DE2423059C3 - Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit enzymatischer Aktivität - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit enzymatischer AktivitätInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit enzymatischer Aktivität.
Enzymatische Reaktionen werden üblicherweise mit Hilfe ein oder mehrerer Enzyme ausgeführt, welche in
dem Medium gelöst sind, das den Stoff enthält, welcher der Einv/irkung des Enzyms unterworfen werden soll.
Dieser Stoff wird als »Substrat« bezeichnet. Wenn das Enzym im Reaktionsmedium gelöst ist, dann kann es
vom Substrat nur mehr sehr schwierig getrennt werden. Es ist im allgemeinen nötig, das Enzym zum Anhalten
der Reaktion zu inaktivieren, wie z. B. durch Erhitzen. Infolgedessen ist das Enzym nicht mehr verwendbar.
Um diese Schwierigkeiten zu beseitigen sind zahlreiche Verfahren zur Herstellung von Produkten mit
enzymatischer Aktivität, welche in wäßrigem Medium unlöslich sind, ausgearbeitet worden. Die enzymatischen
Reaktionen, die mit Hilfe dieser Produkte durchgeführt werden, können entweder mittels Durchleiten des
Substrats durch eine mit dem unlöslichen Produkte gefüllte Kolonne oder durch Verteilen des Produkts in
der das Substrat enthaltenden Lösung und mechanische Abtrennung des unlöslichen Produkts durchgeführt
werden. In allen Fällen ist das unlösliche Produkt mit enzymatischer Aktivität leicht zurückgewinnbar und,
zumindest theoretisch, unbegrenzt wiederverwendbar. Ein solches Produkt ist aus der DT-AS 22 15 160
bekannt. Der Träger besteht dabei aus einem unlöslichen oxydierten Polysaccharid, an welches das Enzym
über Aldehydgruppen gebunden ist.
Die Verwendung dieser unlöslichen Produkte mit enzymatischer Aktivität läßt sich aber nicht ohne starke
Einschränkungen durchführen. Die gute Durchführung einer chemischen Reaktion, insbesondere einer enzymatischen Reaktion, erfordert es, daß eine Anzahl von
Bedingungen eingehalten werden.
Die erste Bedingung ist, daß die Reaktionsteilnehmer
sich leicht begegnen können, d. h. im vorliegenden Fall,
daß das Substrat einen leichten Zugang zum unlöslichen
Produkt mit enzymatischer Aktivität und insbesondere zum aktiven Zeitraum desselben haben muß. Es muß
also eine gute physico-chemische Affinität der beiden S betreffenden Spezies, eine um das aktive Zentrum
verringerte sterische Hinderung und gleichzeitig eine gewisse Flexibilität des Produkts mit enzymatischer
Aktivität vorhanden sein. Wenn diese erste Bedingung einer »guten Begegnungsmöglichkeit« erfüllt ist, dann
ίο ist es noch erforderlich, daß die Geschwindigkeit des
Austausches zwischen Enzym und Substrat ausreichend ist, so daß ein rasches Abwandern eines Substratmoleküls, das bereits reagiert hat, und sein augenblicklicher
Ersatz durch ein Molekül, das noch nicht reagiert hat,
sichergestellt wird.
Die Umstände der Reaktion zwischen Substrat und unlöslichem Produkt mit enzymatischer AkuVvät sind
im allgemeinen ungünstig. Die Zugänglichkeit und die Austauschgeschwindigkeit sind schlecht, und zwar
wegen der Heterogenität des Reaktionsmediums (fest/flüssig). Diese schiechte Zugänglichkeit wird durch
die Tatsache noch erschwert, daß das Produkt ein festes Polymer ist und deshalb eine beträchtliche Steifheit
aufweist Darüber hinaus besitzt dieses Polymer häufig
ein Kohlenstoffskelett, welches nur eine schlechte
Affinität für wäßrige Phasen (schlechte Benetzbarkeit) und auch für die Substrate, welche im allgemeinen polar
sind, aufweist.
allgemeinen im Vergleich zum entsprechenden freien Enzym nur eine schwache enzymatische Aktivität,
wobei sie nur mäßige Reaktionsausbeuten ergeben.
