DE2157972B2

DE2157972B2 - Tragergebundene Penicillinacylase

Info

Publication number: DE2157972B2
Application number: DE2157972A
Authority: DE
Inventors: Fritz Dr. 5600 Wuppertal Hueper
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1971-11-23
Filing date: 1971-11-23
Publication date: 1979-01-18
Also published as: CH576483A5; EG10894A; FR2161022B1; IL40869A0; AT319470B; CS168616B2; JPS4861687A; DE2157972A1; DE2157972C3; SE7215202L; GB1387459A; FR2161022A1; HU167703B; IL40869A; ZA728281B; AU4901572A; IE36850L; SU446971A3; LU66507A1; ES408861A1

Description

Es ist bekannt, daß in einigen Arten von Mikroorga- >i> nismen das Enzym Penicillinacylase (P.A.), (E. C. 3.5.1.11) gebildet wird, dessen Einwirkung auf Penicilline, z. B. Penicillin G, zu einer hydrolytischen Aufspaltung der seitenständigen Carbonamidgruppierung führt, ohne eine gleichzeitige öffnung des /3-Lactamringes zu _>■> bewirken. Auf der Wirkung dieses Enzyms beruht das Verfahren der deutschen Patentschrift 1111 778 zur Herstellung von 6-APS aus Penicillin d. Bei der gegenwärtigen großtechnischen Produktion wird ein Bakterienschlamm, vorzugsweise von E. coli, eingesetzt, w Diese Methode hat folgende Nachteile:

a) Der Bakterienschlamm enthält außer der intracellulären P. A. weitere Proteine und Enzyme, sowie Bestandteile aus dem Nährmedium oder deren Umwandlungsprodukte, die bei der Fermentation entstanden sind. Diese Verunreinigungen lassen sich bei der Aufarbeitung nicht vollständig aus der kristallisierten 6-APS auswaschen.

b) Der Baktericnschlamni kann beim technischen Prozeß nur einmal eingesetzt werden.

c) Der Baktcrienschlamm enthält Verunreinigungen und andere Enzyme, die Penicillin G und/oder 6-APS durch öffnung des ß-Lactamringes inaktivieren.

d) Der Baktericnschlamm enthält nur kleine Mengen an P. A. Der Einsatz von mehr Enzymmaterial, z. B. zur Erzielung kurzer Reaktionszeiten und damit besserer 6-APS-Ausbeuten bei geringerem Gehalt von Zersetzungsprodukten ist praktisch nicht möglich.

e) Die Ausbeuten an 6-APS hängen von der schwankenden P. A.-Bildung in den jeweiligen Fermentationsansätzen ab.

f) Die vollständige Abtrennung der Bakterienzcllen erfordert bei der Aufarbeitung der 6-APS-Ansätzc einen zusätzlichen Arbeitsvorgang, der Ausbeulecinbußen bedingt. Zur Entfernung von proteinartigen Verunreinigungen, die allergene Reaktionen hervorrufen können, sind weitere Reinigungsschritte nötig (Britisches Patent 1169 696; 10 78847;' 11 14311;DE-OS 1909915).

Die Erfindung betrifft die in den 2 Ansprüchen definierten Gegenstände.

Unlösliche, an Träger fixierte Proteine mit biologischer Aktivität wurden erstmalig im US-Patent 67 485 beschrieben. Versuche, Penicillinacylase an einen polymeren Träger kovalent zu binden und für die Herstelluitg von 6-APS einzusetzen, sind bekannt (DE-OS 19 17 057, 19 07 365, 19 33 301). Diese bislang bekannten Methoden zur Herstellung von unlöslicher Penicillinacylase sind jedoch unbefriedigend, da das Enzym unter den Bedingungen der Kupplung einen großen Teil der biologischen Aktivität verliert oder weniger als 50% Protein überhaupt gebunden werden.

Ausbeuten von 50—60% an trägergebundener Penicillinacylase lassen sich gemäß DE-OS 19 17 057 zwar erzielen, wenn als polymerer Träger ein lineares Äthylenmaleinsäureanhydrid-Polymeres (EMA-Harz) verwendet wird. Das verwendete Polymere ist jedoch sehr uneinheitlich und nach der Hydrolyse der Carbonsäureanhydridgruppen bei neutralem oder alkalischem pH-Wert wasserlöslich. Erst durch die Bindung mit dem Enzym, anderen Di- oder Polyaminen, die als Comonomere an mehreren Stellen gebunden werden, wird es quervernetzt und dadurch wasserunlöslich. Die niedermolekularen und zum Teil wasserlöslichen Frak- üonen lassen sich nicht trennen. Dahergeht gebundenes Protein als lösliches Material verloren. Außerdem wird das EMA-Harz durch höhere Proteinkonzentrationen so stark vernetzt, daß es für das Substrat Penicillin nur teilweise zugänglich ist.

