ES2197168T3 - Preparacion y estabilizacion de celulas. - Google Patents
Preparacion y estabilizacion de celulas.Info
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Abstract
LAS PREPARACIONES DE CELULAS ESTABILIZADAS SE PREPARAN TRATANDO LAS CELULAS CON UN AGENTE ESTABILIZADOR QUE CONTENGA UN COMPUESTO DE UN METAL PESADO, EN PARTICULAR UNA SAL DE UN METAL DE TRANSICION. LAS PREPARACIONES DE CELULAS ESTABILIZADAS SE PUEDEN PREPARACIONES DE SANGRE PURA ESTABILIZADAS A UTILIZAR EN PROCESOS DE CONTROL DE CALIDAD.
Description
Preparación y estabilización de células.
La presente invención trata de la preparación y
la estabilización de células y, en particular, de un nuevo
procedimiento para preparar y estabilizar células y suspensiones
celulares, especialmente, sangre completa y sus constituyentes para
el uso de nuevas preparaciones de células estabilizadas en el
control de calidad de técnicas analíticas tales como técnicas de
inmunofenotipaje leucocitario por microscopía UV y citometría de
flujo, sistemas de detección de antígeno/anticuerpo inmovilizados y
analizadores hematológicos, y técnicas de monitorización sanguínea
tales como protoporfirina de cinc (ZPP), folato en células rojas y
medidas de glucosa en sangre.
La microscopía UV y la citometría de flujo son
técnicas que se usan en el diagnóstico de malignidades
hematológicas. Además se usan para monitorizar el progreso de
pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH), ya sean asintomáticos o que sufran ARC o SIDA en su estado
más avanzado. El control de calidad (CC) de estas dos técnicas es
extremadamente importante para llegar al diagnóstico correcto y
para monitorizar regímenes terapéuticos efectivos. Los
procedimientos de CC actuales usan sangre recién extraída o
microesferas recubiertas con un fluorocromo.
El uso de sangre fresca sobre una base diaria
falla en cuanto a que proporciona la información con una variación
diaria de la técnica o del equipo. Más aún, las microesferas
recubiertas de fluorocromo, aunque proporcionan una monitorización
diaria del funcionamiento del citómetro de flujo, no pueden usarse
para el funcionamiento del microscopio UV. Además, no pueden usarse
para proporcionar un control de calidad de las técnicas de marcaje
de leucocitos.
La fijación de los leucocitos normales usando
compuestos tales como los aldehídos, aunque ofrece una estabilidad
durante 5-7 días, aumenta la autofluorescencia
celular. Esto hace que la preparación no sea adecuada para usarse
como material de control de calidad a largo plazo. Además, la lisis
de las células rojas mediante la técnica de lisado de sangre
completa requiere una preparación que controlase la calidad de este
procedimiento. Los procedimientos actuales de fijación de leucocitos
inhiben este procedimiento de lisado, lo que produce un aumento
significativo de los restos celulares que interfieren con las
pruebas.
En la solicitud internacional nº PCT/US91/03236,
cuya descripción completa se incluye en la presente invención
mediante referencia, se describe un diluyente de sangre y un agente
de lisis para la determinación diferencial de células blancas de la
sangre (leucocitos) en la que el agente estabilizante es la
diazolidinil urea. No se sugieren preparaciones para el control de
calidad para tales preparaciones de leucocitos, posiblemente debido
a que tienen una estabilidad insuficiente y carecen de cierta
actividad antigénica específica para aquellos procedimientos
rutinarios de control de calidad que necesitan evaluar los
resultados de un gran número de laboratorios.
La solicitud internacional nº PCT/US92/03758,
cuya descripción completa se incorpora en la presente invención
mediante referencia, describe el uso de diazolidinil urea,
imidazonilil urea, dimetilol-5,
5-dimetil-hidancion, dimetilol urea,
2-bromo-2-nitropropano-1,
3-diol y adamantano cuaternario como fijadores
tisulares, que están libres de aldehídos. Las formulaciones pueden,
entre otros, ser mordientes como cinc, estroncio, calcio, bario y
sales de cromo. Sin embargo, no se sugiere que ninguna de estas
sales tenga propiedades estabilizadoras.
Otro equipo de CC que requiere el uso de muestras
de sangre completa o de productos sanguíneos para el calibrado
incluye los analizadores hematológicos, donde normalmente se usa
sangre bovina fijada o sangre de burros y pavos porque no hay una
fuente de sangre humana estabilizada disponible. Las técnicas de
monitorización de la protoporfirina de cinc (ZPP) y el folato de
células rojas también requieren suspensiones frescas de células
rojas sanguíneas para el calibrado, de nuevo porque no hay una
fuente estabilizada adecuada disponible. Finalmente, la carencia de
una fuente estabilizada de sangre completa humana para propósitos
de calibrado limita la posibilidad de que los diabéticos lleven a
cabo la monitorización del azúcar en la sangre en casa.
En lo mencionado arriba se apreciará que hay una
necesidad de mejorar un procedimiento para estabilizar las células,
particularmente de sangre completa o de productos sanguíneos, para
una variedad de aplicaciones de control de calidad, monitorización y
calibrado.
