CH625557A5 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konstanthaltung der Aktivität von alkalischer Phosphatase in wässriger Lösung, insbesondere in rekonstituiertem Serum, sowie Anwendung des Verfahrens auf ein Kontrollserum, welches alkalische Phosphatase konstanter Aktivität enthält.
Die Bestimmung der alkalischen Phosphatase spielt in der klinisch-chemischen Analyse eine wichtige Rolle. Zur Kontrolle derartiger Analysen ist es erforderlich, die Richtigkeit der Analyse ständig anhand von Kontrollproben mit bestimmtem bekannten Gehalt an alkalischer Phosphatase zu kontrollieren. Derartige Kontrollseren, bei alkalischer Phosphatase vorwiegend Humanseren, müssen geeignet sein, für eine Vielzahl von Komponenten zur Überprüfung der Richtigkeit der Analysenergebnisse sogenannte Soll-Werte, die in der Kontrollserumprobe in einem Toleranzbereich wiedergefunden werden müssen, zu liefern. Dieses Konzept setzt voraus, dass die Komponenten im gebrauchsfertigen Kontrollserum stabil sind. Die Erreichung dieser Stabilität bei Enzymen wirft beträchtliche Probleme auf.
Insbesondere die alkalische Phosphatase (AP; EC 3.1.3.1) zeigt in wässrigen Lösungen, insbesondere in Serum, einen sehr starken Anstieg ihrer Aktivität. Über diese erstaunliche und in einem Kontrollserum äusserst unerwünschte Eigenschaft wird z.B. in Clin. Chem. 18,366-373 (1972) und Ärztl. Lab. 8, 272-279 (1972) berichtet. Der rasche Anstieg der Aktivität, der mehr als 100% innerhalb weniger Stunden betragen kann, zwingt dazu, nur ganz frisch rekonstituiertes Kontrollserum einzusetzen.
Es ist bekannt, diese Zunahme der Aktivität durch mehrstündiges Erhitzen des rekonstituierten Serums (6 Stunden bei 37°C) auszuschalten. Nach Ablauf der Erhitzungsperiode ergibt sich eine annehmbare Aktivitätskonstanz der AP. Dieses Verfahren hat jedoch schwerwiegende Nachteile. So wird durch den Erhitzungsschritt in der Regel die Aktivität weiterer im Kontrollserum enthaltener Enzyme wesentlich verringert oder zerstört, so dass es für die üblichen Kontrollseren, die stets mehrere Enzyme enthalten, imbrauchbar ist. Ausserdem ist ein mehrstündiges Erhitzen bei exakt einzuhaltender Temperatur eine äusserst umständliche Prozedur, welche in der Routineanalyse kaum akzeptabel ist.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Konstanthaltung der Aktivität von AP in wässriger Lösung, insbesondere in rekonstituiertem Serum, zu schaffen, welches die genannten Nachteile nicht aufweist und insbesondere auch in Gegenwart anderer Enzyme angewendet werden kann, ohne deren Aktivität zu beeinflussen. Das Verfahren soll zudem mit einem Minimum an Arbeitsaufwand durchführbar sein und Kontrollseren schaffen, die nach dem Rekonstituieren über einen längeren Zeitraum hinweg Aktivitätswerte für die AP liefern, die innerhalb der Toleranzgrenzen liegen.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäss durch ein Verfahren zur Konstanthaltung der Aktivität von alkalischer Phosphatase in wässriger Lösung, insbesondere in rekonstituiertem Serum, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass Mn2+ oder/und Cd2+-Ionen zugesetzt werden. Als günstigster Bereich für die gewünschte Konstanthaltung erwies sich dabei im Falle der Mn2+-Ionen ein Zusatz von 0,05 bis 0,5 mMol/1 und im Falle von Cd2+ ein Zusatz von 0,05 bis 0,1 mMol/1.