In den DE-OS 19 08 290 und 19 35 711 werden stark quellhare Mischpolymerisate aus Acrylamid, Maleinsäure, Ν,Ν'-Melhylenbisacrylamid beschrieben. Diese schwach vernetzten Polymerisate ermöglichen eine schonende Bindung des Proteins, so daß die Proteinstruktur und damit die enzymatische Aktivität nach der Bindung erhalten bleibt. Die Aminogruppen von Enzymen reagieren mit den Anhydridgruppen des Polymerisates. Da aber sowohl durch Solvolyse als auch gleichzeitig mit der Carbonsäureamidbildung freie Carboxylgruppen entstehen, kann das Protein nicht nur kovalent, sondern auch heteropolar gebunden werden. So werden in der DE-OS 19 35 711 Bedingungen ungegeben, denen zu entnehmen ist, daß maximal 50% Trypsin kovalent und 50% heteropolar gebunden werden. Der heteropolar gebundene Anteil des Enzyms wird jedoch während der späteren Umsetzungen bei sich ändernden Salzkonzentrationcn und pH-Werten abgelöst, mindert die Ausbeute an gebundenem Enzym und verunreinigt das Produkt.

Erfindungsgemäß ist es möglich, die genannten Nachteile zu vermeiden, weil an die Mischpolymerisate gemäß unserer Erfindung bis zu 98% Penicillinacylase kovalent gebunden werden können.

Die erfindungsgemäßc. kovalcnl an den Träger gebundene Penicillinacylase kann in einem großtechnischen Prozeß zur cnzymatischen Spaltung von Penicillin eingesetzt werden. Sie läßt sich nach jedem Einsatz durch F'iltration oder Zcntrifugation leicht zurückgewinnen und kann erneut verwendet werden.

Die Herstellung des erfindungsgemäß benutzten Mischpolymerisates erfolgt nach an sich bekannten Methoden. Nach der Mischpolymerisation wird das gelartigc Harz durch ein Sieb mit 0,5 mm Maschenweite gedrückt, gut gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die einpolymerisierte Dicarbonsäure wird durch 2stündiges Erhitzen auf 180"C in das Dicarbonsäureanhydrid überführt. Länger als 2 Stunden sollte nicht auf 180°C erhitzt werden, da hierdurch die Bindungskapazität des Mischpolymerisates deutlich abnimmt.

Die Proteinbindungskapazität des Mischpolymerisates ist abhängig von der Zahl der vorhandenen Anhydridgruppen und von der Porengröße. Bei einem enger vernetzten Produkt ist die Bindungskapazität

geringer als bei einem weniger eng vernetzten Polymeren. Durch geringere Vernetzung steigt aber die Quellfähigkeit des Polymerisates, dabei nimmt gleichzeitig die Abriebfestigkeit ab.

Für die kovalente Bindung der Peniciilinacylase kann ein Polymerisat aus 45 Teilen Acrylamid, 3 Teilen Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und 15 Teilen Maleinsäure hergestellt werden. Die Aminogruppen der Peniciilinacylase reagieren mit den Anhydridgruppen des Polymerisates bei pH-Werten von 5,0 bis 6,5, z. B. bei pH 5,8. Da durch Solvolyse der cyclischen Anhydridgri'.ppen ein schwach saurer Kationenaustauscher entsteht, nimmt der pH-Wert der Reaktionsmischung langsam ab, wenn nicht laufend verdünnte Alkalilösung zum Reaktionsgemisch gegeben wird. Die Verwendung eines pH-Staten ist vorteilhaft. Die speziellen Reakiionsbedingungen sind für die Ausbeute an gebundener Peniciilinacylase von großer Bedeutung. Die Ausbeute ist streng pH-abhängig. So werden bei pH 5,8 98%, bei pH 6,545% und bei pH 4,5 nur 22% gebunden.

Die Reaktionsiemperatur ist ebenfalls von Bedeutung. Sie sollte möglichst niedrig sein. Bei höheren Temperaturen verläuft die Hydrolyse der cyclischen Anhydridgruppen schneller als die Ammonolyse. Zweckmäßig wird bei + 4"C gearbeitet.

Die Kupplung ist außerdem abhängig von der lonenstärke, sie kann in Pufferlösung mit geringer lonenstärke durchgeführt werden. Bei hohen Pufferkonzentrationen schrumpft das Polymerisat so daß das Enzym langsamer in die Matrix des Polymeren eindringen und reagieren kann. Zweckmäßig verwendet man 0,05 m Phosphatpuffer. Nach der Kupplung wird die trägergebundene Peniciilinacylase abfiltriert und intensiv mit Wasser und 1 ni Kochsalzlösung gewaschen.

Pro g Enzym werden mindestens 10 g Mischpolymeres eingesetzt. Davon gibt man etwa 3—4 g zu der Lösung des Enzyms in 250 ml 0,05 m Phosphalpuffer pi I 5,5, rührt intensiv und fügt nach 2 Stunden das restliche Mischpolymerisat in kleinen Anteilen zu. Der pH-Wert wird während der gesamten Reaktionszeit durch Zugabc von verdünnter Natronlauge konstant gehalten. Wenn der wäßrige Überstand nach 5 Stunden noch nicht umgesetztes Enzym enthält, wird weiteres Mischpolymerisat zugegeben. Ein Verhältnis von I Teil Enzym zu 15—20 Teilen Mischpolymerisat ist im allgemeinen für eine vollständige Umsetzung ausreichend.