Hinzu kommt noch, daß die Aktivität derartiger unlöslicher Trägerenzyme mit der Zeit abnimmt. Um
diesem Umstand zu begegnen, ist in der DT-OS 21 04 810 vorgeschlagen, das Trägerenzym in der Kälte
in Gegenwart eines Substrats aufzubewahren, das bei normalen Temperaturen von dem betreffenden Enzym
umgewandelt würde.
einen neuen Typus von Trägerenzymen zu schaffen,
welcher die Vorteile der löslichen und unlöslichen
Herstellung eines Produkts mit enzymatischer Aktivität, welches dadurch ausgeführt wird, daß man ein Enzym
mit einem Polymer, das freie Aldehydgruppen trägt, umsetzt, wobei das Kennzeichen darin besteht, daß das
Polymer mindestens 5% freie Säuregruppen, bezogen
auf die Gesamtheit der freien Aldehyd- und Säuregruppen, aufweist und eine in Abhängigkeit vom pH-Wert
variable Löslichkeit besitzt.
Das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Produkt besitzt gleichzeitig die Vorteile der
entsprechenden freien Enzyme, d.h., die Möglichkeit der enzymatischen Reaktion in einem homogenen
flüssigen Medium, und die Vorteile der unlöslich gemachten Enzyme, da man nämlich nach Einstellen des
pH nach der Reaktion durch einfache mechanische
Abtrennung dieses Produkt zurückgewinnen und dann
erneut verwenden kann.
Mit dem Ausdruck »freie Aldehydgruppen« sind hier Aldehydgruppen gemeint, die an das Polymer geknüpft
sind und die für den Aufbau von chemischen Bindungen
As mit anderen Stoffen zur Verfügung stehen. In ähnlicher
Weise sind mit dem Ausdruck »freie Säuregruppen« Säuregruppen gemeint, die an das Polymer geknüpft
sind und die sich ionisieren können, um dem Produkt mit
enzymatischer Aktivität eine beträchtliche Löslichkeit zu verleihen, und die wieder in ihre nicht-ionische Form
zurückkehren können, wenn der pH in vernünftiger Weise abgesenkt wird, wodurch die Löslichkeit des
Produkts drastisch verringert wird. Solche Säuregruppen sind beispielsweise Carbonsäuregruppen und
Phenolgruppen.
Ein Polymer, welches freie Aldehydgruppen und freie
Säuregruppen trägt, kann durch Polymerisation eines geeigneten Monomers oder durch Mischpolymerisation
eines Gemischs aus einem freie Aldehydgruppen aufweisenden bzw. ergebenden Monomer und einem
freie Säuregruppen aufweisenden bzw. ergebenden Monomer erhalten werden. Es ist auch möglich, freie
Aldehydgruppen und/oder freie Säuregruppen in ein geeignetes Polymer einzuführen. Man muß sicherstellen,
daß eine ausreichende Menge von freien Säuregruppen vorliegt, um die gewünschte Löslichkeit zu erzielen. Es
wurde festgestellt, daß die Anwesenheit von ungefähr 5% freier Säuregruppen, bezogen auf die Gesamtheit
der freien Aldchydgruppcn und der freien Säuregruppen, es gestattet, diese veränderliche Löslichkeit zu
erzielen. Selbstverständlich muß man eine Mindestmenge an freien Aldehydgruppen vorsehen, damit das
Enzym gebunden werden kann. Die Angabe eines Wertes für diese Mindestmenge besitzt>.ein praktisches
Interesse, da nämlich ein Interesse besteht, daß soviel freie Aldehydgruppen wie möglich vorliegen, damit die
größtmögliche Menge daran fixiert werden kann und daß nach der Fixierung ein Produkt mit einer
brauchbaren enzymat; "dien Aktivität erhalten wird. Die
experimentielle Bestimmung der Anwesenheit dieser freien Aldehydgruppen wie auch ihre quantitative
Analyse kann an einem Polymer, das die Form einer Ausfällung aufweist, durch die Methode von Park und
Johnson durchgeführt werden, welche an unlösliche
Materialien angepaßt ist, wie es beispielsweise von J. S. Thompson und G. D. Schockman in Anal
Biochem. 22,260 (1968) beschrieben ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf Enzyme anwendbar, welche funktioneile Gruppen enthalten, die
mit den freien Aidehydgruppen in einer irreversiblen Reaktion reagieren können. Von diesen funktioneilen
Gruppen sollen beispielsweise freie Aminogruppen erwähnt werden, die in gewissen Aminosäuren, wie z. B.