Mn2+ und Cd2+ werden vorteilhaft in Form ihrer gut wasserlöslichen Salze eingesetzt, deren Anionen keinen störenden Einfluss auf andere Bestandteile in der Lösung ausüben. Als Anionen werden daher vorzugsweise solche verwendet, die ohnedies in natürlichem Serum bereits vorhanden sind. Hierzu gehören neben den Anionen der weitverbreiteten Mineralsäuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Borsäure und dgl., auch die Anionen organischer Säuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure und dgl. Das verwendete Anion ist jedoch im Rahmen der Erfindung ohne Bedeutung, soweit es nur die oben genannte Bedingung erfüllt.
Die Erscheinung der unerwünschten Aktivitätszunahme der AP tritt insbesondere im Serum auf, und zwar gleichgültig, ob das Serum in aufgetautem oder gefrorenem Zustand vorliegt. Bei in lyophilisierter Form vorliegendem Serum tritt die Aktivitätserhöhung auf, sobald das Lyophilisat mit Wasser wieder rekonstituiert wird. Das erfindungsgemässe Verfahren kann daher sowohl auf ein bereits gelöstes Serum als auch vorzugsweise bei einem zur Lyophilisierung bestimmten Serum oder bei der Rekonstitution eines lyophilisierten Serums angewendet werden. Bei den bevorzugten Ausführungsformen enthält dann entweder das lyophilisierte Serum, vorzugsweise Humanserum, den erforderlichen Gehalt an Stabilisatorzusatz, oder statt dessen wird zur Rekonstitution ein wässriges Lösungsmittel verwendet, in dem das Stabilisierungsmittel enthalten ist. Die Rekonstitution erfolgt dabei üblicherweise mit Wasser, insbesondere entionisiertem oder bidestilliertem Wasser.
Die Fähigkeit zur Konstanthaltung der AP-Aktivität unter den oben geschilderten Umständen ist eine spezifische Eigenschaft von Mn2+- und Cd2+-Ionen und konnte bei anderen zweiwertigen oder anderswertigen Metallionen nicht gefunden werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Anwendung des obigen Verfahrens auf ein Kontrollserum mit einem bestimmten Gehalt an AP neben den Bestandteilen von
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Humanserum, tierischem Serum oder sonstigen serumartigen Zusammensetzungen und gegebenenfalls weiteren, in bestimmter Menge vorliegenden Enzymen und standardisierten Substraten in lyophilisierter oder gelöster Form, das dadurch gekennzeichnet ist, dass 0,05 bis 0,5 mMol/1 Mn2+ oder/und 0,05 bis 0,1 mMol/1 Cd2+, bezogen auf die gelöste Form, zugegeben werden.
Kontrollseren enthalten in der Regel mehrere Enzyme, beispielsweise 10 bis 20 Enzyme, bei denen sämtlich die Aktivität konstant gehalten werden muss. Normalerweise ist diese Konstanthaltung erforderlich, um einen Aktivitätsverlust zu verhindern. Nur die AP macht hier eine Ausnahme. Ein wesentlicher Vorteil von erfindungsgemäss hinsichtlich der Aktivitätskonstanz von AP-stabilisiertem Kontrollserum besteht darin, dass hierdurch die Aktivität der übrigen, im Serum vorliegenden Enzyme nicht beeinflusst wird, die Stabilisierungswirkung sich daher selektiv auf die AP erstreckt.
Ein erfindungsgemäss erhaltenes Kontrollserum der obigen Art enthält vorzugsweise
0,1 bis 5 mg Creatinin 0,1 bis 5 mg Bilirubin 50 bis 300 mg Glucose 0,2 bis 5 mg Mn2+ oder Cd2+
alkalische Phosphatase und gegebenenfalls weitere Enzyme in 100 ml natürlichem Serum oder serumartigen Zusammensetzungen in lyophilisierter oder gelöster Form.
Besonders bevorzugt ist ein Kontrollserum, bestehend aus
0,5 bis 1,5 mg Creatinin
0,5 bis 1,5 mg Bilirubin 100 bis 200 mg Glukose
1 bis 3 mg Mangan-(II)-chloridhydrat
Essigsäure zur Einstellung eines pH zwischen 6,0 und 7,0 alkalischer Phosphatase und weiteren Enzymen in 100 ml Serum.