Un objeto de la invención es proporcionar la
preparación de células estabilizadas y un procedimiento mejorado
para la estabilización de las células.
Es además un objeto de la invención proporcionar
la preparación de sangre completa estabilizada y un procedimiento
para fabricar tal preparación.
Un objeto más de la invención es proporcionar un
procedimiento de lisis mejorado para la separación de los leucocitos
de las células rojas sanguíneas en la sangre completa.
Es un objeto más aún de la invención,
proporcionar materiales para un control de calidad estable que
puedan usarse en un amplio espectro de técnicas de control de
calidad, análisis y monitorización.
Actualmente se ha descubierto que un amplio
espectro de células pueden estabilizarse mediante la adición de un
compuesto que contiene metales pesados en una cantidad efectiva
para las células, y que dichas células estabilizadas permanecerán
activas durante periodos de tiempo mucho más largos que los
conocidos hasta ahora.
Por tanto, un aspecto de la invención proporciona
una preparación de células estabilizadas en la que el agente
estabilizante contiene una cantidad efectiva de un compuesto de
metal pesado.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para estabilizar las células mediante la adición a
éstas de una cantidad efectiva de agente estabilizante que contenga
un compuesto de metal pesado.
La invención es aplicable particularmente a la
estabilización de sangre completa y de productos sanguíneos y se
describirá, de aquí en adelante, de forma más particular con
referencia a esto.
Ha de entenderse, no obstante, que la invención
no se limita a la estabilización de dichos materiales y es
aplicable, ampliamente, a un amplio espectro de materiales celulares
y, especialmente, a suspensiones celulares.
En un aspecto más, por lo tanto, la invención
proporciona una preparación de sangre completa estabilizada en la
que el agente estabilizante consta de una cantidad efectiva de un
compuesto de metal pesado y un procedimiento de estabilización de
sangre completa mediante la adición de una cantidad efectiva del
compuesto a ésta.
La invención proporciona además un procedimiento
de estabilización de los constituyentes celulares de la sangre
completa, en particular, de preparaciones de leucocitos obtenidas,
por ejemplo, a partir de sangre completa lisada, mediante la adición
a ésta de una cantidad efectiva de un compuesto de metal
pesado.
Por tanto, en un aspecto más, la invención
proporciona una preparación de leucocitos estabilizada en la que el
agente estabilizante consta de una cantidad efectiva de un
compuesto de metal pesado y un procedimiento para estabilizar
preparaciones de leucocitos mediante la adición a éstas de una
cantidad efectiva de un agente estabilizante que consta de un
compuesto de metal pesado.
La preparación de leucocitos estabilizada de este
aspecto de la invención puede añadirse a sangre completa
deplecionada de leucocitos (células rojas sanguíneas) para formar
una preparación de sangre completa estabilizada, y la invención por
consiguiente incluye, en un aspecto más todavía, una preparación de
sangre completa estabilizada que comprende leucocitos estabilizados
mediante la adición a éstos de una cantidad efectiva de un agente
estabilizante y un procedimiento para la fabricación de una
preparación de sangre completa estabilizada que comprende la adición
de una preparación de leucocitos estabilizados a sangre completa
deplecionada de leucocitos.
En otro aspecto, la invención proporciona una
preparación de sangre completa estabilizada que comprende leucocitos
estabilizados y células de sangre roja sin tratar.
En otro aspecto, la invención proporciona un
nuevo agente estabilizante para materiales celulares, especialmente
sangre y productos sanguíneos, que comprende una solución acuosa de
un compuesto de metal pesado y formaldehído.
Aún en otro aspecto más de la invención, se
proporciona un agente de lisis para la diferenciación de los
leucocitos que comprende una solución de amonio o de una sal
cuaternaria de amonio y urea, siendo suficientes la concentración de
urea y el pH de la solución para evitar que los monocitos regulen a
la baja el antígeno CD14 suficientemente para permitir su detección
mediante medios inmunológicos.
La invención se describirá ahora, especialmente,
con referencia a la fabricación de preparaciones de sangre completa
estabilizada para el uso en procedimientos de control de calidad de
laboratorio, aunque se apreciará que la invención no se limita a
esto y que, por ejemplo, se pueden encontrar otros usos para las
preparaciones estabilizadas de sangre completa, las preparaciones
de leucocitos estabilizadas pueden aplicarse además como materiales
de control de calidad y que, además, los procedimientos de
estabilización descritos pueden encontrar aplicaciones en la
producción de leucocitos estabilizados de otras fuentes distintas a
la sangre, por ejemplo, linfocitos intratiroideos. Además, los
procedimientos de estabilización descritos pueden encontrar
aplicaciones en la fabricación de células estabilizadas de otras
fuentes distintas a la sangre, por ejemplo, las células
microbianas, las células vegetales y materiales similares que
derivan de tejidos vivos.
Las preparaciones de sangre completa, en esta
memoria descriptiva, incluyen preparaciones que contienen
básicamente todos los componentes de la sangre fresca y
preparaciones que contienen básicamente todos los componentes de la
sangre fresca distintas al plasma.
