DE2157972A1

DE2157972A1 - Traegergebundene penicillinacylase

Info

Publication number: DE2157972A1
Application number: DE2157972A
Authority: DE
Inventors: Fritz Dr Hueper
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1971-11-23
Filing date: 1971-11-23
Publication date: 1973-05-24
Also published as: JPS4861687A; SU446971A3; EG10894A; IL40869A0; DE2157972B2; CH576483A5; AU4901572A; AR192509A1; DE2157972C3; PL79702B1; CA990667A; ES408861A1; IE36850B1; ZA728281B; IL40869A; DD100724A5; CS168616B2; IE36850L; SE7215202L; LU66507A1

Description

FARBENFABRIKEN BAYER AG LEVERKUSEN-Bayerwerk *■ *· NOV. 1971 Zentrilbereich Fttente, Mirken und Lizenzea

Si/Wk

Trägergebundene Penicillinacylase

Die Erfindung betrifft trägergebundene Penicillinacylase, die zur hydrolytischen Aufspaltung von Penicillinen zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure (6APS) verwendet wird.

Es ist bekannt, daß in einigen Arten von Mikroorganismen das Enzym Penicillinacylase (P.A.), (E,C. 3.5.LH) gebildet wird, dessen Einwirkung auf Penicilline, z.B. Penicillin G, zu einer hydrolytischen Aufspaltung der seitenständigen Carbonamidgruppierung führt, ohn· »in« gleichzeitige Öffnung des ß-Lactamringes zu bewirken. Auf der Wirkung dieses Enzyms beruht das Verfahren der deutschen Patentschrift 1 111 778 zur Herstellung yon 6APS aus Penicillin G. Bei der gegenwärtigen großtechnischen Produktion wird ein Bakterienschlamm, vorzugsweise von E.coli, eingesetzt.

Diese Methode hat folgende Nachteile:

a) Der Bakterienschlamm enthält außer der intracellulären P.A. weitere Proteine und Enzyme, sowie Bestandteile aus dem Nährmedium oder deren Umwandlungsprodukte, die bei

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der Fermentation entstanden sind. Diese Verunreinigungen lassen sich bei der Aufarbeitung nicht vollständig aus der kristallisierten 6-APS auswaschen.

b) der Bakterienschlamm kann beim technischen Prozeß nur einmal eingesetzt werden,

c) Der Bakterienschlamm enthält Verunreinigungen und andere Enzyme, die Penicillin G und/oder 6-APS durch öffnung des ß-Lactamringes inaktivieren.

d) Der Bakterienschlamm enthält nur kleine Mengen an P.A.. Der Einsatz von mehr Enzymmaterial, z.B. zur Erzielung kurzer Reaktionszeiten und damit besserer 6-APS-Ausbeuten bei geringerem Gehalt von Zersetzungsprodukten ist praktisch nicht möglich.

e) Die Ausbeuten an 6-APS hängen von der schwankenden P.A.Bildung in den jeweiligen Fermentationsansätzen ab.

f) Die vollständige Abtrennung der Bakterienzellen erfordert bei der Aufarbeitung der 6-APS-Ansätze einen zusätzlichen Arbeitsvorgang, der Ausbeuteeinbußen bedingt. Zur Entfernung von proteinartigen Verunreinigungen, die allergene Reaktionen hervorrufen können, sind weitere Reinigungsschritte nötig (Britisches Patent 1 169 696 J₁ 1 078 847; 1 114 311; dos 1 909 915).

Gegenstand der Erfindung ist nun eine trägergebunden« P.A., wobei als Träger Mischpolymerisate aus Acrylamid, N,N'-Methylenbisacrylamid und Maleinsäure in Frage kommen/ an die das Enzym kovalent gebunden ist.