Weitere im Kontrollserum in bestimmter Menge enthaltene Enzyme sind z.B.
Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT),
Lactat-Dehydrogenase (LDH), a-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase (a-HBDH), Glucose-6-Phosphatdehydrogenase (G-6-PDH), Creatinphosphokinase (CPK),
Glutamat-Dehydrogenase (Gl-DH),
Leucin-Aminopeptidase (LAP),
a-Amylase,
y-Glutamyltranspeptidase (y- GT)
Aldolase (ALD) und saure Phosphatase (SP).
Im oben angegebenen bevorzugten Bereich für die Zusätze an Mn2+ bzw. Cd2+ wird im allgemeinen die beste Konstanz der AP-Aktivität erhalten. Bei Erhöhung über die bevorzugten Grenzwerte hinaus besteht die Gefahr, dass die Aktivität abnimmt, bei einer Unterschreitung der unteren Grenze lässt sich eine für alle Fälle ausreichende Konstanz der Aktivität häufig nicht mehr erzielen und man stellt eine allmähliche Zunahme der Aktivität fest. Diese Aktivitätszunahme liegt aber immer noch deutlich niedriger als ohne diese Zusätze.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Ein handelsübliches lyophilisiertes Kontrollserum aus ursprünglich 3 ml Serum mit einem bestimmten Gehalt an alkalischer Phosphatase wird mit 3 ml einer 0,1 mM MnCh-Lösung rekonstituiert. Die Aktivität der AP unmittelbar nach
Rekonstitution und in bestimmten Zeitabständen danach wurde bestimmt. Die rekonstituierte Lösung wurde dabei konstant bei 25°C gehalten. Die prozentuale Änderung zeigt nachstehende Tabelle:
2 4 6 24 48 (Std.)
+ 1 -5 -3 -3 +7 (%)
Beispiel 2
Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen, die Rekonstitution erfolgte jedoch mit 3 ml einer 0,05 mM MnCh-Lösung in Wasser. Die prozentuale Aktivitätsänderung wurde wiederum wie in Beispiel 1 bestimmt. Die erhaltenen Werte zeigt nachstehende Tabelle:
2 4 6 24 48 (Std.)
+ 5 +6 +9 +19 +24 (%)
Beispiel 3
3 ml Humanserum, welchem die gewünschten Enzymmengen zugesetzt waren, wurden mit soviel MnCk versetzt, dass die Endkonzentration an Mn 0,1 mM betrug. Dann wurde das Serum lyophilisiert.
Das lyophilisierte Serum wurde mit 3 ml bidest. Wasser rekonstituiert. Die Aktivitätsänderung der AP wurde wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Die erhaltenen prozentualen Werte zeigt nachstehende Tabelle:
2 4 6 24 48 (Std.)
+ 2 -1 ±0 ±0 +14 (%)
Beispiel 4
Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch erfolgte die Rekonstitution mit 3 ml 0,05 mM wässriger CdCh-Lösung. Anschliessend erfolgte die Bestimmung der prozentualen Aktivitätsänderung nach Lagerung bei +25°C in der oben beschriebenen Weise. Nachstehende Tabelle zeigt die erhaltenen Ergebnisse:
2 4 6 24 48 (Std.)
+2 ±0 +1 +1 +6 (%)
Beispiel 5
Es wurde wie in Beispiel 4 beschrieben vorgegangen, die Rekonstitution erfolgte jedoch mit 3 ml 0,1 mM wässriger CdCk-Lösung. Die erhaltenen Ergebnisse zeigt nachstehende Tabelle:
2 4 6 24 48 (Std.)
+ 2 +1 +1 -4 +9 (%)
Beispiel 6
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch erfolgte die Rekonstitution des Lyophilisats mit 3 ml bidest. Wasser. Die Aktivitätsänderung nach Lagerung der rekonstituierten Probe bei +25°C zeigt nachstehende Tabelle:
2 4 6 24 48 (Std.)