Die erfindungsgemäß trägergebundene Peniciilinacylase läßt sich ohne Verlust an en/.ymatischcr Wirksamkeit lagern.

Zur Bestimmung der cn/.ymalischcn Aktivität der trägergebundenen Peniciilinacylase wird cine Lösung mit 30 000 E/ml Penicillin G-Kalium bei 37"C inkubiert. Die freigesetzte Phenylessigsäure wird bei konstant gehaltenem pH-Wert von 7,8 mit n/10 Natronlauge titriert. Eine Enzym-Einheit ist die Aktivität, die unter diesen Bedingungen pro Min. 1 μΜοΙ Penicillin G zu 6-APS und Phenylessigsäure spaltet und dabei 1 μΜοΙ Natronlauge verbraucht.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

Beispiel
I. Herstellung des Mischpolymerisates

a) 450 g Acrylamid, 22,5 g Ν,Ν'-Melhylenbisacrylamid und 150 g Maleinsäure werden in 3500 ml 0,05 m-Phosphatpuffer, pH 7,6, gelöst und unter N2-Schutzgas mit 150 ml 5°/oiger wäßriger Propionsäurenitril-Lösung und 150 ml J%iger Ammoniumperoxydisulfatlösung versetzt. Das Reaktionsgemisch wird auf 80°C erwärmt, dann 15 Stunden bei Raumtemperatur gehalten und durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,5 mm gedrückt. Nach sorgfältigem Waschen mit Wasser wird das Polymerisat gefriergetrocknet und im Vakuum bei 20 Torr 2 Stunden auf 180⁰C erhitzt. Nach Beispiel la) lassen sich weitere Mischpolymerisate herstellen, z. B. aus:

b) 450 g Acrylamid

30 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und .15Og Maleinsäure

c) 450 g Acrylamid

45 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und 150 g Maleinsäure

d) 450 g Acrylamid

45 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und 75 g Maleinsäure

e) 450 g Acrylamid

135 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und 150 g Maleinsäure

wie im Beispiel la)

Die Polymerisate werden
angegeben, weitcrvcrarbeitet.

11. Trägergebundene Peniciilinacylase

a) 1,0 g Peniciilinacylase mit einer spezifischen enzymatischcn Aktivität von 15 E/mg wird in 200 ml O,O5m-Pufrcr pH 5,8 gelöst und bei 4"C unter Rührung im Verlauf von 5 Stunden mit kleinen Anteilen von insgesamt 15 g Mischpolymerisat versetzt, das nach la) hergestellt wurde. Der pH-Wert wird mit verdünnter NaOIl konstant bei 5,8 gehalten. Nach 24 Stunden bei 4"C filtriert man ab und wäscht mit 300 ml Wasser nach. Das feuchte trägergebundene Enzym (300 g gequollen) hai eine spezifische Aktivität von 0.049 E/mg. Ausbeule an kovalent gebundener Peniciilinacylase 98%.

b) Man läßt 15 g des nach Ib) hergestellten Misch-Polymerisales wie in Ha) beschrieben mit I g Peniciilinacylase (15 E/mg) reagieren, Ausbeute 290 g feuchtes, trägergebundenes Enzym mit einer Aktivität von 0,044 E/mg. Ausbeute an kovalent gebundener Peniciilinacylase 85%.

c) Man läßt 15 g des nach Ic) hergestellten Mischpolymerisates wie in Ma) beschrieben mit I g Peniciilinacylase (15 E/mg) reagieren, Ausbeute 295 g feuchtes, trägergebundenes Enzym mit einer Aktivität von 0,039 E/mg. Ausbeute an kovalent gebundener Peniciilinacylase 77%.

d) Man läßt 15 g des nach Id) hergestellten Mischpolymerisates wie in Ha) beschrieben mit 1 g Peniciilinacylase (15 E/mg) reagieren, Ausbeute g feuchtes, trägergebundenes Enzym mit einer Aktivität von 0,041 E/mg. Ausbeute an kovalent gebundener Peniciilinacylase 76,5%.

e) Man läßt 15 g des nach Ic) hergestellten Mischpolymerisates wie in Ha) beschrieben mil I g Peniciilinacylase (15 E/mg) reagieren, Ausbeute g feuchtes, trägergebundenes Enzym mit einer Aktivität von 0,146 E/mg. Ausbeute an kovalent gebundener Peniciilinacylase 63%.

Claims

Patentansprüche:

1. Penicillinacylase, die an ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, N,N'-vlethylenbisacrylamid und "> Maieinsäure kovalent gebunden ist.

2. Verfahren zur Herstellung von kovalent an Träger gebundener Penicillinacylase gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, Ν,Ν'-Methylenbis- nt acrylamid und Maleinsäure durch Erhitzen im Vakuum in das Anhydrid überführt und dieses bei pH 5—6,5 und Temperaturen unter 20⁰C mehrere Stunden mit einer wäßrigen Lösung von Penicillinacylase in Berührung bringt. ι -.