Unlösliche, an Träger fixierte Proteine mit biologischer Aktivität wurden erstmalig im US-Patent 3 I67 485 beschrieben. Versuche, Penicillinacylase an einen polymeren Träger

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!covalent zu binden und für die Herstellung von 6-APS einzusetzen, sind bekannt (DOS 1 917 057, DOS 1 907 365, DOS 1 933 301). Diese bislang bekannten Methoden zur Herstellung von unlöslicher Penicillinacylase sind jedoch unbefriedigend, da das Enzym unter den Bedingungen·der Kupplung einen großen Teil der biologischen Aktivität verliert oder weniger als 50 % Protein überhaupt gebunden werden.

Ausbeuten von 50 - 60 % an trägergebundener Penicillinacylase lassen sich gemäß DOS 1 917 057 zwar erzielen, wenn als polymerer Träger ein lineares Äthylenmaleinsäureanhydrid-Polymeres (EMA-Harz) verwendet wird. Das verwendete Polymere ist jedoch sehr uneinheitlich und nach der Hydrolyse der Carbonsäureanhydridgruppen bei neutralem oder alkalischem pH-Wert wasserlöslich. Eret. durch die Bindung mit dem Enzym, anderen Di- oder Polyaminen, die als Comonomere an mehreren Stellen gebunden werden, wird es quervernetzt und dadurch wasserunlöslich. Die niedermolekularen und zum Teil wasserlöslichen Fraktionen lassen sich nicht trennen. Daher geht gebundenes Protein als lösliches Material verloren. Außerdem wird das EMA-Harz durch höhere Proteinkonzentrationen so stark vernetzt, daß .es.für das Substrat Penicillin nur teilweise zugänglich ist.

In den DOS 1 908 290 und 1 935 711 werden stark quellbare Mischpolymerisate aus Acrylamid, Maleinsäure, Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid beschrieben. Diese schwach vernetzten Polymerisate ermöglichen eine schonende Bindung des Proteins, so daß die Proteinstruktur und damit die enzymatisch^ Aktivität nach der Bindung erhalten bleibt. Die Aminogruppen von Enzymen reagieren mit den Anhydridgruppen des Polymerisates. Da aber sowohl durch Solvolyse als auch gleichzeitig mit der Carbonsäureamidbildung freie Carboxylgruppen entstehen, kann das Protein nicht nur kovalent, sondern auch heteropolar gebunden Le A 14 043 - 3 -

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werden. So werden in der DOS 1 935 711 Bedingungen angegeben, denen zu entnehmen ist, daß maximal 50 % Trypsin !covalent und 50 % heteropolar gebunden werden. Der heteropolar gebundene Anteil des Enzyms wird jedoch während der späteren Umsetzungen bei sich ändernden Salzkonzentrationen und pH-Werten abgelöst, mindert die Ausbeute an gebundenem Enzym und verunreinigt das Produkt.

Erfindungsgemäß ist es möglich, die genannten Nachteile zu vermeiden, weil an die Mischpolymerisate gemäß unserer Erfindung bis zu 98 % Penicillinacylase kovalent gebunden werden können.

Die erfindungsgemäße, kovalent an den Träger gebundene Penicillinacylase kann in einem großtechnischen Prozeß zur enzymatischen Spaltung von Penicillin eingesetzt werden. Sie läßt sich nach jedem Einsatz durch Filtration oder Zentrifugation leicht zurückgewinnen und kann erneut verwendet werden.

Die Herstellung des erfindungsgemäß benutzten Mischpolymerisates erfolgt nach an sich bekannten Methoden. Nach der Mischpolymerisation wird das gelartige Harz durch ein Sieb mit 0,5 mm Maschenweite gedrückt, gut gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die einpolymerisierte Dicarbonsäure wird durch 2-stündiges Erhitzen auf l80° C in das Dicarbonsäureanhydrid überführt. Länger als 2 Stunden sollte nicht auf 180° C erhitzt werden, da hierdurch die Bindungskapazität des Mischpolymerisates deutlich abnimmt.

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Die Proteinbindungskapazität des Mischpolymerisates ist abhängig von der Zahl der vorhandenen Anhydridgruppen und von der Porengröße. Bei einem enger vernetzten Produkt ist die Bindungskapazität geringer als bei einem weniger eng vernetzten Polymeren. Durch geringere Vernetzung steigt aber . die Quellfähigkeit des Polymerisates, dabei nimmt gleichzeitig die Abriebfestigkeit ab.

