DE2202220A1

DE2202220A1 - Amylase und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2202220A1
Application number: DE19722202220
Authority: DE
Inventors: Ingle Morton Blakeman; Boyer Ernest Wendell
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1971-03-12
Filing date: 1972-01-18
Publication date: 1972-09-28
Also published as: US4061541A; DE2202220B2

Description

Amylase- und Verfahren zu ihrer Herstellung

Eine neue Amylase mit einer optimalen Aktivität unter alkalischen Bedingungen, die in Gegenwart von chelatbildenden Mitteln stabil ist, kann hergestellt werden, indem man einen Bazillus der Art NRRL B-3881 oder dessen Mutanten unter aeroben Bedingungen in einem Medium wachsen läßt, das geeignete Nährstoffe enthält, und daraus das Enzym gewinnt.

Amylasen sind Enzyme, die die Hydrolyse von Kohlenhydraten unter Bildung kurzkettiger Fragmente, wie Glukose, Maltose, Maltotriose und ähnlichem,katalysieren können. Diese Amylasen sind geeignet zur Verflüssigung von Stärke und zur

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Entfernung von stärkehaltigen Verunreinigungen bzw. Flecken aus Stoffen und Kleidung. Die bekannten Amylasen besitzen eine optimale Aktivität unter sauren Bedingungen und diese Aktivität kann durch chelatbildende Mittel verschlechtert werden. Die Enzymaktivität derartiger bekannter Amylasen ist daher etwas vermindert, wenn sie zusammen mit Detergentien unter alkalischen Bedingungen verwendet werden.

Die Erfindung betrifft eine Amylase, die eine optimale Aktivität unter alkalischen Bedingungen besitzt und in Gegenwart von chelatbildenden Mitteln stabil ist. Diese Amylase kann hergestellt werden, indem man unter aeroben Bedingungen eine Kultur eines Bazillus der Art NRRL B-3381 oder dessen Mutanten in einem Mediuni, enthaltend geeignete Nährstoffe, wachsen läßt und dann das Enzym daraus gewinnt.

Der erfindungsgemäß anwendbare Organismus wurde nach dem bekannten Verfahren als ein Bazillus klassifiziert. Er fällt nicht unter bekannte Arten und es wird angenommen, daß er eine neue Spezies innerhalb der Gruppe der Bazillen darstellt.

Der spezielle Stamm der Bazillusart, der für die Herstellung der neuen Amylase geeignet ist, wurde aus dem getrockneten Schlamm einer Abwasseranlage isoliert. Eine Probe des Stamms wurde bei der Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und erhielt die Nummer NRRL B-3881. Diese Kultur ist uneingeschränkt erhältlich.

Dieser Stamm besitzt die folgenden Eigenschaften:

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Vegetative Stäbchen: 0,9 bis 1,0 ,um zu 3,0 bis 4,0

AM

Enden abgerundet; normalerweise in Ketten (2 bis 6 pro Kette); nichtkettenförmig auf Sojabohnenagar; normalerweise aktiv beweglich (wahrscheinlich peritrichös flagelliert); Gram, -positiv mit einer Gram -variablen Form, die schmal gedreht und gebogen ist, wenn sie bei einem pH-Wert unterhalb von 8,0 wächst;

Sporangien: Sporen:

deutlich geschwollen; keulenförmig;

0,5 bis 0,8 /Um mal 1,0 bis 1,5 /um oval; terminal bis subterminal; brechend; gute Sporulation nur in alkalischem stärkehaltigen Medium;

Kapsel:

erstreckt sich 0,5 bis 0,9 um von der Zelloberfläche aus;

Kolonien:

dünn oder dick, je nach dem Medium; ausgebreitet; große Kolonien (1 cm) bei einem pH-Wert von 9,0 bis 10,0, sehr kleine Kolonien bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,0; undurchsichtig; ungeteilt.

Weitere Kennzeichen:

Trypton-Hefe-Extrakt-Dextrose-Agar, pH 7,0: langsames Wachstum, kleine Kolonien.

Nährbrühe, pH 9: leichte bis mäßige Trübung, flockiges bis schleimiges Sediment.