El procedimiento mediante el cual se consigue la
estabilización de la sangre completa conlleva una serie de etapas
que incorporan la adición de compuestos orgánicos e inorgánicos. El
procedimiento inicial de extracción de una unidad de sangre está
bien documentado y puede ser cualquiera de aquellos usados por los
practicantes de la técnica de la venosección. Se prefiere usar la
sangre con anticoagulante y están disponibles varios
anticoagulantes comerciales adecuados. No obstante, se prefiere el
uso de una sal EDTA de potasio.
De acuerdo con el primer procedimiento de la
presente invención, se puede hacer una preparación de sangre
completa estabilizada mediante la separación inicial de los
leucocitos de las células rojas, estabilizando los leucocitos y,
después, añadiendo los leucocitos estabilizados a la sangre
completa deplecionada de leucocitos. En un segundo procedimiento,
se omite la fase de separación de los leucocitos y el agente
estabilizante se añade a la sangre completa de la que se ha retirado
solamente el plasma. Estos dos procedimientos se describirán por
separado.
El procedimiento de estabilización de los
leucocitos se realiza habitualmente en las 24 horas siguientes a la
venosección pero, preferiblemente, se realiza durante las primeras
2 horas. Para separar los leucocitos de las células rojas, se usa un
nuevo procedimiento de lisis de células rojas.
La sangre fresca completa que contiene
anticoagulante, primero se centrifuga, y la lisis se realiza sobre
la capa leucocitaria que se obtiene tras la centrifugación. El
agente de lisis comprende una solución, preferiblemente una solución
acuosa, de una sal de amonio, por ejemplo, cloruro amónico, o una
sal cuaternaria de amonio y urea, o un sustituto adecuado de la
urea o un derivado de la urea. La concentración de la sal
cuaternaria de amonio se prefiere en el intervalo de 0,05 M a 0,5 M.
El pH de la solución se prefiere de 6,8 a 7,8. El tiempo de lisis
se prefiere de 5 a 20 minutos tras los cuales los leucocitos
resultantes se lavan en solución salina isotónica para eliminar los
restos celulares lisados.
Después los leucocitos se tratan primero con un
agente estabilizante que consta de un compuesto de metal pesado y,
especialmente, una sal de metal pesado. Los metales pesados
adecuados son aquellos con propiedades complejas y que tienen pesos
atómicos mayores que 20, por ejemplo, los metales de transición,
especialmente los metales de transición de los Grupos IVa a VIIa de
la Tabla Periódica, por ejemplo, manganeso, cromo, molibdeno,
vanadio y titanio, Grupo Ib, por ejemplo, cobre, y Grupo IV, por
ejemplo, plomo. Metales de transición del Grupo VIa y el Grupo VIIa
y, especialmente, el cromo y el manganeso, se prefieren
particularmente. Los compuestos adecuados incluyen sales solubles
en agua de dichos metales, especialmente sales ácidas inorgánicas,
por ejemplo, sulfatos y, especialmente, cloruros. Se han obtenido
resultados particularmente buenos usando compuestos de cloruro de
cromo CrCl_{3} y estos son los preferidos como primeros agentes
estabilizantes para el uso en la presente invención.
Los compuestos de metal pesado se usan
preferiblemente en forma de una solución en un disolvente adecuado.
Este disolvente será usualmente agua, o un medio acuoso, pero no se
excluyen la adición de pequeñas cantidades inferiores al 10% de
disolventes orgánicos adecuados que no inhibirán sustancialmente la
actividad antigénica de los leucocitos o afectarán a su
integridad.
Sin embargo, la presencia de grandes cantidades
de disolventes orgánicos es, a menudo, deletérea.
Preferiblemente, el disolvente es una solución
acuosa isotónica tamponada a un pH entre 6,5 y 7. Las soluciones
acuosas tamponadas adecuadas incluyen, por ejemplo, las soluciones
salinas tamponadas de fosfato.
El compuesto de metal pesado se disuelve
preferiblemente en el disolvente y se deja reposar la solución, por
ejemplo, durante al menos 6 horas, preferiblemente 12 horas, más
preferiblemente 48h, por ejemplo una semana antes de usarse. No se
entiende la razón por la que la realización de la solución mejora
con el reposo, pero puede deberse a la formación de especies
iónicas de metales hidroxi hidratados en la solución. Se ha
observado en algunas soluciones tamponadas de compuestos de cromo,
por ejemplo, que las soluciones recién hechas cambian de verde a
púrpura durante un periodo de 24 h, lo que indica la presencia de
complejos de iones cargados, junto con la formación de un
precipitado que puede ser especies poliméricas del cromo hidroxi.
Esto, preferiblemente, se filtra de la solución antes de usarse. La
formación de un precipitado disminuirá, por supuesto, la
concentración de iones de metal pesado en la solución y, por
supuesto, si esto ocurriese debe llevarse a cabo un análisis de la
solución para determinar si la concentración del primer agente
estabilizante se encuentra aún en el intervalo preferido.
Preferiblemente, la solución del compuesto de
metal pesado se almacena como una solución relativamente
concentrada, por ejemplo, como una solución al 1% p/v y se diluye
con el tampón adecuado antes de usarse. En dilución se puede formar
un precipitado mientras el pH aumente y deberá dejarse tiempo
suficiente para que esto ocurra antes de que se use la
solución.