Für die kovalente Bindung der Penicillinacylase wurde vorzugsweise ein Polymerisat aus 45 Teilen Acrylamid, 3 Teilen N,N'-Methylenbisacrylamid und 15 Teilen Maleinsäure hergestellt. Die Aminogruppen der Penicillinacylase reagieren mit den Anhydridgruppen des Polymerisat.es bei pH-Werten von 5,0 bis 6,5, vorzugsweise bei pH 5»8. Da durch Solvolyse der cyclischen Anhydridgruppen ein schwach saurer Kationenaustauscher entsteht, nimmt der pH-Wert der Reaktionsmischung langsam ab, wenn nicht laufend verdünnte Alkalilösung zum Reaktionsgemisch gegeben wird. Die Verwendung eines pH-Staten ist vorteilhaft. Die speziellen Reaktionsbedingungen sind für die Ausbeute an gebundener Penicillinacylase von großer Bedeutung. Die Ausbeute ist streng pH-abhängig. So werden bei pH 5,8 98 %_t bei pH 6,5 45 % und' bei pH 4,5 riur 22 % gebunden.

Die Reaktionstemperatur ist ebenfalls von Bedeutung. Sie sollte möglichst niedrig sein. Bei höheren Temperaturen verläuft die Hydrolyse der cyclischen Anhydridgruppen schneller als die Ammonolyse. Vorzugsweise wird bei +4° C gearbeitet.

Die Kupplung ist außerdem abhängig von der Ionenstärke, sie wird bevorzugt in Pufferlösung mit geringer Ionenstärke durchgeführt. Bei hohen Pufferkonzentrationen schrumpft das

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'Polymerisat, so daß das Enzym langsamer in die Matrix des Polymeren eindringen und reagieren kann, Vorzugsweise verwendet man 0,05 m Phosphatpuffer. Nach der Kupplung wird die trägergebundene Penicillxnacylase abfiltriert und intensiv mit Wasser und 1 m Kochsalzlösung gewaschen."

Pro g Enzym werden mindestens 10 g Mischpolymeres eingesetzt. Davon gibt man etwa 3 - 4 g zu der Lösung des Enzyms in 250 ml 0,05 m Phosphatpuffer pH 5,5, rührt intensivund fügt nach 2 Stunden das restliche Mischpolymerisat in kleinen Anteilen zu. Der pH-Wert wird während der gesamten Reaktions zeit durch Zugabe von verdünnter Natronlauge konstant gehalten. Wenn der wäßrige überstand nach 5 Stunden noch nicht umgesetztes Enzym enthält, wird weiteres Mischpolymerisat zugegeben. Ein Verhältnis von 1 Teil Enzym zu 15 - 20 Teilen Mischpolymerisat ist im allgemeinen für eine vollständige Umsetzung ausreichend.

Die erfindungsgemäße trägergebundene Penicillinacylase läßt sich ohne Verlust an enzymatischer Wirksamkeit lagern.

Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der trägergebundenen Penicillinacylase wird eine Lösung mit 30 000 E/ml Penicillin G-Kalium bei 37° C inkubiert. Die freigesetzte Phenylessigsäure wird bei konstant gehaltenem pH-Wert von

7,8 mit n/10 Natronlauge titriert. Eine Enzym-Einheit ist die Aktivität, die unter diesen Bedingungen pro Min l.uMol Penicillin G zu 6-APS und Phenylessigsäure spaltet und dabei Natronlauge verbraucht.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

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Beispiel 1

Herstellung des Mischpolymerisates:

a) 4 50 g Acrylamid, 22,5 g N,N'-Methylenbisacrylamid und

150 g Maleinsäure werden in 3500 ml 0,05 m-Phosphatpuffer, pH 7,6, gelöst und unter N -Schutzgas mit 15O ml 5 #iger wäßriger Propionsäurenitril-Lösung und I50 ml 5 %iger Ammoniumperoxydisulfatlösung versetzt. Das Reaktionsgemisch wird auf 80° C erwärmt, dann 15 Stunden bei Raumtemperatur gehalten und durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,5 mm gedrückt. Nach sorgfältigem Waschen mit Wasser wird das Polymerisat gefriergetrocknet und im Vakuum bei 20 Torr 2 Stunden auf l80° C erhitzt.

