Proteine, Ammoniumsulfat und ähnliche Stoffe. Anorganische Salze sind Calciumchlorid, Natriumphosphate, Kaliumphosphate, Magnesiumsulfat und ähnliche Stoffe.

Man läßt den Organismus unter submersen aeroben Bedingungen ungefähr 15 bis ungefähr 25 Std. bei einer Temperatur von ungefähr 25 bis 55⁰C wachsen. Die Wachstumstemperatur sollte ungefähr 35 bis ungefähr 40⁰C betragen. Der pH-Wert des Wachstumsmediums sollte einen Wert von ungefähr 8 bis ungefähr 10 und vorzugsweise von 8,5 bis 9,0 besitzen.

Die gewünschte erfindungsgemäße Amylase befindet sich in der Fermentationsbrühe außerhalb der Bakterienzellen, die während ihrer Bildung wachsen, und kann in flüssiger Form durch einfaches Abnitrieren der Bakterienzellen von der Fermentationsbrühe und Aufarbeiten des Filtrats gewonnen werden. Die erhaltene enzymhaltige Lösung kann nach bekannten Verfahren konzentriert werden, oder das Enzym kann nach ebenfalls bekannten Verfahren ausgefällt und in fester Form gewonnen werden.

Die Enzymaktivität der erfindungsgemäß hergestellten Amylase wurde auf folgende Weise bestimmt. Eine 2,4%ige Stärkelösung wurde hergestellt durch Vermischen von 13 g (Trockengewicht) löslicher Lintner-Stärke und 25 ml destilliertem Wasser. Dieses Gemisch wurde dann langsam zu 400 ml siedendem destilliertem Wasser zugegeben. Die entstehende Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit destilliertem Wasser auf 500 ml verdünnt. Gleiche Volumteile der oben angegebenen Stärkelösung und einer wäßrigen O.l-m-Glycinpufferlösung wurden dann zur Herstellung des Stärkesubstrats vermischt. Der pH-Wert des Gemisches wurde mit 5 n-Natriumhydroxid bei 50^cC auf 9,2 eingestellt. Eine verdünnte Salzsäurelösung wurde hergestellt durch Zugabe von einem ao Volumteil konzentriertem HCl zu ungefähr 90 Volurateilen destilliertem Wasser. Es wurde auf ein Gesamtvolumen von 100 Teilen mit destilliertem Wasser verdünnt. Eine Jodlösung wurde hergestellt durch Vermischen von 5 cm³ konzentriertem HCl, as 300 ein³ destilliertem Wasser und 10 cm³ einer Lösung, enthaltend 0,2% Jod und 2% Kaliumiodid und Verdünnen des gesamten Gemisches auf 500 cm³ mit destilliertem Wasser.

Zur Durchführung des Versuchs wurde ein Anteil von 5 cm³ der Stärkelösung in ein 25 χ 150 mm Reagensglas pipettiert. Das Reagensglas wurde verschlossen und 15 min auf 50°C erhitzt. Dann wurden 20 cm³ der verdünnten HCl-Lösung in ein anderes 25 χ 150mm Reagensglas gegeben und 10 cm³ der Jodlösung in ein drittes gleichgroßes Reagensglas. 1 ml der zu untersuchenden Enzymlösung wurde dann zu dem Stärkesubstrat zugegeben und unter Bildung einer enzymatischen Reaktionslösung vermischt. Nach 15 min wurde 1 cm³ dieser Lösung zu der verdünnten HCl-Lösung zugegeben und vermischt. 1 ml des entstehenden Gemisches wurde dann zu der Jodlösung zugegeben und wiederum vermischt. Nach 15 min wurde die optische Dichte des Gemisches mit einer Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 600 nm gemessen. Das Spektrophotometer wurde gegen destilliertes Wasser auf 0 eingestellt. Die Enzymkonzentration sollte so sein, daß die Änderung der optischen Dichte nicht mehr als 0,15 in 15 min beträgt. Eine Blindprobe wurde durchgeführt, indem man 5 cm³ Stärkesubstrat und 1 cm³ Enzymlösung zu 120 cm³ verdünnter HCl-Lösung zugab und vermischte. 1 ml dieser Reagenslösung wurde zu 10 cm³ der Jodlösung zugegeben. Nach 15 min wurde die optische Dichte der Blindprobe gemessen. Die Enzymaktivität in alkalischen Amylaseeinheiten pro cm³ Probe wird nach der folgenden Formel berechnet:

Aktivität (Einheiten/cm³) =

(ODBiinaprobe - OPprobe) (Verdünnung) IQ⁵ 15

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Dabei sind die Prozentangaben im allmeinen auf Gewicht pro Volumen bezogen.

Beispiel 1.

