JPH09503051A - 細胞の調製および安定化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 安定化した細胞調製試料は、重金属化合物、特に遷移金属塩を備える安定化剤で細胞を処理することにより調製される。この安定化した細胞調製試料は、品質管理操作において使用されるための安定化した全血調製試料となりうる。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞の調製および安定化 発明の背景技術 本発明は、細胞の調製および安定化に関するものであり、特に、細胞および細 胞懸濁液、とりわけ全血およびその成分を調製および安定化するための新規な方 法、およびＵＶ顕微鏡検査法(UV microscopy)やフロー・サイトメトリーによる( flow cytometric)白血球の免疫表現型分類(immunophenotyping)技術、固定化抗 原／抗体検出系(immobilised antigen/antibody detection systems)および血液 学的分析、および血液モニター技術［例えば、亜鉛プロトポルフィリン（ＺＰＰ ）、赤血球葉酸エステル(red cell folate)および血液グルコース測定］などの 分析技術の品質管理における新規な安定化した細胞調製試料(cell preparation) の使用に関する。 ＵＶ顕微鏡検査法やフロー・サイトメトリーは、血液学的悪性腫瘍の診断にお いて用いられる技術である。それらは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染 している患者の進行経過、すなわち、ＡＲＣ（エイズ関連症候群）に無症候性で あるか、あるいはＡＲＣにかかっているか、あるいはＡＩＤＳ（エイズ）になっ ているのか、をモニターするのにも使用される。これら２種類の技術の品質管理 （ＱＣ）は、正確な診断を達成し、かつ治療における有効な処方計画をモニター する上で極めて重要である。現在のＱＣ法は、新たに採取された血液または蛍光 色素で被覆されたミクロスフェア(microsphere)を用いる。 一日を基準とする(a daily basis)新鮮血液の使用は、技術または装置の日毎( day-to-day)の変動に基づく情報を提供できない。さらに、蛍光色素を被覆した ミクロスフェアは、フロー・サイトメーター性能の日毎のモニター(day-to-day monitor)を可能にするが、ＵＶ顕微鏡検査法の作業には使用できない。さらに、 それらは白血球の標識化技術における品質管理に使用することができない。 アルデヒド等の化合物を用いた正常白血球の固定は、５〜７日間の安定性を付 与するが、細胞の自己蛍光発光(autofluorescence)を増大させる。これにより、 調製試料(preparation)は、長期間にわたる品質管理物質としての使用には不適 当になる。さらに、全血溶解技術による赤血球の溶解には、この操作を品質管理 する調製試料が必要となる。白血球を固定する現在の方法は、この溶解操作を阻 害するものであり、その結果、試験を妨害する残屑の著しい増加を引き起こす。 国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３２３６号（引用により本発明の一部を構成す る全開示）において、白血球の差分(differential)決定のための血液希釈剤およ び溶解剤が記載されており、その安定化剤はジアゾリジニル尿素(diazolidinyl urea)である。品質管理調製試料のような白血球調製試料は示唆されていない。 おそらく、その理由は、それらが、非常に多くの実験室から得られた結果を評価 する必要がある通常の品質管理操作において、十分な安定性を有しておらず、か つ特定の特異的抗原活性に欠けることによる。 国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０３７５８（引用により本発明の一部を構成する 全開示）は、アルデヒドを含有しない組織固定剤として、ジアゾリジニル尿素、 ジメチロイル尿素、２−ブロモ−２−ニトリプロパン−１，３−ジオールおよび 四級アダマンタンを使用することを開示している。処方は、特に(inter alia)媒 染剤、例えば亜鉛、ストロンチウム、カルシウム、バリウムおよびクロムの塩を 含有してもよい。しかしながら、これらの塩が安定化特性を有することは示唆さ れていない。 検定(calibration)のための全血サンプルまたは血液製品の使用を必要とする その他のＱＣ装置としては、血液学的分析装置（ヘマトロジー・アナライザー） が挙げられ、そこにおいて、通常固定されているウシ血液またはロバや七面鳥か ら採取された血液が用いられる。その理由は、安定化したヒト血液の適切な原料 が入手不可能であることによる。亜鉛プロトポルフィリン（ＺＰＰ）および赤血 球葉酸エステルのモニター技術においても、検定のための赤血球細胞の新鮮な懸 濁液を必要とする。この理由もまた、適切な安定化原料が入手不可能であること による。結局、検定のためのヒト全血の安定化した原料がないので、糖尿病患者 が血糖のモニタリングを家庭で行う可能性が限られてしまう。 上記から、種々の品質管理、モニタリングおよび検定の用途における細胞、特 に全血および血液製品の細胞を安定化するための改善された方法が必要とされて いることが察知されるであろう。 発明の目的 本発明の目的は、改善された安定化細胞調製試料、および細胞を安定化するた めの改善された方法を提供することである。 本発明のもう一つの目的は、安定化した全血調製試料およびそのような調製試 料の製造方法を提供することである。 本発明のさらにもう一つの目的は、全血において白血球を赤血球から分離する ための改善された溶解操作を提供することである。 本発明のさらにもう一つの目的は、広範囲の品質管理、分析およびモニター技 術において使用可能である、安定した品質管理物質を提供することである。 発明の開示 今や、広範囲の細胞が、重金属を備える化合物を有効量で添加することにより 安定化できること、および、そのような安定化した細胞が、従来公知のものより もさらに長期間にわたって活性な状態に保たれることが発見されている。 したがって、本発明は、その１つの形態において安定化した細胞調製試料を提 供し、その安定化剤が有効量の重金属化合物を備えることを特徴とする。 本発明は、もう一つの形態において、重金属化合物からなる安定化剤を有効量 添加することにより細胞を安定化する方法を提供する。 本発明は、特に全血および血液製品の安定化に適用可能であり、それに関して 、以下においてさらに詳細に記載する。しかしながら、本発明は、そのような物 質の安定化に限定されるものではなく、広範囲の細胞性物質、特に細胞懸濁液に 対して広く適用可能であることが理解されよう。 したがって、本発明は、さらなる形態において、安定化剤が有効量の重金属化 合物を備えることを特徴とする安定化した全血調製試料、および有効量の前記化 合物を添加することにより全血調製試料を安定化する方法を提供する。 さらに、本発明は、有効量の重金属化合物の添加による、全血の細胞性成分、 特に、例えば溶解した全血から形成される白血球調製試料の安定化方法も提供す る。 