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Närboden Agarschrägen mit 1,0 $ Na/P₂O₇ . 10 H₂O: keine Sporulation, Kolonie glänzend, Form unregelmäßig, Erhöhung gewölbt, Rand gelappt.

Nährmedium Agarschrägen, pH 7*0: kein Wachstum. Natriumchloridbrühe: wächst stark in 12-prozentigem NaGl mit einer dicken Haut an der Oberfläche, wächst langsam in 15-prozentigern NaCl ohne Haut an der Oberfläche. Sojabohnenagarschrägen: wächst stark,* Zellen nicht kettenförmig, keine Sporulation.

Hydrolyse von Stärke: positiv, weiter Hydrolysebereich. Erzeugung von Acetylmethylcarbinol: negativ bei 37°C pH-Wert der Glukosebrühe: anfangs pH 10, am Ende pH 8,98. Hydrolyse von Gelatine: positiv, weiter Hydrolysebereich. .Hydrolyse von Kasein: schwache bis gar keine Hydrolyse. Bildung von Indol: negativ.
Urease:negativ.

Reduktion von Nitrat zu Nitrit: negativ. Reduktion von Methylenblau: positiv, reoxidiert in 5 bis 7 Tagen.

Permentationscharakteristika bei pH 10,C Kohlenhydrat

Glukose Saccharose Lactose Haitose Mannit Arabinose Xylose Glycerin Sorbit Salicin Vergleich (kein Kohlehydrat) gering

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Wachstum	Endfarbe des Medi	- 5 -
1 +	klar
2 +	klar
3 +	dunkelgelbbraun
3+	dunkelgelbbraun
4+	klar
3 +	gelb
4+	gelb
4+	hellgelb
2+	klar
3+	klar
) gering	klar

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Bei allen untersuchten Kohlenhydraten wurde Säure, aber kein Gas gebildet.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich nicht nur auf die Verwendung von Bazillus NRRI B-3881, sondern auch auf die Verwendung von dessen natürlichen und künstlichen Mutanten. Derartige Mutanten können nach bekannten Verfahren, z.B. durch Röntgen- und Ultraviolettbestrahlung erzeugt werden.

Der Organismus von der Art Bazillus NRRL B-3881 wird in gefrorener Lakmusmilch gehalten und kann in einem Medium wachsen, das geeignete Nährstoffe, wie Kohlenhydrate, Stickstoff quellen und anorganische Salze, enthält. Typische Kohlenhydrate sind Maisstärke, Dextrose, Stärkesirup, Lactose, Milchfeststoffe, Weizenkleie, Maltose und ähnliches. Typische Stickstoffquellen sind Sojamehl, Trypton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Aminosäuren, Proteine, Ammoniumsulfat und ähnliches. Typische anorganische Salze sind Calciumchlorid, Natriumphosphate,Kaliumphosphate, Magnesiumsulfat und ähnliches. Diese Kohlenhydrate, Stickstoffquellen und anorganischen Salze sind bekannt.

Man läßt den Organismus vorzugsweise unter submer Ben aeroben Bedingungen ungefähr 15 bis ungefähr 25 h bei einer Temperatur von ungefähr 25 bis ungefähr 55⁰C wachsen. Die bevorzugte Wachstumstemperatur beträgt ungefähr 35 bis ungefähr 46°C. Der pH-Wert des Wachstumsmediums sollte von ungefähr 8 bis ungefähr 10 und vorzugsweise von 8,5 bis 9,0 liegen.

Die gewünschte erfindungsgemäße Amylase befindet sich in der Fermentationsbrühe außerhalb der Bakterienzellen, die

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während ihrer Bildung wachsen^ und kann in flüssiger Form durch einfaches Abfiltrieren der Bakterienzellen von der Permentationsbrühe .und Aufarbeiten des Piltrats gewonnen werden. Die erhaltene enzymhaltige Lösung kann nach bekannten Verfahren konzentriert werden oder das Enzym kann nach ebenfalls bekannten Verfahren ausgefällt und in fester Form gewonnen werden.