La solución envejecida de compuesto de metal
pesado mantiene su efectividad durante periodos considerables de
tiempo, pero se prefiere desechar tras 12 meses y, más
preferiblemente, tras 6 meses.
La presencia del primer agente estabilizante
puede prevenir que los leucocitos muestren una autofluorescencia
excesiva y, al mismo tiempo, puede estabilizar a los leucocitos
durante un periodo mayor que 25 días. El primer agente estabilizante
se añade, preferiblemente, a la preparación de leucocitos como una
solución isotónica en la que la concentración final óptima del
primer agente estabilizante es preferiblemente menor que 1% p/v,
más preferiblemente de 0,01% a 0,5% p/v y lo más preferible de 0,05
a 0,25% p/v, por ejemplo, 0,1% p/v. La solución preferiblemente es
una solución salina tamponada de fosfato al 0,85%. El pH se ajusta
preferiblemente entre 6,5 y 7,0. Los leucocitos se exponen
preferiblemente al primer agente estabilizante durante un periodo de
incubación de 5 minutos a 18 horas pero lo más preferible es
aproximadamente 60 minutos. La temperatura de incubación está
preferiblemente entre 0ºC y 8ºC, por ejemplo, 4ºC.
Después del primer periodo de incubación, los
leucocitos se tratan preferiblemente con un segundo agente
estabilizante que puede ser, por ejemplo, un aldehído,
preferiblemente un formaldehído, el más preferible,
paraformaldehído, que puede, por ejemplo, disolverse en una
solución a una concentración final preferida de 0,1% a 0,5% p/v,
por ejemplo, 0,35% p/v.
Puede usarse cualquier aldehído adecuado donde la
autofluorescencia celular no sea un problema, por ejemplo, en
ciertas técnicas histológicas, pero en general, y en particular
cuando se preparan muestras para citometría de flujo, se necesita
mantener la autofluorescencia al mínimo. En estas circunstancias, se
prefiere el paraformaldehído ya que da lugar a la mínima
autofluoresecencia en la mayoría de los casos. Cuando se prepara la
solución de paraformaldehído es preferible mantener la temperatura
por debajo de 60ºC, con el fin de evitar la conversión del
paraformaldehído en formaldehído.
Se ha hallado que se obtienen muy buenos
resultados usando como segundo agente estabilizante una solución
acuosa de un compuesto de metal pesado y un aldehído. Este segundo
agente estabilizante combinado es útil de manera independiente en la
estabilización de materiales celulares y es, por consiguiente, un
aspecto separado de la invención.
El compuesto de metal pesado puede ser cualquiera
de aquéllos previamente descritos, y puede estar presente en la
solución en una cantidad de 0,01% a 0,5% p/v. El aldehído puede
estar presente en una cantidad de 0,1% a 0,5% p/v y, preferiblemente
el cociente entre el compuesto de metal pesado y el aldehído en la
solución está en el intervalo de 5:1 a 1:50. Preferiblemente, la
solución tiene un pH entre 6,5 y 7, y puede comprender un tampón
isotónico adecuado. Una solución preferida puede ser, por ejemplo,
una solución salina tamponada de fosfato al 0,85%. Preferiblemente
la solución además comprende un anticoagulante, y los
anticoagulantes preferidos son EDTA y heparina. La exposición al
segundo agente estabilizante es de 6 horas a 24 horas
preferiblemente, en el intervalo de temperaturas designado
arriba.
Aunque se ha hallado que cuando los compuestos de
metales pesados se usan solos tienen un efecto significativamente
estabilizante durante más de 20 días en algunos casos, en general
no se ha hallado que den estabilidad durante 60 días, lo que se
considera como una vida de almacenaje comercialmente deseable.
Se obtiene una mejora más usando una solución
combinada de un compuesto de metal pesado junto con un aldehído (en
efecto, el segundo agente estabilizante como se ha descrito
previamente, usado solo), pero se ha hallado que este tratamiento no
ofrece en todos los casos la estabilidad requerida de 60 días.
Por otro lado, el uso de los primeros y segundos
agentes estabilizantes secuencialmente, como se describirá de aquí
en adelante, puede ofrecer una estabilidad leucocitaria superior a
220 días. Se prefiere que el intervalo entre los tratamientos con
el primer y el segundo agente estabilizante sea al menos 30 minutos,
más preferiblemente al menos 1 hora, lo más preferible, al menos 12
horas, por ejemplo, 24 horas.
Tras el lavado en una solución salina tamponada
de fosfato isotónica, los leucocitos estabilizados se añaden a la
sangre completa deplecionada de leucocitos. Estos sangre completa
deplecionada de leucocitos puede, pero no necesariamente, obtenerse
de donaciones originales mediante la filtración de la sangre a
través de un filtro de leucocitos disponible comercialmente. Se
prefiere que se añadan inhibidores de crecimiento bacteriano a la
preparación final. La preparación entonces, se retiene entre 0ºC y
8ºC de 1 a 5 días antes de su uso.
Todos los pasos anteriores se prefieren llevar a
cabo bajo condiciones de esterilidad.