したがって、本発明は、さらなる形態において、安定化剤が有効量の重金属化 合物を備えることを特徴とする安定化した白血球調製試料、および、重金属化合 物を備える安定化剤の有効量の添加により白血球調製試料を安定化する方法を提 供する。 本発明のこの形態における安定化した白血球調製試料は、白血球除去全血（赤 血球）に添加されて安定化した全血調製試料を形成することが可能であり、した がって、本発明は、さらなる形態において、有効量の安定化剤の添加により安定 化した白血球を備えることを特徴とする安定化した全血調製試料を包含する。 本発明は、もう１つの形態において、安定化した白血球および未処理の赤血球 細胞を備えることを特徴とする安定化した全血調製試料を提供する。 本発明は、さらにもう１つの形態において、細胞性物質、特に血液および血液 製品のための新規な安定化剤を提供するものであり、その安定化剤は重金属化合 物およびホルムアルデヒドの水溶液を備える。 本発明のさらにもう１つの形態において、アンモニウム塩または四級アンモニ ウム塩と尿素との溶液を備え、尿素の濃度および溶液のｐＨが、単球によるＣＤ １４抗原のダウン・レギュレーションを十分防止して、免疫学的手段によるそれ ら単球の検出を十分可能にするものであることを特徴とする、白血球の分別のた めの溶解剤が提供される。 発明の詳細な説明 本発明は、検査室の品質管理操作に使用するための安定化した全血調製試料の 製造に関して特に記載される。しかし、本発明がそれらに限定されないこと、お よび、例えば、前記の安定化した全血調製試料がそれ以外の用途を見出してもよ いこと、前記の安定化した白血球調製試料は品質管理物質としての用途も見出す こと、および記載されている安定化操作が血液以外の原料、例えば甲状腺内リン パ球からの安定化した白血球の製造における用途を見出すことは察知されよう。 さらに、記載される安定化操作は、血液以外の原料、例えば微生物細胞、植物細 胞および生体組織に由来する同様の物質からの安定化した細胞の製造における用 途を見出すであろう。 本明細書における全血液調製試料は、実質的に新鮮血の全成分を含有する調製 試料、および実質的に新鮮血の血漿以外の全成分を含有する調製試料を包含する 。 全血の安定化を達成する方法は、有機および無機化合物の両方の添加を組み合 わせた一連の工程を用いる。一単位(a unit)の血液の採取の第１の方法は十分に 証明されており、瀉血（静脈切開）の技術分野において採用されるものであれば 如何なるものでもよい。抗凝固性にした血液が好ましく用いられ、何種類かの好 適な抗凝固剤が市販されている。しかしながら、ＥＤＴＡのカリウム塩を用いる ことが好ましい。 本発明の第１の操作によれば、最初に赤血球から白血球を分離し、その白血球 を安定化し、次いで安定化させた白血球を白血球除去全血に添加することにより 、好適な全血調製試料が製造可能である。第２の操作において、白血球分離工程 は省略され、血漿だけが除去されている全血に安定化剤を添加する。これら２種 類の操作は別々に記載される。操作Ｉ 白血球を安定化する方法は、通常は瀉血の２４時間以内に行われるが、好まし くは２時間以内に行われる。赤血球から白血球を分離するために、赤血球溶解の 新規な方法が用いられる。 新鮮全血（抗凝固剤を含有）は最初に遠心分離し、溶解は遠心分離後に得られ る軟層で行われる。溶解剤は、アンモニウム塩（例えば、塩化アンモニウム）ま たは四級アンモニウム塩と、尿素または適当に置換された尿素または尿素誘導体 との溶液、好ましくは水溶液を含有する。四級アンモニウム塩の濃度は、好まし くは０．０５〜０．５Ｍの範囲であり、尿素の濃度は１．０Ｍ未満であり、好ま しくは０．０５〜０．５Ｍの範囲である。溶液のｐＨは、好ましくは６．８〜７ ．８である。溶解期間は、好ましくは得られた白血球を等張性生理食塩水で洗浄 して溶解した細胞残屑を除去した後５〜２０分間である。 次いで、白血球を、重金属化合物、好ましくは重金属塩を備える第１の安定化 剤で処理する。好適な重金属は、錯体形成特性を有し、かつ原子重量が２０より 大きいものであり、例えば遷移金属、特にマグネシウム、クロム、モリブデン、 バナジウムおよびチタン等の周期律表のＩＶａ族〜ＶＩＩａ族の遷移金属；銅等 のＩｂ族、およびスズなどのＩＶｂ族が挙げられる。ＶＩａ族およびＶＩＩａ族 の遷移金属、特にクロムやマグネシウムが特に好ましい。好適な化合物としては 、そのような金属の水溶性の塩、特に無機酸の塩、例えば硫酸塩、特に塩化物が 挙げられる。塩化第二クロム（ＣｒＣｌ₃）等のクロム塩のようなクロム化合物 を用いた場合に特に良い結果が得られており、これらは本発明において用いるの に好ましい第１の安定化剤である。 重金属化合物は、好ましくは好適な溶媒における溶液の形態で用いられる。こ の溶媒は通常は水または水系溶媒であるが、白血球の抗原活性を実質的に阻害し ない、あるいはその統合性に影響を与えないような好適な有機溶媒の１０％未満 の少量の添加は本質的に否定されない。 しかしながら、有機溶媒の大量の存在は通常は好ましくない。 溶媒は、好ましくは、６．５〜７．０のｐＨに緩衝された等張性水溶液である 。好適な緩衝水溶液としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。 重金属化合物は、好ましくは溶媒に溶解され、この溶液は、例えば使用の１週 間前に、例えば少なくとも６時間、好ましくは１２時間、さらに好ましくは２４ 時間、最も好ましくは４８時間静置する。溶液の性能が静置することにより向上 する理由は理解されていない。しかし、溶液中における水和した金属水酸基イオ ン性化学種の形成によるものであろう。いくつかのクロム化合物の緩衝溶液にお いて、例えば、新たに調製された溶液が２４時間かけて緑色から紫色に変化して 帯電した錯体イオンの存在を示し、これに伴って水酸化クロム重合性化学種 (hydrated metal hydroxy ionic species)であると考えられる沈殿が形成される ことが観察されている。これは、好ましくは使用前に溶液からろ過して除去され る。沈殿の形成は、勿論、溶液中での重金属イオンの濃度を低下するであろうし 、これが起こった場合には、勿論、溶液の分析を行って、第１の安定化剤の濃度 が依然として好ましい範囲内にあるか否かを決定するべきである。 好ましくは、重金属化合物溶液は、比較的濃縮された溶液、例えば１％ｗ／ｖ 溶液として保存され、使用前に適当な緩衝液で希釈される。希釈において、ｐＨ が高くなるに従って沈殿が形成されるかもしれず、この溶液を使用する前に十分 な時間を与えてこの沈殿を生じさせておくべきである。 熟成させた重金属化合物の溶液は、かなりの期間にわたってその有効性を保持 するが、好ましくは１２カ月後、最も好ましくは６カ月後に捨てる。 第１の安定化剤の存在は、白血球の過度の自己蛍光発光を防止し、それと同時 に、白血球を２５日以上の期間にわたって安定化することを可能にする。第１の 安定化剤は、好ましくは等張液として白血球調製試料に添加されるが、その等張 液において、前記第１の安定化剤の最適最終濃度は、好ましくは１％ｗ／ｖ未満 、さらに好ましくは０．００５％〜０．７５％ｗ／ｖ、さらにより好ましくは０ ．０１％〜０．５％ｗ／ｖであり、最も好ましくは０．