Die Enzymaktivität der erfindungsgemäß hergestellten Amyläse wurde auf folgende Weise bestimmt. Eine 2,4-prozentige Stärkelösung wurde hergestellt durch Vermischen von 13g (Trockengewicht) löslicher Lintner-Stärke und 25 ml destilliertem Wasser. Dieses Gemisch wurde dann langsam zu 400 ml siedendem destillierten Wasser zugegeben. Die entstehende Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit destilliertem Wasier/verdünnt. Gleiche .Volumenteile der oben angegebenen Stärkelösung und einer wäßrigen 0,1 m Glycinpufferlösung wurden dann zur Herstellung des Stärkesubstrats vermischt. Der pH-Wert des Gemisches wurde mit 5 η Natriumhydroxid bei 50⁰C auf 9,2 eingestellt. Eine verdünnte Salzsäurelösung wurde hergestellt durch Zugabe von einem Volumenteil konz. HCl zu ungefähr 90 Volumenteilen destilliertem Wasser. Es wurde auf ein Gesamtvolumen von 100 Teilen mit destilliertem Wasser verdünnt. Eine Jodlösung wurde hergestellt durch Vermischen von 5 cnr konz. HCl, 300 cm dest. Wasser und 10 cnr einer Lösung, enthaltend 0,2 io Jod und 2 # Kaliumiodid und Verdünnen des gesamten Gemisches auf 500 cm mit destilliertem Wasser.

Zur Durchführung des ^versuchs wurde ein Anteil von 5 cm des Stärkesubstrats in ein 25 * 150 mm Reagensglas pipettiert. Das Reagensglas wurde verschlossen und 15 min auf 50⁰C erhitzt. Dann wurden 20 ein der verdünnten HCl-Lösung

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in ein anderes 25 X 150 mm Reagensglas gegeben und 10 cm der Jodlösung in ein drittes gleichgroßes Reagensglas. 1 ml der zu untersuchenden Enzymlösung wurde dann zu dem Stärkesubstrat zugegeben und unter Bildung einer enzymatischen Reaktionslösung vermischt. Nach 15 min wurde 1 cnr dieser Lösung zu der verdünnten HCl-Lösung zugegeben und vermischt. 1 ml des entstehenden Gemisches wurde'dann zu der Jodlösung zugegeben und wiederum vermischt. Nach 15 niin wurde die optische Dichte des Gemisches mit einer Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 600 mn gemessen. Das Spektrophotometer wurde gegen destilliertes Wasser auf 0 eingestellt. Die Enzym- konzenträtion sollte so sein, daß die Änderung der optischen Dichte nicht mehr als 0,15 in 15 min beträgt. Eine Blindprobe

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wurde durchgeführt, indem man 5 cm Stärkesubstrat und 1 cnr Enzymlösung zu 120 cm verdünnter HCl-Lösung zugab und ver mischte. 1 ml dieser Reagenslösung wurde zu 10 cnr der Jodlösung zugegeben. Nach 15 min wurde die optische Dichte der Blindprobe gemessen. Die Enzymaktivität in alkalischen Amylaseeinheiten pro cnr Probe wird nach der folgenden Formel berechnet:

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Dabei sind die Prozentangaben im allgemeinen auf Gewicht pro Volumen bezogen.

Beispiel 1

Ein wäßriges Impfmedium wurde hergestellt, enthaltend 0,5 $> Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,1 $> Dextrose und 0,1 % K₂HPO.. 596 cm dieses Mediums wurden in jeden von vier Fernbach-Kolben gegeben und 20 min bei 121⁰C sterilisiert.

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ORIGINAL INSPECTED

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Das Medium wurde abgekühlt und 66 cnr einer sterilen 10-prozentigen Natriumsesouicarbonatlösung wurden zur Einstellung