Para los propósitos de la presente invención, la
sangre completa deplecionada de leucocitos, que comprende células
rojas sanguíneas predominantemente, puede considerarse que está
``sin tratar'' ya que se ha hallado que no es necesario añadir un
agente estabilizante a la sangre deplecionada de leucocitos con el
fin de obtener preparaciones de sangre completa estabilizada. Es
sumamente sorprendente que sea posible obtener preparaciones de
sangre completa estabilizada simplemente mediante la estabilización
de su componente leucocitario.
En la fabricación comercial de una preparación de
sangre completa estabilizada según el Procedimiento I, es posible
juntar varias unidades de sangre donada de fuentes distintas y
separar y estabilizar los leucocitos. Entonces, se pueden juntar más
unidades de sangre de distintos donantes y deplecionar los
leucocitos. Finalmente la preparación de todos los leucocitos
estabilizados juntos se añade a la sangre deplecionada de
leucocitos para formar una preparación de sangre completa
estabilizada.
Este procedimiento es similar al descrito en el
Procedimiento I excepto en que, como se mencionó previamente, se
omite la fase de separación de los leucocitos. Por esta razón, el
Procedimiento II a menudo se preferirá para la fabricación a gran
escala de preparaciones de sangre completa.
El procedimiento de estabilización de las
muestras de sangre completa normalmente se realiza en las 24 horas
siguientes a la venosección pero se realiza preferiblemente en las
primeras 2 horas.
La sangre fresca completa, que contiene un
anticoagulante, por ejemplo, EDTA, se centrifuga primero y el plasma
se retira y se guarda.
Las células que quedan se lavan y posteriormente
se tratan con un primer agente estabilizante que comprende un
compuesto de metal pesado, que puede ser el mismo que el descrito
en el Procedimiento I.
El primer agente estabilizante se añade
preferiblemente a la preparación de sangre completa como una
solución en la que concentración del primer agente estabilizante es
preferiblemente 0,01% a 0,5% p/v. Preferiblemente, la solución es
una solución salina tamponada de fosfato al 0,85%. El pH se ajusta
preferiblemente entre 6,5 y 7,0. La sangre completa se expone
preferiblemente al primer agente estabilizante durante un periodo
de 5 minutos a 28 horas, pero lo más preferible es aproximadamente
60 minutos. La temperatura de incubación está preferiblemente entre
0ºC y 8ºC, por ejemplo, aproximadamente 4ºC.
Después del primer periodo de incubación, la
sangre completa se trata preferiblemente con un segundo agente
estabilizante que puede ser, por ejemplo, un aldehído,
preferiblemente, paraformaldehído, usando las mismas condiciones que
las descritas para el Procedimiento I. La adición de la segunda
solución de agente estabilizante puede prolongar la estabilidad de
la sangre completa más de 130 días. La exposición de la segunda
solución estabilizadora es preferiblemente de 6 horas a 24 horas,
por ejemplo, aproximadamente 18h en el intervalo de temperaturas
designado en el Procedimiento I.
Después del lavado en una solución salina
tamponada de fosfato isotónica, se vuelve a añadir el plasma a la
sangre completa estabilizada. El plasma puede, pero no
necesariamente, obtenerse de la donación original. Se prefiere
añadir a la preparación final además, inhibidores del crecimiento
bacteriano y antibióticos, por ejemplo, gentamicina. La preparación
se guarda entre 0ºC y 8ºC de 1 a 5 días antes de usarse.
En la fabricación comercial de una preparación de
sangre estabilizada según el Procedimiento II, es posible y, puede
ser preferible, juntar varias unidades de sangre donada de
diferentes fuentes y estabilizar la mezcla resultante.
Los procedimientos de estabilización de sangre
completa que se describen en la presente invención pueden aplicarse
tanto a células normales como leucémicas, proporcionando un control
normal conocido y un control anormal (leucémico).
Las preparaciones de sangre completa estabilizada
de la invención pueden proporcionar un excelente control de calidad
estable y un material de referencia que puede usarse en
inmunofenotipaje leucocitario mediante microscopía UV y citometría
de flujo. Las preparaciones son valiosas para el control de calidad
del procedimiento de lisis de sangre completa sin contaminación de
restos celulares en exceso. Las muestras estabilizadas pueden
comprender todos los leucocitos de sangre periférica normal
(granulocitos, monocitos y linfocitos) o subpoblaciones de éstos. El
procedimiento puede, bajo condiciones óptimas, conservar los
perfiles antigénicos de los leucocitos asegurando el fenotipaje y
el control de calidad del procedimiento. Los valores comunes para
los determinantes antigénicos pueden determinarse y pueden
mantenerse estables durante más de 130 días. El investigador puede,
además, encontrar satisfactoriamente valores para antígenos que
pueden ser de interés específico. Más aún, las preparaciones pueden
usarse para el control de calidad del diferencial obtenido del
citómetro de flujo. Este es un parámetro que se usa para la
monitorización de la terapia anti-viral en
individuos infectados por el VIH.
Se están desarrollando nuevos procedimientos para
el fenotipaje de muestras sanguíneas que no requieren que la muestra
sea tratada con un agente de lisis tras el marcaje. Estas técnicas
se denominan sin-lavar, sin-lisar.