０５〜０．２５％ｗ／ｖ 、例えば０．１％ｗ／ｖである。この溶液は、好ましくは０．８５％のリン酸緩 衝生理食塩水である。そのｐＨは好ましくは６．５〜７．０に調整される。白血 球は、好ましくは第１の安定化剤に５分〜１８時間、最も好ましくは約６０分間 のインキュベーション期間だけ暴露(expose)される。このインキュベーション温 度は好ましくは０〜８℃であり、例えば４℃である。 第１のインキュベーション期間の後、白血球は好ましくは第２の安定化剤で処 理するが、この第２の安定化剤は、例えばアルデヒド、好ましくはホルムアルデ ヒドであり、最も好ましくはパラホルムアルデヒドであり、例えば０．１％〜０ ．５％ｗ／ｖの好ましい最終濃度、例えば０．３５％ｗ／ｖで溶液に溶解できる 。 例えば特定の組織学的技術において、細胞の自己蛍光発光が問題でない場合に は、如何なる好適なアルデヒドを用いてもよい。しかし、一般に、かつ特にフ ロー・サイトメトリー用のサンプルを調製する場合には、自己蛍光発光は最小に 保つ必要がある。これらの状況から鑑みて、パラホルムアルデヒドが好ましい。 その理由は、パラホルムアルデヒドが多くの場合に最小の自己蛍光発光を生ずる からである。パラホルムアルデヒド溶液を調製する場合、温度を６０℃未満に保 持して、パラホルムアルデヒドからホルムアルデヒドへの転換を防止することが 好ましい。 第２の安定化剤として重金属化合物とアルデヒドとの水溶液を用いた場合に、 非常に良い結果が得られることがわかっている。この組合せの第２の安定化剤は 、独立して細胞性物質の安定化に有用であり、したがって本発明のもう一つの形 態である。 重金属化合物は、前記したものの中のいずれであってもよく、溶液中に０．０ １〜０．５％ｗ／ｖの量で存在してもよい。アルデヒドは０．１〜０．５％ｗ／ ｖの量で存在可能であり、好ましくは溶液中における重金属化合物のアルデヒド に対する比率が５：１〜１：５０である。好ましくは、溶液はｐＨが６．５〜７ ．０であり、好適な等張緩衝液を備えていてもよい。好ましい溶液は、例えば０ ．８５％リン酸緩衝化生理食塩水であってよい。好ましくは、この溶液は抗凝固 剤を備えていてもよく、好ましい抗凝固剤はＥＤＴＡおよびヘパリンである。第 ２の安定化溶液への暴露は好ましくは６〜２４時間にわたり、上記に示した温度 範囲で行う。 重金属化合物は、単独で用いた場合、いくつかの場合には２０日間以上にわた って著しい安定化効果を有することがわかっているが、通常は６０日間（商業的 に望ましい保存期間）にわたる安定性を付与することはわかっていない。 重金属化合物とアルデヒドとを組合せた溶液を用いた場合（事実上、前記した 第２の安定化剤であり、単独で用いられる。）さらなる改善が得られるが、この 処理も、いずれの場合でも要求される６０日間安定性を付与しないことがわかっ ている。 一方、これまで記載してきたように、第１および第２の安定化剤を順次使用す ることにより、白血球の２２０日以上の安定性が付与できる。第１と第２の安定 化剤による処理の間隔は、好ましくは少なくとも３０分間、さらに好ましくは少 なくとも１時間、最も好ましくは少なくとも１２時間であり、例えば２４時間で ある。 等張リン酸緩衝化生理食塩水中で洗浄後、安定化した白血球は、白血球除去全 血に添加し戻す。この白血球除去全血は、血液を市販の白血球フィルターでろ過 することにより最初の供与者(donation)から得ることが可能であるが、しかし必 ずしもそのようにして得る必要はない。好ましくは細菌発育阻害剤を最終調製試 料に添加してもよい。この調製試料は、次いで０〜８℃の間で使用前１〜５日間 保持される。 上記工程は全て、好ましくは無菌条件下で行われる。 本発明の目的において、白血球除去血液（主に赤血球を含有）は「未処理」で あると考えられ、そこにおいて、白血球除去血液に安定化剤を添加して安定化し た全血調製試料を得る必要はないことがわかっている。単に全血調製試料の白血 球成分を安定化させることにより、その安定化した全血調製試料を得ることが可 能なことは、非常に驚くべきことである。 操作Ｉに従った安定化全血調製試料の商業的製造において、異なる供給源から の多くの単位の献血をプールし、白血球を分離・安定化することが可能である。 異なる供給者からのさらに多くの単位の血液はプールされ、白血球が除去できる 。最終的に、プールされた安定化白血球調製試料は白血球除去血液に添加され、 安定化した全血調製試料を形成する。操作II この操作は、前述のように、白血球分離段階を省略すること以外は操作Ｉに記 載されたものと同様である。この理由から、操作IIは屡々、大規模な安定化全血 調製試料の製造のためのものであると言われる。 全血サンプルの安定化の方法は、通常は瀉血の２４時間以内に行われるが、好 ましくは２時間以内に行われる。 新鮮全血（ＥＤＴＡ等の抗凝固剤を含有）は、まず最初に遠心分離され、血漿 を除去し、保持する。 残存する細胞を洗浄し、次いで重金属化合物を備える第１の安定化剤で処理す るが、これは操作Ｉにおいて記載されているのと同様であってもよい。 第１の安定化剤は、好ましくは溶液として全血調製試料に添加され、該溶液に おいて、該第２の安定化剤の最適最終濃度が好ましくは０．０１から０．５ｗ／ ｖである。この溶液は、好ましくは０．８５％リン酸緩衝生理食塩水溶液におけ るものである。ｐＨは好ましくは６．５から７．０に調整される。全血は好まし くは第１の安定化剤に５分〜１８時間、しかし最も好ましくは約６０分間にわた って暴露される。インキュベーションを行う温度は好ましくは０〜８℃、例えば 約４℃である。 前記第１のインキュベーション期間の後、全血は好ましくは、操作Ｉに記載の されている条件を用いて、第２の安定化剤（例えば、アルデヒド、好ましくはパ ラホルムアルデヒド）で処理する。この第２の安定化剤溶液の添加により、全血 の安定性は１３０日以上に伸びる。第２の安定化溶液への暴露は、好ましくは６ 〜２４時間、例えば約１８時間にわたり、操作Ｉに示した温度範囲である。 等張リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、血漿を安定化した全血に添加し戻す 。この血漿は最初の供与物から得られることが可能であるが、必ずしもそうであ る必要はない。好ましくは、細菌生育阻害剤および抗生物質（例えば、ゲンタマ イシン）も最終調製試料に添加する。次いで、この調製試料は使用前に０〜８℃ の間で１〜５日間保持される。 上記工程は全て好ましくは無菌条件下で行われ、好ましくは全体の操作が、献 血された血液が集められている瀉血容器の中で行われる。 操作IIに従う安定化全血調製試料の商業的製造において、異なる供与源からの 献血の多くの単位をプールし、得られたプールを安定化することが可能であり、 これは好ましいことであろう。 ここにおいて記載されている安定化方法は、正常細胞および白血病細胞の両方 に適用可能であり、公知の正常コントロールおよび非正常（白血病）コントロー ルを提供する。 本発明の安定化した全血調製試料は、優れた安定な品質のコントロールおよび 標準物質を提供でき、これらのコントロールおよび標準は、ＵＶ顕微鏡検査およ びフロー・サイトメトリーの両方による白血球の免疫表現型分類において使用可 能である。