Lysin, vorliegen.
Es wurde beobachtet, daß die verschiedenen oben aufgeführten Parameter beim Verfahren der Fixierung
des Enzyms auf dem Polymer keinen kritischen Charakter aufweist. Solange die Eigenschaften des
Mediums die Natur des Enzyms und des Polymers nicht beeinflussen, haben sie auch keinen wesentlichen
Einfluß auf den Fixierungsprozeß. Beispielsweise muß man vermeiden, daß im Medium Erdalkaliionen
vorliegen, welche eine Neigung besitzen, mit dem Polymer im sauren Medium zu reagieren, wodurch seine
spätere Wiederauflösung beeinträchtigt wird. Die Mengen und die Konzentrationen des Enzyms und des
Polymers sind nicht kritisch. Auch der pH spielt keine wesentliche Rolle. Die Fixierung erfolgt gleich gut und
zufriedenstellend auf einem gelösten Polymer und auf einem ausreichend verteilten festen Polymer. Allgemein
ist jeder pH zwischen I und 11, der die Integrität des Enzyms und des Polymers bewahrt, brauchbar. Bevorzugt wird jedoch bei einem pH zwischen 7 und 8
gearbeitet, bei welchem das Polymer in Lösung ist. Obwohl die Fixierungsreaktion vorzugsweise bei
Raumtemperatur ausgeführt wird, kann sie auch bei
einer erhöhten Temperatur ausgeführt werden, d, h.
natürlich unterhalb einer Temperatur, bei welcher das Enzym inaktiv wird.
Die Reaktionsdauer kann zwischen einigen Minuten
und mehreren Stunden gewählt werden. Die besten
Resultate werden bei Reaktionszeiten zwischen 1 und 3 Stunden erreicht
Wenn das Verfahren der Fixierung des Enzyms auf einem festen Polymer in einem heterogenen Medium
ίο ausgeführt wird, dann ist die Abtrennung des Produkts
mit enzymatischer Aktivität besonders einfach. Sie kann leicht durch mechanische Abtrennung erfolgen, wie z. B.
durch Filtration, Dekantation oder Zentrifugation. Im anderen Fall reicht es, das Medium bis zu einem pH in
der Größenordnung von 4,5 anzusäuern, sofern die sauren Gruppen Carbonsäuregruppen sind, um das
Produkt mit enzymatischer Aktivität auszufällen, welches dann wie oben beschrieben gewonnen werden
kann.
Das erhaltene Produkt besitzt eine veränderliche Löslichkeit, die, wie bereits angedeutet, vom pH
abhängt Wenn die freien Säuregruppen ausschließlich aus Carbonsäuregruppen bestehen, dann beträgt der pH
für die Ausfällung etwa 4,5. Das bedeutet, daß die
Anwesenheit des auf dem Polymer fixierten Enzyms die Löslichkeitseigenschaften des Polymers nicht merklich
beeinflußt. Bei einem erhöhten pH ist das Produkt mit enzymatischer Aktivität löslich und besitzt ein Verhalten, welches demjenigen des freien Enzyms sehr ähnlich
ist. Bei einem niedrigen pH fällt dagegen das Produkt aus und kann leicht abgetrennt werden.