Las preparaciones de sangre completa de esta invención pueden
usarse para proporcionar controles de calidad para estas técnicas y
pueden además usarse en citómetros de flujo que analizan
procedimientos sin-lavar,
sin-lisar.
En general, las preparaciones de sangre completa
estabilizada de la invención pueden usarse en controles de calidad
de técnicas de inmunofenotipaje por microscopía UV y citometría de
flujo, en técnicas de sangre completa lisada y sin lisar.
Las investigaciones con las preparaciones de
sangre completa de la invención muestran que son adecuadas además
para el uso en análisis inmunocitoquímicos usando técnicas tales
como la técnica inmunocitoquímica de la fosfatasa alcalina
anti-fosfatasa alcalina (APAAP) y pueden por
ejemplo, usarse para determinar el perfil antigénico de los frotis
de sangre periférica. Pueden usarse como material diario de
referencia o en controles de calidad externos
(inter-laboratorio). Pueden hacerse múltiples frotis
por adelantado y luego almacenarse a -20ºC hasta su uso. Los frotis
pueden marcarse a diario o usarse como controles cuando se marcan
otros frotis.
Las preparaciones de sangre completa de la
invención pueden además aplicarse como materiales de referencia
estándar para el uso en técnicas de ensayo inmunoenzimáticos (ELISA)
y en técnicas de ensayos inmunoradiométrico.
Se pueden incluir otros usos en el laboratorio de
las preparaciones de sangre completa estabilizada de la invención
tales como control de calidad y calibrador para analizadores
hematológicos, como controles de calidad para monitorizar la
deficiencia de hierro mediante la técnica de la protoporfirina de
cinc (ZPP) y como material de control de calidad en la técnica del
folato en células rojas. Finalmente, en líneas generales, las
preparaciones de sangre completa estabilizada de la invención pueden
hallar aplicación en el control de calidad de las pruebas del nivel
de glucosa en sangre posibilitando, de esta forma, que los
pacientes diabéticos puedan llevar a cabo esta técnica en sus
propios hogares.
La invención se ilustra con el siguiente
Ejemplo.
Se hace una preparación de sangre completa según
se describe debajo y sus características de envejecimiento
comparadas con una muestra de sangre completa similar sin
tratar.
1. Extraer 500 de sangre venosa en un tubo
estéril de extracción que contiene 600 mg de ácido
etilendiaminotetracético (sal disódica o trisódica) disuelto en 50
ml de tampón fosfato salino (PBS).
2. Separar la sangre no coagulada en dos partes
(250 ml cada una).
3. Filtrar un volumen de 250 ml a través de un
filtro de leucocitos para deplecionar los leucocitos. Se conserva a
4ºC.
4. Centrifugar los 250 ml restantes a 800 g
durante 1 hora.
5. Retirar la capa leucocitaria (capa de
leucocitos).
6. Completar la capa leucocitaria hasta un
volumen de 250 ml con la solución de lisis.
Solución de
lisis
Solución ``stock'' 10x pH
7,4
89,9 g de Cloruro amónico
10,0 g de Carbonato de sodio hidrógeno
370 mg de EDTA disódico
Lo anterior se disuelve en 1000 ml de H_{2}O
destilada (1,68M NH_{4}Cl). Diluir a una concentración 2x con H2O
destilada y luego añadir un volumen igual (1:1) de urea 2M (la urea
disuelta en H_{2}O destilada) para obtener una solución final de
análisis 1x a pH 7,5.
7. Lisar durante 5 minutos en la oscuridad a
temperatura ambiente.
8. Centrifugar durante 3 minutos a 800 g y
decantar el sobrenadante.
9. Lavar mediante centrifugación a 800 g 3x con
tampón fosfato salino (PBS). Decantar el sobrenadante final.
10. Resuspender el sedimento celular en 20 ml de
PBS.
11. Añadir 60 ml de cloruro crómico hexahidrato
al 0,1% envejecido (> 1 mes) e incubar durante 1 hora en
oscuridad a 4ºC agitando de vez en cuando.
12. Centrifugar durante 3 minutos a 800 g y
decantar el sobrenadante.
13. Resuspender en 20 ml de PBS y añadir 60 ml de
cloruro crómico hexahidrato al 0,1% envejecido
\hbox{(> 1
mes)} y filtrado a pH 6,7 en paraformaldehído 0,35% en PBS.
Incubar a 4ºC en oscuridad durante 16-22 horas.
14. Centrifugar a 800 g durante 3 minutos y
decantar el sobrenadante.
15. Lavar dos veces como en 9.
16. Resuspender los leucocitos en la sangre
completa deplecionada de leucocitos como se detalla en 3. Añadir
antibióticos de amplio espectro tales como la gentamicina,
ciprofloxacina.
17. Conservar a 4ºC durante 2-3
días hasta su uso.