+ 17 +21 +27 +45 +66 (%)
Beispiel 7
Aktivitätskonstantes Kontrollserum
100 ml Humanserum wurden mit einem Enzymkonzentrat versetzt, welches die Enzyme AP, GOT, GPT, CK, LDH, a-HBDH, Gl-DH, LAP, "/-GT, saure Phosphatase, Amylase, Aldolase und G-6-PDH enthielt. Weiter wurden zugesetzt:
s
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1 mg Creatinin 1 mg Bilirubin Glukose ad 150 mg 2mgMnCl2-4HzO
Essigsäure auf pH 6,5 s
Die erhaltene Lösung wurde klar filtriert, in Portionen von 3 ml in Fläschchen abgefüllt und lyophilisiert. Die lyophilisierten Proben wurden bei +4°C gelagert.
Bei Rekonstitution des Kontrollserums mit 3 ml bidest. io Wasser und Lagerung der rekonstituierten Lösung bei 25°C ergibt sich innerhalb von 24 Stunden eine Aktivitätszunahme der AP von weniger als 1 %.
Kochsalzlösung gelöst. Die Aktivität der AP wurde sofort nach Auflösung und in bestimmten Zeitabständen danach bestimmt. Die Lösung ist dabei konstant bei 25°C gehalten worden. Nachstehende Tabelle zeigt die prozentuale Änderung der AP-Aktivität:
2 4 6 24 48 (Std.)
+ 3 -4 -6 -8 -10 (%)
B) Es wurde wie in Beispiel 8 A beschrieben vorgegangen, jedoch wurde der Lösung MnCk bis zu einer Konzentration von a) 0,1 mMol/1 und b) 0,02 mMol/1 zugesetzt. Die prozentuale Änderung der AP-Aktivität zeigt nachfolgende Tabelle:
ls 2
4
6
24
48
(Std.)
Beispiel 8
a) -1
±0
+ 1
±0
-1
(%)
A) Die alkalische Phosphatase wurde in physiologischer b) +1
-1
-3
-3
-5
(%)
B
Claims (7)
1. Verfahren zur Konstanthaltung der Aktivität von alkalischer Phosphatase in wässriger Lösung, insbesondere in rekonstituiertem Serum, dadurch gekennzeichnet, dass Mn2+-oder/und Cd2+-Ionen zugesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Mn2+ auf eine Endkonzentration von 0,05 bis 0,5 mMol/1 zugesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Cd2+ auf eine Endkonzentration von 0,05 bis 0,1 mMol/1 zugesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Mn2+ oder/und Cd2+ dem Serum vor der Lyophili-sierung zugesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Mn2+ oder/und Cd2+ dem zur Rekonstitution von lyophilisiertem Serum verwendeten Wasser zugesetzt wird.
6. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 auf ein Kontrollserum mit einem bestimmten Gehalt an alkalischer Phosphatase neben den Bestandteilen von Humanserum, tierischem Serum oder sonstigen serumartigen Zusammensetzungen und gegebenenfalls weiteren in bestimmter Menge vorliegenden Enzymen und standardisierten Substraten in lyophilisierter oder gelöster Form, dadurch gekennzeichnet, dass 0,05 bis 0,5 mMol/1 Mn2+ oder/und 0,05 bis 0,1 mMol/1 Cd2+, bezogen auf die gelöste Form, zugesetzt werden.
7. Anwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kontrollserum, enthaltend
0,1 bis 5 mg Creatinin 0,1 bis 5 mg Bilirubin 50 bis 300 mg Glukose 0,2 bis 5 mg Mn2+ oder Cd2+
alkalischer Phosphatase und gegebenenfalls weiteren Enzymen und standardisierten Substanzen in 100 ml Serum oder serumähnlichen Zubereitungen in lyophilisierter oder gelöster Form hergestellt wird.
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