Nach einer Waschung kann das Produkt, erneut verwendet werden, wobei es in Lösung gebracht und
dann ausgefällt wird und dieser Vorgang wiederholt
werden kann. Es ist selbstverständlich, daß ein auf dem
Polymer zu fixierendes Enzym ausgewählt werden soll, das seine maximale Aktivität oder mindestens eine
wesentliche Aktivität in dem pH-Bereich aufweist, wo das Produkt mit enzymatischer Aktivitäv» das nach der
Fixierung erhalten worden ist, in wäßrigem Medium löslich ist. Im übrigen sollte darauf hingewiesen werden,
daß die maximale Aktivität des freien Enzyms nicht unbedingt bei dem gleichen pH vorliegen muß, bei dem
die maximale Aktivität des fixierten Enzyms vorliegt.
Das reichliche Vorhandensein von negativen Ladungen im Produkt, welche durch die Ionisation der Säuregruppen des Polymers erzeugt werden, ergibt in der
unmittelbaren Nachbarschaft des fixierten Enzyms eine Ansammlung von Protonen. Es sind genau die Protonen,
die während der enzymalischen Reaktion nicht vom Reaktionsmedium aufgenommen werden. Ganz allgemein kann man für das Produkt mit enzymatischer
Aktivität sagen, daß die maximale Aktivität bei einem etwas basischerem pH liegt als beim entsprechenden
freien Enzym.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Produkt mit
enzymatischer Aktivität und mit veränderlicher Löslichkeit in wäßrigem Medium dadurch hergestellt, daß man
ein Enzym mit einem Mischpolymer aus Acrolein und Acrylsäure, welches mindestens 10% freie Aldehydgruppen enthält, umsetzt. Dieses Mischpolymer kann
durch verschiedene Polymerisationsverfahren hergestellt werden, wie z. B. durch radikalische Polymerisa-
tion, die durch Redox-Systeme injiziert wird, durch anionische Polymerisation und durch kationische
Polymerisation. Dieses Mischpolymer, welches in wäßrigem Medium oder in einem organischen Lösungs-
nittel hergestellt werden kann, besitzt eine Struktur,
welche eine Funktion der relativen Mengen der beiden Monomeren im Ausgangsgemisch und des verwendeten
Polymerisationsverfahrens ist.
Die Fixierung des Enzyms auf dem Mischpolymer wird vorteilhafterweise in einer Pufferlösung ausgeführt,
indem man 1 bis 3 Stunden lang das Enzym und das Mischpolymer bei Raumtemperatur unter heftigem
Rühren mischt. Vorzugsweise wird die Reaktion in einer homogenen wäßrigen Phase mit Hilfe eines Puffers vom
pH 8 während einer Stunde ausgeführt. Nach dieser Zeit wird der pH auf 4 abgesenkt und die gebildete
Ausfällung abfiltriert.
Gemäß dieser speziellen Ausführungsform ist es beispielsweise möglich, aus dem erwähnten Mischpolymer
und Trypsin ein Fkierungsprodukl herzustellen, welches 50 bis 80% der enzymatischen Aktivität des
freien Trypsins aufweist und in wäßrigem Medium bei einem pH oberhalb 4,5 löslich und bei einem pH
unterhalb dieses Werts unlöslich ist.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
a) Herstellung eines
Acrolein/Acrylsäure-Mischpolymers
Acrolein/Acrylsäure-Mischpolymers
Unter einer Stickstoffatmosphäre werden 450 ml sauerstofffreies und entgastes Wasser, 60 ml frisch
destilliertes Acrolein, 9 ml Acrylsäure, 6,6 ml 30%iges
Wasserstoffperoxyd und 20 ml 2 η-Schwefelsäure to
gerührt. Dann werden während 40 min 150 ml einer 2,75%igen Natriumnitritlösung in entgastem Wasser
zugegeben. Nach der Umsetzung liegt der pH zwischen 3 und 4. Das Mischpolymer befindet sich dabei in der
Form einer Ausfällung. Die Ausfällung wird filtriert, mit ^ einer 0,002-m Salzsäure und dann mit Aceton gewaschen
und schließlich getrocknet. Auf diese Weise werden 7,75 g des gewünschten Mischpolymers
erhalten. Die Anwesenheit der freien Aldehydgruppen wird durch Messung des Reduktionsvermögens ermittelt,
und zwar durch das Verfahren von J. S. Thompson et al, auf welches oben bereits hingewiesen
wurde. Die Menge der freien Säuregruppen wird durch Titration ermittelt. Dabei wird festgestellt, daß 14
Gew.-% des Mischpolymers die Form von freien Aldehydpruppen aufweist und \7fi Gew.-°/o die Form
von freien Säuregruppen aufweist.