この調製試料は、残屑の過剰な混入を伴わない全血溶解操作の品質管 理において価値がある。安定化したサンプルは、正常な末梢血液白血球の全て（ 好中球、単球およびリンパ球）またはそれらのサブセット(subset)を含有可能で ある。この操作は、最適条件下で、白血球抗原プロフィールを保持でき、確実に 表現型分類(phenotyping)およびその操作の品質管理を行えるようにする。通常 の抗原決定基に対する値は決定可能であり、１３０日以上にわたって安定可能で ある。研究者らは幸運にも、特に関心のある抗原に対する値を得ることができる 。さらに、調製試料は、フロー・サイトメーターから得られる差分(differentia l)の品質管理に使用することも可能である。これは、ＨＩＶ感染者における抗ウ イルス性療法（治療）のモニタリングに用いられるパラメーターである。 血液試料の表現型分類のための新規な方法が開発され、それは染色後に溶解剤 で処理されるべきサンプルを必要としない。これらの技術は「無洗浄(no-wash) 」、「無溶解(no-lyse)」と呼ばれる。本発明の全血調製試料は、これらの技術 の品質管理を行う上でも使用可能であり、無洗浄・無溶解操作を分析するフロー ・サイトメーターにおいても使用可能である。 通常、本発明の安定化した全血調製試料はＵＶ顕微鏡検査法及びフロー・サイ トメーターによる免疫表現型分類の技術、全血溶解および全血無溶解技術の両方 の品質管理において使用可能である。 本発明の安定化した全血調製試料を用いた研究により、それらがアルカリホス ファターゼ・抗アルカリホスファターゼ免疫細胞化学技術（ＡＰＡＡＰ）のよう な技術を用いる免疫細胞化学的分析における使用に対しても安定であり、しかも 、例えば末梢血液塗沫調製試料における白血球の抗原プロフィールの決定に用い ることが可能であることがわかった。それは、一日限りの標準物質(day-to-day reference material)として、あるいは外部（実験室内）品質管理において使用 可能である。多数の塗沫調製試料は予め作製し、次いで使用するまで−２０℃で 保存することが可能である。この塗沫調製試料は一日単位で染色可能であるか、 あるいは他の塗沫調製試料を染色する場合にはコントロールとして使用すること が可能である。 本発明の安定化した全血調製試料は、エンザイム・リンクド・イムノソルベン ト・アッセイ(enzyme linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ)技術およびイ ムノラジオメトリック・アッセイ(immunoradiometric assay)技術において用い るための基準標準物質(standard reference material)としての用途を見出して もよい。 本発明の安定化した全血調製試料の実験室におけるさらなる用途としては、ヘ マトロジー・アナライザー(haematology analyser)（血液学的分析器）の品質管 理および検量物質(calibrant)、亜鉛プロトポルフィリン技術（ＺＰＰ）により 鉄欠乏をモニターするための品質管理物質、および赤血球葉酸エステル技術にお ける品質管理物質を包含してもよい。最終的に、本発明の安定化全血調製試料は 、広いベースで血液グルコース・レベル試験の品質管理における用途を見出して もよく、それにより、糖尿病患者がこの技術を患者自身の家庭で実行することが 可能になる。 本発明は、以下の実施例により説明される。実施例１ 安定化した全血調製試料は以下の記載のようにして作製し、その経時特性につ いて類似する未処理の全血サンプルと比較する。 準備 １．５００ｍｌの血液を、５０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し た６００ｍｇのエチレンジアミン四酢酸（二ナトリウム塩または三カリウム塩） を含有する滅菌した瀉血容器に瀉血する。 ２．抗凝血処理した血液を２つ（各々２５０ｍｌ）に分ける。 ３．一方の２５０ｍｌを白血球フィルターでろ過し、白血球を除去する。４℃で 保存する。 ４．もう一方の２５０ｍｌを８００ｇで１時間にわたって遠心分離する。 ５．軟層（白血球層）を除去する。 ６．軟層を溶解溶液を用いて２５０ｍｌにする。溶解溶液 １０倍原液（ｐＨ７．４） 塩化アルミニウム ８９．９ｇ 炭酸水素ナトリウム １０．０ｇ ＥＤＴＡ二ナトリウム ３７０ｍｇ 上記を１０００ｍｌの蒸留水（１．６８Ｍ ＮＨ₄Ｃｌ）に溶解する。 蒸留水で２倍強に希釈し、次いで同体積（１：１）の０．２Ｍ尿素（尿素は蒸 留水に溶解される）に添加して、最終的な溶解溶液（１倍；ｐＨ７．５）を得る 。 ７．暗所中、室温で５分間溶解する。 ８．３分間にわたって８００ｇで遠心分離し、上清をデカントする。 ９．リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回、８００ｇで遠心分離することによ り洗浄する。最後の上清をデカントする。 １０．細胞ペレットを２０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁する。 １１．６０ｍｌのろ過処理済みの熟成（＞１カ月）した０．１％塩化クロム六水 和物のＰＢＳ溶液（ｐＨ６．７）を添加し、時々撹拌しながら暗所中で１時間、 ４℃でインキュベートする。 １２．８００ｇで３分間にわたって遠心分離し、上清をデカントする。 １３．２０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、６０ｍｌのろ過処理済みの熟成（＞１カ月 ）した０．１％塩化クロム六水和物のＰＢＳ溶液（０．３５％のパラホルムアル デヒドを含有）（ｐＨ６．７）を添加する。暗所において１６〜２２時間、４℃ でインキュベートする。 １４．８００ｇで３分間にわたり遠心分離し、上清をデカントする。 １５．９のようにして２回洗浄する。 １６．３において詳述した白血球除去全血に白血球を再懸濁する。ゲンタマイシ ンやシプロフロキサシン等の広範囲の抗生物質を添加する。 １７．使用するまで、４℃で２〜３日間放置する。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２） 塩化ナトリウム ７．８３ｇ／ｌ ＥＤＴＡ二ナトリウム ０．３６ｇ／ｌ 塩化カリウム ０．２８ｇ／ｌ リン酸二水素カリウム（一塩基） ０．２６ｇ／ｌ リン酸水素二ナトリウム（二塩基） ２．３５ｇ／ｌ 添付する図面において比較の結果が説明されるものである。 図１は、抗原であるＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２０に対して染色した 『新鮮な』血液のフロー・サイトメトリーにより求められる特性を示す。この染 色は全血溶解技術およびネガティブ（負）のコントロールに対するポジティブ（ 正）のレベルを用いており、（ａ）はフォワード・アンド・サイド・スキャタ特 性［Forward & Side scatter(FSC & SSC)Characteristics］、（ｂ）はＣＤ３ ＰＥおよびＣＤ２０ ＦＩＴＣ、（ｃ）はＣＤ３ ＦＩＴＣおよびＣＤ４ ＰＥ 、（ｄ）はＣＤ３ ＦＩＴＣおよびＣＤ８ ＰＥである。 