3 des pH-Wertes zugegeben. Jeder Kolben wurde dann mit 1 cm einer wieder aufgetauten gefrorenen Lakmusmilchkultur von Bazillus NRRL B-3881 beimpft. Die Kolben wurde dann in eine Kreiseldchtittelvorrichtung, diejmit 200 UpM arbeitete, gestellt und 18 h bei 39°C inkubiert. Die Kolbeninhalte wurden dann zum Beimpfen von 133 1 eines Fermentationsmediums verwendet, wobei die Konzentration des Impfmediums 2 Vol7$ betrug. Das wäßrige Fermentationsmedium enthielt 1,5 % teilweise hydrolysierten Stärkesirup, 2 # Sojamehl, 0,1 # Calciumchlorid, 0,9 # Na₂HPO., 0,1 # Antischaummittel und war 30 min bei 121⁰C sterilisiert und auf 36°C abgekühlt worden. Dieses Medium enthielt auch 1 $ steriles Natriumbicarbonat, das unter aseptischen Bedingungen in einer 10-prozentigen Lösung zugegeben worden war, und ausreichend steriles 5 η Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf 9,1 einzustellen. Das Fermentationsmedium wurde, gerührt und es wurde sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von 130 l/min (4,6 SCFM) durchgeleitet. Die Fermentation wurde nach 21 h abgebrochen. Die Bakterienzellen wurden von der Fermentationsbrühe abgetrennt, die 8 000 Amylaseeinheiten pro cm enthielt. Der pH-Wert wurde mit verdünnter HCl auf 7,5 eingestellt und es wurden geeignete Filterhilfen verwendet. Das entstehende Gemisch wurde mit Hilfe einer Vakuumfiltertrommel filtriert. Das Filtrat wurde dann durch Ultrafiltrationsverfahren ungefähr 25-fach konzentriert, wobei ein Enzymkonzentrat entstand, das 90 000 Amylaseeinheiten pro cm enthielt.

Die entstehende neue Amylase besaß eine maximale Aktivität bei einem pH-Wert von 9 bis 9,2 bei ungefähr 50⁰C. Im Gegensatz hierzu besaß eine typische bekannte Amylase, eine maximale Aktivität bei einem pH-Wert von 5,8 bis 6,5 und unge-

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fähr 6O°C. Die neue Amylase behielt ihre gesamte Aktivität, wenn ele 1 h bei 32⁰C und einem pH-Wert von 9,2 mit chelat- bildenden Mitteln, wie Äthylendiamintetraessigsäure oder Natriumpyrophosphat, zusammengebracht wurde. Bekannte Amylasen verloren, wenn sie auf die gleiche Weise behandelt wurden, ungefähr die Hälfte ihrer Amylaseaktiyität.

Die neue erfindungsgemäße Amylase scheint eine Endo-Amylase (a-Amylase) zu sein und ist daher geeignet zur Erzeugung von maltosehaltigen Produkten aus Stärke. Da3 wird im folgenden Beispiel gezeigt.

Beispiel 2

Ein Teil der entsprechend Beispiel 1 hergestellten Amylase, enthaltend 90 000 Amylaseeinheiten pro cm , wurde 1 : 500 mit .0,05 m Glycinpufferlösung verdünnt und 80 ml der entstehenden Lösung wurden zu 250 cm einer wäßrigen Lösung, enthaltend 0,0909 # Amylose in 0,05 m Glycinpufferlösung mit einem pH-Wert von 9,2 bei 50⁰C, zugegeben. Nach 100 h bei 50⁰C waren 75,5 # der Amylose in Maltose und 4»6 der Amylose in Glykose umgewandelt worden. Es war auch eine kleine Menge Maltotriose entstanden. Die entsprechenden Analysen wurden nach bekannten Verfahren durchgeführt.

Patentansprüche

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Claims

DR. ING. F. WÜESTHOFF

DR. K. τ. PKCHMANN DR. ING. D. BEHRENS DIPL. ING. R. GOETZ

PATEN TANWlLTX

-JO -

S MÜNCHEN SCHWEIOERSTRASSE TKLItFOJf (0811) 66 30 TBLSZ 9 24 070 TKLKOKAUicx:

FBOTICTPATBKT

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Patentansprüche

(V> Amylase, die von einem Bazillus der Art NRRL B-3881 oder dessen Mutanten erhalten worden ist.
2. Verfahren zur Herstellung einer Amylase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man unter aeroben Bedingungen eine Kultur von Bazillus NRRL B-3881 oder dessen Mutanten in einem geeignete Nährstoffe enthaltenden Medium züchtet und das Enzym aus der Fermentationsbrühe gewinnt.

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