b) Fixierung von Trypsin auf dem Mischpolymer
Bei Raumtemperatur werden 600 mg des gemäß a) hergestellten Mischpolymers in 150 ml eines 0,2-m
Phosphaipuffers mit einem pH von 8 aufgelöst. Während der Auflösung und auch nachher während der
Fixierungsreaktion wird der pH durch Zusatz einer I η Sodalösung auf 3 gehalten. Nach vollständiger Auflösung
des Polymers werden 150 mg kristallisiertes Trypsin zugegeben, worauf das Ganze 1 st bei
Raumtemperatur reagieren gelassen wird. Hierauf wird der pH durch Zusatz von Salzsäure auf 4 abgesenkt. Die
gebildete Ausfällung wird abfiltriert und dreimal mit Wasser gewaschen. Nach Trocknung werden 557 mg
Produkt mit enzymatischer Aktivität erhalten.
c) Bestimmung der enzymatischen Aktivität
des Produkts
Das verwendet Verfahren besteht aus einer Adaption des Verfahrens von S. B I ο m b e r g et al, Eur.
). Biochem. 15,97 (1970) an die Bestimmung von Trypsin.
Es wird eine 0,009 m Lösung von BAEE (Chlorhydrat des Äthylesters von αΝ-Benzoyl-L-arginin) durch
Auflösen von 306 mg dieses Substrats in 100 ml einer Lösung, die hinsichtlich Ca++ CaCI2) und hinsichtlich
KCI O^ molar ist, hergestellt.
Zu 5 ml dieser Lesung werden 3 μg Trypsin (in Form
einer Lösung) zugegeben, worauf dann als Funktion der Zeit die Menge der Carbonsäuregruppen gemessen
wird, die durch enzymatische Hydrolyse der Esterfunktion des BAEE erhalten wird. Diese Messung wird durch
automatische Titration mit 0,01 n-Sodalösung und mit Hilfe eines Methrom-Herisau-pH-Konstanthalters gemessen,
wobei grafisch die verbrauchte Menge Sodalösung registriert wird, die zur Aufrechterhaltung des pH
auf einen Wert von 8 erforderlich ist. Auf diese Weise wird eine Kurve erhalten, die einen langen geradlinigen
Teil aufweist, dessen Steigung des Sodaverbrauch je Zeiteinheit repräsentiert. Der gleiche Versuch wird mit
5 μg Trypsin, dann mit 7,5 μg, mit 10 μg und schließlich
mit 13 μg wiederholt. Hierauf wird eine Eichkurve gezeichnet, und zwar aus Sodaverin auch je Zeiteinheit/
Trypsinmenge. Diese Kurve ist eine Gerade, mit anderen Worten heißt das, der Sodaverbrauch ist
proportional der eingesetzten Trypsinmenge.
Abschließend wird dieser Versuch unter Verwendung von 12 μg des Produkts mit enzymatischer Aktivität (in
Form einer Lösung mit einem pH von 8) wiederholt. Der Verbrauch an Soda, der in die Eichkurve übertragen ist,
ergibt direkt die äquivalente Trypsinmenge. Daraus ergibt sich eine enzymatische Aktivität von 80%,
gerechnet als Menge des auf dem Polymer fixierten Trypsins.
d) Löslichkeit des Produkts
93 ml des Produkts mit enzymatischer Aktivität, welches gemäß b) hergestellt worden ist, werden in 25
ml einer 0,2-m Phosphatpufferlösung mit einem pH von 8 aufgelöst. Die enzymatische Aktivität der Lösung wird
durch das Verfahren, das unter c) erläutert wurde, gemessen. Diesem Meßwert wird ein Koeffizient von
100 gegeben. Dann wird nach und nach 1 n-Salzsäure zugegeben, wobei das Produkt nach und nach ausfällt.