図２は、『新鮮な』非安定化血液のフロー・サイトメトリーによるＦＳＣとＳ ＳＣにおける８日間にわたる経時の影響を示すものであり、（ａ）は第１日目、 （ｂ）は第２日目、（ｃ）は第３日目、（ｄ）は第８日目である。 図３ａおよび図３ｂは、図１ｂ、ｃおよびｄに記載される抗原の発現における １０日間にわたる経時の影響を示すものであり、３ａ（ｉ）、（ｉｉ）および（ ｉｉｉ）は第１日目であり、３ｂ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は第１０日 目である。 図４ａおよび図４ｂは、安定化した全血調製試料における、フロー・サイトメ トリーにより求められるＦＳＣ、ＳＳＣおよびネガティブ（負）のコントロール 特性の５７日間にわたる安定性を示すものであり、４ａは第２日目であり、４ｂ は第５７日目である。 図５ａおよび図５ｂは、フロー・サイトメトリーにより測定される図１ｂ、ｃ およびｄに記載される抗原の５７日間にわたる安定性を示すものであり、５ａは 第２日目であり、５ｂは第５７日目である。 図６は、『新鮮な』血液のフロー・サイトメトリーによる白血球差分における ８日間にわたる保存の影響を示すものである。８日目以降の解析は、サンプルの 著しい劣化のために不可能であった。解析にはＦＡＣＳｃａｎのフロー・サイト メーターを用いた。 図７は、安定化した血液調製試料のフロー・サイトメトリーによる差分の２２ 日間にわたる安定性を示すものである。解析にはＦＡＣＳｃａｎのフロー・サイ トメーターを用いた。 図１におけるフロー・サイトメーター特性図は、赤血球を溶解した後のリンパ 球、単球および顆粒球の正常は位置を示す。抗原染色特性も図１ｂ、ｃ、ｄおよ びｅに示される。サンプルの経時時間が増加するに従って、フロー・サイトメト リーおよび抗原発現特性は変化する（図２）。第８日目で、残屑の量により解析 が不十分になった。蛍光標識特性も図３に示すように低下していた。 図４は、安定化したサンプルの２日目および５７日目における前方および側面 分散特性をネガティブのコントロールとともに示す。個々の母集団は後安定化(p ost stabilisation)を行うとすぐにそれぞれ位置に保持された。５７日間保存し た後、フォワード・アンド・サイド・スキャタ・フロー・サイトメトリック特性 はそのまま保持する（図４ｂ）。さらに、抗原発現特性はこの期間にわたって不 変のままである（図５）。 安定化した血液調製試料は、白血球の差分をモニターするのに使用可能である 。ＣＤ１４およびＣＤ４５抗原に対する抗体の特定の組合せを用いることにより 、３種類の細胞集団の差分が生じる。図７は、このパラメーターの安定性を示す が、図６は『新鮮な』全血の８日間にわたる不安定性を示す。この時間以降にお ける後者の解析は、過剰量の残屑の混入により中止された。実施例２ 安定化した全血の調製試料は以下の記載のようにして作製し、その経時特性に ついて類似する未処理の全血サンプルと比較する。 準備 １．実施例１のように、１単位の５００ｍｌの血液を、５０ｍｌのリン酸緩衝生 理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した６００ｍｇのエチレンジアミン四酢酸（二ナトリ ウム塩または三カリウム塩；ｐＨ７．２）を含有する滅菌した瀉血容器に瀉血す る。 ２．この単位を８００ｇで１時間にわたり遠心分離する。血漿を除去し保持する 。 ３．残留している細胞を滅菌したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄す る。 ４．上清ＰＢＳを除去する。 ５．３００ｍｌのろ過処理済みの熟成（＞１カ月）した０．１％塩化クロム六水 和物のＰＢＳ溶液（ｐＨ６．７）を添加し、時々撹拌しながら暗所中で１時間、 ４℃でインキュベートする。 ６．８００ｇで４５分間にわたって遠心分離し、上清をデカントする。 ７．３００ｍｌの、ろ過処理済みの熟成（＞１カ月）した０．１％塩化クロム六 水和物のＰＢＳ溶液（０．３５％のパラホルムアルデヒドを含有）（ｐＨ６．７ ）に再懸濁する。暗所において１６〜２２時間にわたり４℃でインキュベートす る。 ８．８００ｇで４５分間にわたり遠心分離し、上清をデカントする。 ９．ＰＢＳを用いて８００ｇで遠心分離する事により２回洗浄し、最後の上清を デカントする。 １０．工程２に詳述されているようにして、安定化した全血を血漿中に再懸濁す る。ゲンタマイシンやシプロフロキサシン等の広範囲の抗体を添加する。 １２．使用前に、２〜３日間にわたり４℃で放置する。 結果は添付する図面において説明される。 図８ａおよび図８ｂは、安定化した全血調製試料における、フロー・サイトメ トリーにより決定される６０日間にわたるＦＳＣ、ＳＳＣの安定性およびネガテ ィブ（負）のコントロールの特性を示すものであり、図４ａは３日目、図４ｂは ６０日目である。 図９ａおよび図９ｂは、フロー・サイトメトリーにより決定される抗原 ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８，ＣＤ１９およびＣＤ１６＋ＣＤ５６の５７日間にわた る安定性を示すものであり、図５ａは３日目を、図５ｂは６０日目である。 図１０は、安定化した血液調製試料のフロー・サイトメトリーで測定した差分 (differential)の２５日間にわたる安定性を示す。解析にはエフ・エー・シー・ エス・キャン（ＦＡＣＳｃａｎ）フロー・サイトメーターを用いた。 図１１は、安定化した全血調製試料のサンプル中の亜鉛プロトポルフィリン（ ＺＰＰ）レベルにおける３６日間にわたる安定性（ＺＰＰのμモル／ヘモグロビ ンのモルで測定）を示す。 図１２は、トア(Toa)（シスメックス(Sysmex)）ＮＥ８０００ヘマトロジー・ アナライザー(haematology analyser)を用いて測定した、安定化した白血球調製 試料のサンプルに対する全白血球計数および全リンパ球計数の１１７日間にわた る安定性を示す。 最後に、図１３は、安定化した全血調製試料および新鮮な保存全血のサンプル に対する赤血球葉酸エステルの５０日間にわたる測定を示す。 図１におけるフロー・サイトメトリー特性図は、赤血球を溶解した後のリンパ 球、単球および顆粒球の正常な位置を示す。抗原染色特性も、図１ｂ，ｃ，ｄお よびｅに示される。試料の熟成期間が長くなるに従って（図２）、フロー・サイ トメトリーにおける特性および抗原発現特性は変化する。第８日目には、残屑の 量によりこの解析は不十分なものになる。蛍光標識特性も図３に示すように低下 する。 図８ａおよび図８ｂは、３日目および６０日目における安定化したサンプルの ネガティブのコントトールとともにフォワード・アンド・サイド・スキャタ特性 を示す。各々の細胞集団は、後安定化(post stabilisation)を行うとすぐに、そ れぞれの位置に保持される。６０日間保存した後、フォワード・アンド・サイド ・スキャタ・フロー・メトリー特性は不変のままである（図４ｂ）。さらに、抗 原発現特性はこの期間中は変わらない（図９ａおよび図９ｂ）。同様の機械設置 が全体を通じて保持される。これらの結果は、図１〜図３において示される安定 化されていない「コントロール」に対する、本発明の安定化した血液調製試料の 著しい優位性を示す。 この安定化した血液調製試料は、白血球の差分をモニターするのに使用可能で ある。