Nach Beispiel la) lassen sich weitere Mischpolymerisate herstellen, z.B. aus:

b) 450· g Acrylamid '

30 g N₃N'-Methylenbisacrylamid und 150 g Maleinsäure

c) 45O g Acrylamid

45 g N,N'-Methylenbisacrylamid und 150 g Maleinsäure

d) 45Og Acrylamid -"

45 g N,N'-Methylenbisacrylamid und 75g Maleinsäure

e) 450 g Acrylamid

135 g N,N'-Methylenbisacrylamid und 150 g Maleinsäure

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Die Polymerisate werden wie im Beispiel la) angegeben weiterverarbeitet.

Beispiel 2

Trägergebundene Penicilli-nacylase;

a) 1,0 g Penicillinacylase mit einer spezifischen enzymatischen Aktivität von 15 E/mg wird in 200 ml 0,05 m-Puffer pH 5,8 gelöst und bei 4° C unter Rührung im Verlauf von 5 Stunden mit kleinen Anteilen von insgesamt 15 g Mischpolymerisat versetzt, das nach Beispiel la) hergestellt wurde. Der pH-Wert wird mit verdünnter NaOH konstant bei 5*8 gehalten. Nach 24 Stunden bei 4 C filtriert man ab und wäscht mit 300 ml Wasser nach. Das feuchte trägergebundene Enzym (300 g gequollen) hat eine spezifische Aktivität von 0,049 E/mg. Ausbeute an kovalent gebundener Penicillinacylase 98 %. - ..

b) Man läßt 15 g des nach Beispiel Ib) hergestellten Mischpolymerisates wie im Beispiel 2a) ,beschrieben mi-t 1 g Penicillinacylase'(15 E/mg) reagieren, Ausbeute 290 g feuchtes, trägergebundenes Enzym mit einer Aktivität von 0,044 E/mg. Ausbeute an kovalent gebundener Penicillinacylase 85 %.

c) Man läßt 15 g des nach. Beispiel Ic) hergestellten Mischpolymerisates wie im Beispiel 2a) beschrieben mit 1 g Penicillinacylase (15 E/mg) reagieren, Ausbeute 295 g feuchtes, trägergebundenes Enzym mit einer Aktivität von O₃039 E/mg. Ausbeute an kovalent gebundener Penicillinacylase 77 %.

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d) Man läßt 15 g des nach Beispiel ld) hergestellten Misch- ' polymerisates wie im Beispiel 2a) beschrieben mit Ig Penicillinacylase (15 E/mg) reagieren, Ausbeute 280 g feuchtes, trägergebundenes Enzym mit einer Aktivität von 0,041 E/mg. Ausbeute an kovalent gebundener Penicillinacylase 76,5 ί. . '

e) Man läßt 15 g des nach Beispiel Ie) hergestellten Mischpolymerisates wie im Beispiel 2a) beschrieben mit 1 g Penicillinacylase (15 E/mg) reagieren, Ausbeute 65 g feuchtes, trägergebundenes Enzym mit einer Aktivität von 0,146 E/mg. Ausbeute an kovalent gebundener Penicillinacylase 63 %.

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INSPECTED

Claims

Patentansprüche:

1) Trägergebundene Penicillinacylase.

2) Penicillinacylase, die an ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, N,N'-Methylenbisacrylamid und Maleinsäure kovalent gebunden ist. .

3) Verfahren zur Herstellung von kovalent an Träger gebundener Penicillinacylase, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, N,N'-Methylenbisacrylamid und Maleinsäure durch Erhitzen im Vakuum in das Anhydrid überführt und .dieses bei pH 5 - 6,5 und Temperaturen unter 20° C mehrere Stunden mit einer wäßrigen Lösung von Penicillinacylase in Berührung bringt.

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