Tampón fosfato salino pH
7,2
7,83 g/l de cloruro sódico
0,36 g/l de EDTA disódico
0,28 g/l de cloruro potásico
0,26 g/l de fosfato potásico dihidrogenado
(monobásico)
2,35 g/l de fosfato disódico hidrogenado
(dibásico)
Los resultados comparativos se ilustran en las
figuras adjuntas en las que:
La figura 1 muestra las características de
citometría de flujo de la sangre fresca tras marcarse para los
antígenos CD3, CD4, CD8 y CD20. El marcaje se llevó a cabo empleando
la técnica de lisis de sangre completa y los niveles positivos en
relación con los controles negativos (a) Características dispersión
por tamaño y complejidad (FSC y SSC), (b) CD3PE y CD20 FITC, (c)
CD3 FITC y CD4 PE, (d) CD3 FITC y CD8 PE.
La figura 2 muestra el efecto del envejecimiento
en la sangre ``fresca'' sin estabilizar durante 8 días sobre el
análisis FSC y SSC por citometría de flujo (a) Día 1, (b) Día 2,
(c) Día 3, (d) Día 8.
Las figuras 3a y 3b muestran el efecto del
envejecimiento sobre la expresión de los antígenos descritos en la
figura 1b, c y d durante un periodo de 10 días 3a (i) (ii) (iii)
Día 1 y 3b (i) (ii) (iii) Día 10.
Las figuras 4a y 4b muestra la estabilidad de las
características FSC, SSC y del control negativo, determinadas por
citometría de flujo, sobre una preparación de sangre completa
estabilizada durante un periodo de 57 días, 4 a día 2, 4b día
57.
Las figuras 5a y 5b muestran la estabilidad de
los antígenos descritos en la figura 1b, c y d, medidos mediante
citometría de flujo, durante un periodo de tiempo de 57 días 5a Día
2, 5b día 57.
La figura 6 muestra el efecto del almacenamiento
sobre la citometría de flujo del diferencial de leucocitos de
sangre ``fresca'' durante un periodo de 8 días. Después del día 8
no fue posible realizar más análisis debido al marcado deterioro de
la muestra. Para el análisis se usó un citómetro de flujo
FACScan.
La figura 7 muestra la estabilidad en la
citometría de flujo del diferencial de una preparación de sangre
estabilizada durante un periodo de 22 días. Para el análisis se usó
un citómetro de flujo FACScan.
El perfil de citometría de flujo en la figura 1
muestra la posición normal de los linfocitos, monocitos y
granulocitos tras la lisis de las células rojas. Las
características del marcaje de antígenos se muestran además en la
figura 1b, c, d y e. Mientras que aumenta la ``edad'' de la muestra
(figura 2) se alteran la citometría de flujo y las características
de la expresión de antígenos. A día 8 la cantidad de restos
celulares hace que el análisis sea insatisfactorio. Las
características del marcaje fluorescente también se deterioran como
se muestra en la figura 3.
La figura 4 muestra las características de la
dispersión por tamaño y complejidad junto con el control negativo
de una muestra estabilizada a día 2 y a día 57. Las poblaciones se
mantienen separadas en sus posiciones respectivas inmediatamente
después de la estabilización. Después de 57 días de conservación
las características citométricas de dispersión por tamaño y
complejidad permanecen intactas (figura 4b). Además las
características de la expresión antigénica permanecen inalterables
durante este periodo (figura 5).
La preparación de sangre completa estabilizada
puede usarse para monitorizar el diferencial de leucocitos. Usando
una combinación específica de anticuerpos dirigidos contra los
antígenos CD14 y CD45, pueden generarse tres poblaciones distintas.
La figura 7 muestra la estabilidad de este parámetro, mientras que
la figura 6 muestra la inestabilidad de la sangre completa
``fresca'' durante un periodo de 8 días. El análisis de la última
tras este tiempo se suspendió debido a la contaminación con
excesivos restos celulares.
Se hace una preparación de sangre completa
estabilizada como se describe debajo y se comparan sus
características de envejecimiento con una muestra de sangre
completa sin tratar.
1. Extraer una unidad de 500 ml de sangre venosa
en un tubo estéril de extracción que contiene 600 mg de ácido
etiléndiaminotetraacético (sal disódica o tripotásica) disueltos en
50 ml de solución salina de tampón fosfato (PBS) a pH 7,2, como en
el Ejemplo 1.
2. Centrifugar la unidad a 800 g durante 1 hora.
Retirar y conservar el plasma.
3. Lavar las células que quedan dos veces con
solución salina de tampón fosfato (PBS) estéril.
4. Eliminar el sobrenadante de PBS.
5. Añadir 300 ml de cloruro crómico hexahidrato
filtrado al 0,1 % (pH 6,7) en PBS envejecido
\hbox{(> 1
mes)} e incubar durante 1 hora en oscuridad a 4ºC agitando de
vez en cuando.
6. Centrifugar durante 45 minutos a 800 g y
decantar el sobrenadante.
7. Resuspender en 300 ml de cloruro crómico
hexahidrato filtrado al 0,1% envejecido (> 1 mes) a ph 6,7 en
paraformaldehído al 0,35% en PBS. Incubar a 4ºC en oscuridad
durante 16-22h.
8. Centrifugar a 800 g durante 45 minutos y
decantar el sobrenadante.
9. Lavar dos veces mediante centrifugación a 800
g con PBS. Decantar el sobrenadante final.
10. Resuspender la sangre completa estabilizada
en el plasma detallado en el paso 2. Añadir antibióticos de amplio
espectro tales como la gentamicina, ciprofloxacina.