ＣＤ１４およびＣＤ４５抗原に対する特定の抗体の組合せを用いて、３種 類の細胞集団の差分(differential)が得られる。図１０は、２５日間にわたるこ のパラメータの安定性を示し、一方、図６は、８日間にわたる『新鮮な』全血の 不安定性を示す。後者のこの時点より以降の解析は、過剰量の残屑の混入により 中止された。 図１１に示すように、安定化した全血調製試料におけるＺＰＰレベルは実質的 に一定に保持され、３６日以降に極めてわずかな上昇が見られるだけである。同 様に、図１２に示されるように、全白血球計数および全リンパ球計数も、１１７ 日間にわたって、時間によりほとんど影響されることはない。 図１３は、赤血球葉酸エステルの安定性において、本発明による安定化した全 血調製試料を用いた場合に得られる非常に実質的な改善を示す。実施例３ 工程５における０．８５％ｗ／ｖリン酸緩衝生理食塩水への種々の金属塩の０ ．１％ｗ／ｖの溶液を用いて、実施例２の操作を繰り返す。得られた血液調製試 料の８日後および１２日後の安定性（ＦＳＣ、ＳＳＣおよびネガティブのコント ロール特性）はフロー・サイトメーターを用いて測定した。その結果は、得られ たプロットの目視判定、およびベクトン−ディキンソン・シムルセット・ソフト ウェア・バージョン２．３(Becton-Dickinson Simulset software version 2.3) により良好(good)、合格(pass)および不合格(fail)として評価した。 これらの結果は、ＶＩａ族およびＶＩＩａ族金属化合物の、その他の重金属化 合物に対する顕著な優位性を示すものである。しかし、後者の多くは許容可能で あると見なされ、そこにおいて、安定化されなかったコントロール（わずか４日 後に実質的な劣化を示した）に対して改善された安定性が得られた。 熟成した塩化第二クロム溶液（１６カ月）は、調製したばかりの溶液（＞１日 経過）よりも有効ではないことがわかった。それは、おそらくは溶液中における 錯体水和クロムイオン種(complex hydrated chromium ionic species)の形成、 あるいはその溶液をクロムイオンが除去されたままの状態にする不溶性の水酸化 クロムのポリマー種の沈殿のいずれかによるものであろう。 本明細書と同時に提出され、かつ本明細書とともに公の閲覧に公開される全て の論文および文書に注意を向けられたい。そのような論文および文書の全ての内 容は引用することにより本発明の一部を構成するものとなる。 本明細書において開示される特徴の全て（あらゆる添付の請求の範囲、要約書 および図面を包含する）および／または開示されている全ての工程またはあらゆ る方法またはプロセスは、そのような特徴および／または工程の少なくともいく つかが互いに排他的である組合せ以外であれば、如何なる組合せで組み合わされ てもよい。 本明細書において開示されている各特徴（あらゆる添付の請求の範囲、要約書 および図面を包含する）は、特に言明しない限り、同様、同等あるいは類似の目 的に役立つ別の特徴で置き換えられてもよい。したがって、特に言明しない限り 、開示される各特徴は、一般的な一連の同等または類似の特徴の一つの例である 。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年６月２６日 【補正内容】 請求の範囲 １．安定化した白血球を備える細胞調製試料であって、安定化剤が有効量の重金 属化合物を備えることを特徴とする細胞調製試料。 ２．前記細胞調製試料が細胞懸濁液であることを特徴とする請求項１に記載の細 胞調製試料。 ３．前記細胞調製試料が全血調製試料であることを特徴とする請求項１または２ に記載の細胞調製試料。 ４．前記重金属が遷移金属であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つ に記載の細胞調製試料。 ５．前記遷移金属がＶＩａ族またはＶＩＩａ族の金属であることを特徴とする請 求項４に記載の細胞調製試料。 ６．前記遷移金属がクロムであることを特徴とする請求項５に記載の細胞調製試 料。 ７．前記化合物が塩であることを特徴とする上記請求項のいずれか１つに記載の 細胞調製試料。 ８．前記塩が無機酸の塩、特に塩化物であることを特徴とする請求項７に記載の 細胞調製試料。 ９．前記安定化剤が塩化第二クロムであることを特徴とする上記請求項のいずれ か１つに記載の細胞調製試料。 １０．前記安定化剤が重金属塩の熟成溶液であることを特徴とする上記請求項の いずれか１つに記載の細胞調製試料。 １１．前記安定化剤がさらに有効量のアルデヒドを備えることを特徴とする上記 請求項のいずれか１つに記載の安定化した細胞調製試料。 １２．前記アルデヒドがパラホルムアルデヒドであることを特徴とする請求項１ １に記載の安定化した細胞調製試料。 １３．実質的に実施例に記載されていることを特徴とする上記請求項のいずれか １つに記載の安定化した細胞調製試料。 １４．実質的に上記されていることを特徴とする安定化した細胞調製試料。 １５．重金属化合物の熟成溶液を備える第１の安定化剤を有効安定化量で添加す ることを備えることを特徴とする細胞調製試料を安定化する方法。 １６．重金属化合物の等張溶液を備える第１の安定化剤を有効安定化量で添加す ることを備えることを特徴とする細胞調製試料を安定化する方法。 １７．前記細胞調製試料が細胞懸濁液であることを特徴とする請求項１５または １６に記載の方法。 １８．前記細胞調製試料が白血球を備えることを特徴とする請求項１５〜１７の いずれか１つに記載の方法。 １９．前記細胞調製試料が全血調製試料であることを特徴とする請求項１５〜１ ８のいずれか１つに記載の方法。 ２０．前記重金属が遷移金属であることを特徴とする請求項１５〜１９のいずれ か１つに記載の方法。 ２１．前記遷移金属がＶＩａ族またはＶＩＩａ族の遷移金属であることを特徴と する請求項２０に記載の方法。 ２２．前記遷移金属がクロムであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。 ２３．前記化合物が塩であることを特徴とする請求項１５〜２２のいずれか１つ に記載の方法。 ２４．前記塩が無機酸の塩、特に塩化物であることを特徴とする請求項２３に記 載の方法。 ２５．前記安定化剤が塩化第二クロムであることを特徴とする請求項１５〜２４ のいずれか１つに記載の方法。 ２６．前記第１の安定化剤が、０．０１〜０．５％ｗ／ｖ水溶液の最終濃度を付 与するのに十分な量で前記細胞調製試料に添加されることを特徴とする請求項１ ５〜２５のいずれか１つに記載の方法。 ２７．前記溶液のｐＨが６．５〜７．０であることを特徴とする請求項２６に記 載の方法。 ２８．前記細胞が前記第１の安定化剤に５分〜１８時間にわたり０〜８℃の温度 で暴露されることを特徴とする請求項１５〜２７のいずれか１つに記載の方法。 ２９．前記第１の安定化剤が、少なくとも２４時間にわたって熟成した重金属化 合物の水溶液を備えることを特徴とする請求項１５〜２８のいずれか１つに記載 の方法。 ３０．前記細胞調製試料に第２の安定化剤が添加されることを特徴とする請求項 １５〜２９のいずれか１つに記載の方法。 ３１．前記第２の安定化剤がアルデヒドであることを特徴とする請求項３０に記 載の方法。 ３２．前記アルデヒドがパラホルムアルデヒドであることを特徴とする請求項３ １に記載の方法。 ３３．前記第２の安定化剤が０．１〜０．５ｗ／ｖ水溶液の量で添加されること を特徴とする請求項１５〜３２のいずれか１つに記載の方法。 ３４．前記第２の安定化剤が、６．５〜７．０の範囲のｐＨを有するアルデヒド と重金属化合物との水溶液を備えることを特徴とする請求項３０〜３３のいずれ か１つに記載の方法。 ３５．前記細胞調製試料が前記第２の安定化剤に６〜２４時間にわたって０〜８ ℃の温度で暴露されることを特徴とする請求項３０〜３４のいずれか１つに記載 の方法。 ３６．前記第１および第２の安定化剤を前記細胞調製試料に順次添加することを 特徴とする請求項３０〜３５のいずれか１つに記載の方法。 ３７．実質的に実施例に記載されていることを特徴とする請求項１５〜３６のい ずれか１つに記載の方法。 ３８．実質的に上記されていることを特徴とする請求項１５〜３７のいずれか１ つに記載の方法。 ３９．請求項１５〜３８のいずれか１つに記載の方法により調製されることを特 徴とする請求項１〜１４のいずれか１つに記載の安定化した細胞調製試料。 ４０．実質的に実施例に記載されていることを特徴とする請求項３に記載の安定 化した全血調製試料。 ４１．実質的に上記されていることを特徴とする請求項３に記載の安定化した全 血調製試料。 ４２．前記全血調製試料が異なる供血者からのサンプルをプールすることにより 得られたものであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。 ４３．請求項３に記載の安定化した全血調製試料を備えることを特徴とする白血 球免疫表現型分類において使用するための品質管理物質。 ４４．品質管理標準物質として請求項３に記載の安定化した全血調製試料が用い られることを特徴とする白血球免疫表現型分類の品質管理方法。 ４５．品質管理標準物質として請求項３に記載の安定化した全血調製試料が用い られることを特徴とする亜鉛プロトポルフィリン、赤血球葉酸エステル、全白血 球計数およびリンパ球計数の血液モニター技術のいずれかの品質管理方法。 ４６．有効量の安定化剤の添加により安定化された白血球調製試料を備えること を特徴とする安定化した全血調製試料。 ４７．請求項１に記載の白血球調製試料を備えることを特徴とする請求項４６に 記載の安定化した全血調製試料。 ４８．実質的に実施例１に記載されていることを特徴とする請求項４６または４ ７に記載の安定化した全血調製試料。 ４９．安定化した白血球調製試料を白血球除去全血に添加することを備えること を特徴とする安定化した全血調製試料の製造方法。 ５０．前記白血球除去全血が血液を白血球フィルターでろ過することにより得ら れたものであることを特徴とする請求項４９に記載の方法。 ５１．実質的に実施例１に記載されていることを特徴とする請求項４９または５ ０に記載の方法。 ５２．重金属化合物とパラホルムアルデヒドとの水溶液を備えることを特徴とす る細胞性物質のための安定化剤。 ５３．前記重金属が遷移金属であることを特徴とする請求項５２に記載の安定化 剤。 ５４．前記遷移金属がＶＩａ族またはＶＩＩａ族の遷移金属であることを特徴と する請求項５３に記載の安定化剤。 ５５．前記遷移金属がクロムであることを特徴とする請求項５４に記載の安定化 剤。 ５６．前記化合物が塩であることを特徴とする請求項５２〜５５のいずれか１つ に記載の安定化剤。 ５７．前記塩が無機酸の塩、特に塩化物であることを特徴とする請求項５２〜５ ６のいずれか１つに記載の安定化剤。 ５８．前記重金属化合物が塩化第二クロムであることを特徴とする請求項５２〜 ５７のいずれか１つに記載の安定化剤。 ５９．前記重金属化合物が０．０１〜０．５％ｗ／ｖの量で、および前記パラホ ルムアルデヒドが０．１〜０．５％ｗ／ｖの量で存在することを特徴とする請求 項５２〜５８のいずれか１つに記載の安定化剤。 ６０．重金属化合物のパラホルムアルデヒドに対する比率が５：１〜１：５０で あることを特徴とする請求項５２〜５９のいずれか１つに記載の安定化剤。 ６１．実質的に実施例に記載されていることを特徴とする請求項５２〜６０のい ずれか１つに記載の安定化剤。 ６２．安定化した白血球と未処理の赤血球細胞とを備えることを特徴とする安定 化した全血調製試料。 ６３．前記第１の安定化剤が、血漿のみが除去されている全血調製試料に添加さ れることを特徴とする請求項１９に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９４０６６９８．２ (32)優先日 1994年４月５日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 レイリー，ジョン テニソン 英国 エス17 ３エヌユー シェフィール ド ドール デボンシャー ロード 79 (72)発明者 メイアー，ペトラ スーザン マリア ドイツ ディー―85764 オーベルシュラ イスハイム テオドル―ヘウス―シュトラ ーセ ７ (72)発明者 フェイ，ショウン，パトリック アメリカ合衆国 08540 ニュージャージ ー州 プリンストン ウエスト シュルー スベリー プレイス 94

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．安定化剤が有効量の重金属化合物を備えることを特徴とする安定化した細胞 調製試料。 ２．前記細胞調製試料が細胞懸濁液であることを特徴とする請求項１に記載の安 定化した細胞調製試料。 ３．前記細胞調製試料が全血調製試料であることを特徴とする請求項１または２ に記載の安定化した細胞調製試料。 ４．前記細胞調製試料が白血球調製試料であることを特徴とする請求項１または ２に記載の安定化した細胞調製試料。 ５．前記重金属が遷移金属であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つ に記載の安定化した細胞調製試料。 ６．前記遷移金属がＶＩａ族またはＶＩＩａ族の金属であることを特徴とする請 求項５に記載の安定化した細胞調製試料。 ７．前記遷移金属がクロムであることを特徴とする請求項６に記載の安定化した 細胞調製試料。 ８．前記化合物が塩であることを特徴とする上記請求項のうちのいずれか１つに 記載の安定化した細胞調製試料。 ９．前記塩が無機酸の塩であり、特に塩化物であることを特徴とする請求項８に 記載の安定化した細胞調製試料。 １０．前記安定化剤が塩化第二クロムであることを特徴とする上記請求項のうち のいずれか１つに記載の安定化した細胞調製試料。 １１．前記安定化剤がさらに有効量のアルデヒドを備えることを特徴とする上記 請求項のうちのいずれか１つに記載の安定化した細胞調製試料。 １２．前記アルデヒドがパラホルムアルデヒドであることを特徴とする請求項１ １に記載の安定化した細胞調製試料。 １３．実質的に実施例に記載されていることを特徴とする上記請求項のうちのい ずれか１つに記載の安定化した細胞調製試料。 １４．実質的に上記されていることを特徴とする上記請求項のうちのいずれか１ つに記載の安定化した細胞調製試料。 １５．重金属化合物を備える第１の安定化剤を有効安定化量で細胞調製試料に添 加することを特徴とする細胞調製試料を安定化する方法。 １６．前記細胞調製試料が細胞懸濁液であることを特徴とする請求項１５に記載 の方法。 １７．前記細胞調製試料が全血調製試料であることを特徴とする請求項１５また は１６に記載の方法。 １８．前記細胞調製試料が白血球調製試料であることを特徴とする請求項１５ま たは１６に記載の方法。 １９．前記重金属が遷移金属であることを特徴とする請求項１５〜１８のいずれ か１つに記載の方法。 ２０．前記遷移金属がＶＩａ族またはＶＩＩａ族の遷移金属であることを特徴と する請求項１９に記載の方法。 ２１．前記遷移金属がクロムであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。 ２２．前記化合物が塩であることを特徴とする請求項１５〜２１のいずれか１つ に記載の方法。 ２３．前記塩が無機酸の塩であり、特に塩化物であることを特徴とする請求項２ ２に記載の方法。 ２４．前記安定化剤が塩化第二クロムであることを特徴とする請求項１５〜２３ のいずれか１つに記載の方法。 ２５．前記第１の安定化剤が最終濃度として０．０１〜０．５％ｗ／ｖの水溶液 を付与するのに十分な量で前記細胞調製試料に添加されることを特徴とする請求 項１５〜２４のいずれか１つに記載の方法。 ２６．前記溶液のｐＨが６．５〜７．０であることを特徴とする請求項２５に記 載の方法。 ２７．前記細胞が前記第１の安定化剤に５分〜１８時間にわたり０〜８℃の温度 で暴露されることを特徴とする請求項１５〜２６のいずれか１つに記載の方法。 ２８．前記細胞調製試料に第２の安定化剤を添加することを特徴とする請求項１ ５〜２７のいずれか１つに記載の方法。 ２９．前記第２の安定化剤がアルデヒドであることを特徴とする請求項２８に記 載の方法。 ３０．前記アルデヒドがパラホルムアルデヒドであることを特徴とする請求項２ ９に記載の方法。 ３１．前記第２の安定化剤が０．１〜０．５％ｗ／ｖ水溶液の量で添加されるこ とを特徴とする請求項１５〜３０のいずれか１つに記載の方法。 ３２．前記第２の安定化剤が、６．５〜７．０の範囲のｐＨを有するアルデヒド と重金属化合物との水溶液を備えることを特徴とする請求項２８〜３１のいずれ か１つに記載の方法。 ３３．前記細胞調製試料が前記第２の安定化剤に６〜２４時間にわたって０〜８ ℃の温度で暴露されることを特徴とする請求項２８〜３２のいずれかに記載の方 法。 ３４．前記第１および第２の安定化剤が前記細胞調製試料に順次添加されること を特徴とする請求項２８〜３３のいずれか１つに記載の方法。 ３５．実質的に実施例に記載されていることを特徴とする請求項１５〜３４のい ずれか１つに記載の方法。 ３６．実質的に上記に記載されていることを特徴とする請求項１５〜３５のいず れか１つに記載の方法。 ３７．請求項１５〜３６のいずれか１つの方法により調製されることを特徴とす る請求項１〜１４のいずれか１つに記載の安定化した細胞調製試料。 ３８．実質的に実施例に記載されていることを特徴とする請求項３に記載の安定 化した全血調製試料。 ３９．実質的に上記に記載されていることを特徴とする請求項３に記載の安定化 した全血調製試料。 ４０．前記全血調製試料が異なる供血者からのサンプルをプールすることにより 得られていることを特徴とする請求項１７に記載の方法。 ４１．請求項３に記載の安定化した全血調製試料を備えることを特徴とする白血 球免疫表現型分類において使用するための品質管理物質。 ４２．品質管理標準物質として請求項３に記載の安定化した全血調製試料が用い られることを特徴とする白血球免疫表現型分類の品質管理方法。 ４３．品質管理標準物質として請求項３に記載の安定化した全血調製試料が用い られることを特徴とする亜鉛プロトポルフィリン、赤血球葉酸エステル、全白血 球計数およびリンパ球計数の血液モニター技術のいずれかのための品質管理方法 。 ４４．有効量の安定化剤の添加により安定化された白血球調製試料を備えること を特徴とする安定化した全血調製試料。 ４５．請求項４に記載の白血球調製試料を備えることを特徴とする請求項４４に 記載の安定化した全血調製試料。 ４６．実質的に実施例１に記載されていることを特徴とする請求項４２または４ ３に記載の安定化した全血調製試料。 ４７．安定化した白血球調製試料を白血球除去全血に添加することを備えること を特徴とする安定化した全血調製試料の製造方法。 ４８．前記白血球除去全血が血液を白血球フィルターでろ過することにより得ら れたものであることを特徴とする請求項４７に記載の方法。 ４９．実質的に実施例１に記載されていることを特徴とする請求項４７または４ ８に記載の方法。 ５０．重金属化合物とアルデヒドとの水溶液を備えることを特徴とする細胞性物 質のための安定化剤。 ５１．前記重金属が遷移金属であることを特徴とする請求項５０に記載の安定化 剤。 ５２．前記遷移金属がＶＩａ族またはＶＩＩａ族の遷移金属であることを特徴と する請求項５１に記載の安定化剤。 ５３．前記遷移金属がクロムであることを特徴とする請求項５２に記載の安定化 剤。 ５４．前記化合物が塩であることを特徴とする請求項５０〜５３のいずれか１つ に記載の安定化剤。 ５５．前記塩が無機塩の塩であり、特に塩化物であることを特徴とする請求項５ ０〜５１のいずれか１つに記載の安定化剤。 ５６．前記重金属化合物が塩化第二クロムであることを特徴とする請求項５０〜 ５５のいずれか１つに記載の安定化剤。 ５７．前記アルデヒドがパラホルムアルデヒドであることを特徴とする請求項５ ０〜５６のいずれか１つに記載の安定化剤。 ５８．前記重金属化合物が０．０１〜０．５％ｗ／ｖの量で、および前記アルデ ヒドが０．１〜０．５％ｗ／ｖの量で存在することを特徴とする請求項５０〜５ ４のいずれか１つに記載の安定化剤。 ５９．重金属化合物のアルデヒドに対する比率が５：１〜１：５０であることを 特徴とする請求項５０〜５８のいずれか１つに記載の安定化剤。 ６０．実質的に実施例に記載されていることを特徴とする請求項５０〜５９のい ずれか１つに記載の安定化剤。 ６１．アンモニウム塩または四級アンモニウム塩と尿素との溶液を備え、該溶液 における尿素の濃度および該溶液のｐＨが、単球によるＣＤ１４抗原のダウン・ レギュレーションを十分防止して免疫学的手段によるそれらの検出を十分可能に するものであることを特徴とする白血球の分別のための溶解剤。 ６２．前記アンモニウム塩が塩化アンモニウムであることを特徴とする請求項６ １に記載の溶解剤。 ６３．前記アンモニウム塩の濃度が０．０５〜０．５Ｍであり、前記尿素の濃度 が０．０５〜０．５Ｍであることを特徴とする請求項６１または６２に記載の溶 解剤。 ６４．前記溶液が６．８〜７．８のｐＨを有することを特徴とする請求項６１〜 ６３のいずれか１つに記載の溶解剤。 ６５．実質的に実施例１に記載されていることを特徴とする請求項６１〜６４の いずれか１つに記載の溶解剤。 ６６．血液を請求項６１〜６５のいずれか１つに記載の溶解剤に接触させること を備えることを特徴とする全血を溶解するための方法。 ６７．安定化した白血球および未処理の赤血球細胞を備えることを特徴とする安 定化した全血調製試料。 ６８．血漿のみが除去されている全血調製試料に前記第１の安定化剤が添加され ることを特徴とする請求項１７に記載の方法。