Ein wäßriges Impfmedium wurde hergestellt, enthaltend 0,5°/₀Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% Dextrose und 0,1% K₂HPO₄. 596 cm³ dieses Mediums wurden in jeden von vier Fernbach-Kolben gegeben und 20 min bei 121° C sterilisiert. Das Medium wurde abgekühlt, und 66 cm³ einer sterilen 10%igen Natriumsesquicarbonatlösung wurden zur Einstellung des pH-Wertes zugegeben. Jeder Kolben wurde dann mit 1 cm³ einer wieder aufgetauten

Lakmusmilchkultur von Bacillus NRRL B-3881 beimpft. Die Kolben wurden dann in eine Kreiselschüttelvorrichtung, die mit 200 UpM arbeitete gestellt und 18 Std. bei 39⁰C inkubiert. Die Kolbeninhalte wurden dann zum Beimpfen von 133 1 eines Fermentationsmediums verwendet, wobei die Konzentration des Impfmediums 2 Volumprozent betrug. Das weörige Fermentationsmedium enthielt 1,5 °/₀ teilweise hydrolysierten Stärkesirup, 2°/₀ Sojamehl, 0,1 % Calciumchlorid, 0,9% Na₄HPO₄, 0,1 % Antischaummittel und ic war 30 min bei 121°C sterilisiert und auf danach 36°C abgekühlt worden. Dieses Medium enthielt auch 1 °/₀ steriles Natriumbicarbonat, das unter aseptischen Bedingungen in einer 10°/_oigen Lösung zugegeben worden war, und ausreichend steriles 5 n-Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf 9,1 einzustellen. Das Fermentationsmedium wurde gerührt, und es wurde sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von 130 l/min durchgeleitet. Die Fermentation wurde nach 21 Std. abgebrochen. Die Bakterienzellen wurden von der Fermentationsbrühe abgetrennt, die 8000 Amylaseeinheiten pro cm³ enthielt. Der pH-Wert wurde mit verdünntem HCl auf 7,5 eingestellt, und es wurden geeignete Filterhilfen verwendet. Das entstehende Gemisch wurde mit Hilfe einer Vakuumfiltertrommel filtriert. Das Filtrat wurde dann durch Ultrafiltrationsverfahren ungefähr 25fach konzentriert, wobei ein Enzymkonzentrat entstand, das 90000 Amylaseeinheiten pro cm³ enthielt. Die erhaltene Amylase besaß eine maximale Aktivität bei einem pH-Wert von 9 bis 9,2 bei ungefähr 50° C. Im Gegensatz hierzu besaß eine typische bekannte Amylase, eine maximale Aktivität bei einem pH-Wert von 5,8 bis 6,5 und ungefähr 6O⁰C.

Die neue Amylase behielt ihre gesamte Aktivität, wenn sie 1 Std. bei 32° C und einem pH-Wert von 9,2 mit der chelatbildenden Äthylendiamintetraessigsäure oder mit Natriumpyrophospnat zusammengebracht wurde. Bekannte Amylasen verloren, wenn sie auf die gleiche Weise behandelt wurden, ungefähr die Hälfte ihrer Amylaseaktivität.

Die erfindungsgemäß erhaltene Amylase ist geeignet zur Erzeugung von maltosehaltigen Produkten aus Stärke, wie im folgenden Beispiel gezeigt wird. Sie scheint deshalb eine F.ndo-Amylase («-Amylase) zu sein.

Beispiel 2

Ein Teil der entsprechend Beispiel 1 hergestellten Amylase, enthaltend 90000 Amylaseeinheiten pro cm³, wurde im Verhältnis 1: 500 mit 0,05 m Glycinpufferlösung verdünnt. 80 ml der entstehenden Lösung wurden zu 250 cm³ einer wäßrigen Lösung, enthaltend 0,0909 °/₀ Amylase in 0,05 m Glycinpufferlösung mit einem pH-Wert von 9,2 bei 50⁰C, zugegeben. Nach 100 Std. bei 50° C waren 75,5 % der Amylose in Maltose und 4,6 °/_p der Amylose in Glukose umgewandelt worden. Es war auch eine kleine Menge Maltotriose entstanden. Die entsprechenden Analysen wurden nach bekannten Verfahren durchgeführt.

Claims

Patentansprüche:

1. Ämylase, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch aerobes Züchten des Bacillus NRRL B-3881 in einem für die Herstellung von Amylase unter aerobem Züchten eines Bacillus üblichen Nährmedium und durch Abtrennung aus der Fermentationsbrühe erhalten worden ist.

2. Verfahren zur Herstellung der Amylase nach Anspruch 1 durch aerobes Züchten eines Amylase bildenden Bacillus in einem hierfür üblichen Nährmedium und durch Abtrennung der Amylase aus der Fermentationsbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man den Bacillus NRRL B-3881 einsetzt.