Regelmäßig werden Proben entnommen und zentrifugiert, wobei dann die enzymatische Aktivität, die im
Überstand zurückbleibt, gemessen wird. Dzbei wird festgestellt, daß die enzymatische Aktivität der Flüssigkeit
stark bei einem pH von etwa 4,8 abfällt. Der bei einem pH von 6 gemessene Wert beträgt noch 98%,
während der bei einem pH von 4,6 gemessene Wert auf 2% gefallen ist. Die Restaktivität ist bei einem pH von
4,5 gleich Null. Das heißt also, das gesamte Produkt mit enzymatischer Aktivität ist in eine unlösliche Form
überführt worden. Das so erhaltene unlösliche Produkt wild in einer Lösung mit einem pH von 8 aufgelöst,
worauf dann die enzymatische Aktivität dieser Lösung gemessen wird. £s werden wieder 98% der enzymatischen
Aktivität der Ausgangslösung gefunden.
Das Produkt mit enzymatischer Aktivität kann also durch Absenken des pH auf einen Wert unterhalb 4,5
quantitativ vom Reaktionsmedium abgetrennt werden, und es kann außerdem ohne wesentliche Verluste
wieder bei einem pH in der Gegend von 8 in Lösung gebracht werden, bei welchem Wert die maximale
enzymatische Aktivität von Trypsin liegt.
200 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten Acrolein/ Acrylsäure-Mischpolymers, 50 mg kristallisiertes Tryp-
sin und 50 ml eines 0,05 m TR IS-Puffers mil einem pH
von 8 (Dinatriiim äthylendiaminietraacetat) werden
gemischt. Das Gemisch wird dann 24 si bei einer
Temperatur von 4 C stehen gelassen, worauf dann vier
pH durch Zusatz von Salzsäure auf 4 abgesenkt wird.
Die gebildete Ausfällung wird abfiltriert und dreimal mit
Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wird ein Produkt mit en/ymaiischer Aktivität erhallen, welches
die gleichen Eigenschaften wie das Produkt von Beispiel
I besitzt.
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit enzymatischer Aktivität, welches dadurch ausgeführt wird, daß man ein Enzym mit einem Polymer,
das freie Aldehydgruppen trägt, umsetzt, dadurch
gekennzeichnet, daß das Polymer mindestens 5% freie Säuregruppen, bezogen auf die Gesamtheit
der freien Aldehyd- und Säuregruppen, aufweist und eine in Abhängigkeit vom pH-Wert variable
Löslichkeit besitzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein Mischpolymer aus
Acrolein und Acrylsäure ist, welches mindestens 10% freie Aldehydgruppen aufweist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym Trypsin verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym mit dem Polymer dadurch
umgesetzt wird, daß diese zwei Stoffe in einer Pufferlösung gemischt werden, worauf dann das
Reaktionsprodukt aus Enzym und Polymer ausgefällt und abfiltriert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH der Pufferlösung 8 beträgt.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CH244774A CH581664A5 (de) | 1974-02-21 | 1974-02-21 |
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DE2423059A1 DE2423059A1 (de) | 1975-08-28 |
DE2423059B2 DE2423059B2 (de) | 1977-08-04 |
DE2423059C3 true DE2423059C3 (de) | 1978-03-30 |
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DE2423059A Expired DE2423059C3 (de) | 1974-02-21 | 1974-05-13 | Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit enzymatischer Aktivität |
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CH (1) | CH581664A5 (de) |
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Families Citing this family (1)
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CH596313A5 (de) * | 1975-05-30 | 1978-03-15 | Battelle Memorial Institute |
-
1974
- 1974-02-21 CH CH244774A patent/CH581664A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1974-05-13 DE DE2423059A patent/DE2423059C3/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
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DE2423059B2 (de) | 1977-08-04 |
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