12. Guardar a 4ºC durante 2-3
días hasta su uso.
Los resultados se ilustran en las figuras
adjuntas en las que:
Las figuras 8a y 8b muestran la estabilidad del
FSC y SSC y las características del control negativo, determinadas
por citometría de flujo, sobre la preparación de sangre completa
estabilizada durante un periodo de 60 días, 4a Día 3, 4b Día
60.
Las figuras 9a y 9b muestran la estabilidad de
los antígenos CD3, CD4, CD8, CD19 y CD16 + CD56, medidas por
citometría de flujo, durante un periodo de 57 días 5a Día 3, 5b Día
60.
La figura 10 muestra la estabilidad del
diferencial de citometría de flujo de la preparación de sangre
estabilizada durante un periodo de 25 días. El análisis se hizo
usando un citómetro de flujo FACScan.
La figura 11 muestra la estabilidad en el nivel
de protoporfirina de cinc (ZPP) en una preparación de sangre
completa estabilizada durante un periodo de 36 días medida en
\mumoles ZPP/ moles de hemoglobina.
La figura 12 muestra la estabilidad del recuento
total de células blancas u del recuento total de linfocitos durante
un periodo de 117 días para una muestra de una preparación de
sangre completa estabilizada medida usando un analizador
hematológico Toa (Sysmex) NE8000.
Finalmente, la figura 13 muestra la medida del
folato de células rojas en muestra de preparaciones de sangre
completa estabilizada y en sangre fresca almacenada durante un
periodo de 50 días.
El perfil de citometría de flujo en la figura 1
muestra la posición normal de los linfocitos, monocitos y
granulocitos después de la lisis de las células rojas. Las
características del marcaje de antígenos también se muestran en la
figura 1b, c, d y e. Mientras aumenta la edad de la muestra (figura
2), se alteran las características de la expresión antigénica. A
día 8, la cantidad de restos celulares hace que el análisis sea
insatisfactorio. Las características del marcaje fluorescente
también se deterioran como se muestra en la figura 3.
Las figuras 8a y 8b muestran las características
de la dispersión por tamaño y complejidad junto con el control
negativo de la muestra estabilizada a día 3 y día 60. Las
poblaciones se mantienen separadas en sus posiciones respectivas
inmediatamente después de la estabilización. Después de 60 días de
conservación las características de citometría de flujo de
dispersión por tamaño y complejidad permanecen intactas (figura 4b).
Además, las características de expresión antigénica permanecen
inalteradas durante este periodo (figura 9a y 9b). Se mantuvieron
los mismos parámetros en la máquina completamente. Estos resultados
muestran la marcada superioridad de la preparación de sangre
estabilizada de la invención sobre el ``control'' no estabilizado,
mostrada en las figuras 1 a 3.
La preparación de sangre estabilizada puede
usarse para monitorizar el diferencial de leucocitos. Usando una
combinación específica de anticuerpos dirigidos contra los
antígenos CD14 y CD45, se pueden separar tres poblaciones
diferentes. La figura 10 muestra la estabilidad de este parámetro
durante 25 días, mientras que en la figura 6 se muestra la
inestabilidad de la sangre completa fresca durante un periodo de 8
días. El análisis de la última se suspendió transcurrido este tiempo
debido a la contaminación excesiva con restos celulares.
Como se muestra en la figura 11, los niveles de
ZPP en la preparación de sangre completa estabilizada permanecen,
básicamente, constantes, con sólo un ligero aumento tras 36 días.
De manera similar, como se muestra en la figura 12, el recuento
total de células blancas y el recuento total de linfocitos está
apenas afectado también durante un periodo de tiempo de 117
días.
La figura 13 muestra una mejora muy significativa
obtenida en la estabilidad del folato de células rojas usando
preparaciones de sangre completa estabilizada según la
invención.
El procedimiento del Ejemplo 2 se repite usando
soluciones al 0,1% p/v de varias sales metálicas en solución salina
de tampón fosfato al 0,85% en el paso 5. La estabilidad de las
preparaciones de sangre resultantes tras 8 y 12 días, determinadas
por las características de FSC, SSC y del control negativo, se
miden usando un citómetro de flujo. Los resultados se estiman como
bueno, pasa o falla, mediante observación visual de los resultados
de las gráficas, y mediante el uso del programa de Becton Dickinson
Simulset versión 2.3.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|}\hline
Compuesto \+ Falla \+ Pasa \+ Bueno \\\hline CrCl _{3} ( >
1 día) \+ \+ \+ X \\ CrCl _{3} (tras 16 meses) \+ \+ X \+ \\
Cr _{2} (SO _{4})_{3} \+ \+ X \+ \\ CrF _{3} \+ \+ X
\+ \\ Cr(NO _{3})_{3} \+ \+ \+ X \\
Cr(acetato) _{3} \+ \+ X \+ \\ MnCl _{2} \+ \+
\+ X \\ PtCl _{2} \+ X \+ \+ \\ ScCl _{2} \+ \+ X \+ \\
VCl _{3} \+ \+ \+ X \\ WCl _{4} \+ \+ X \+ \\ SnCl _{2}
\+ \+ \+ X \\ ZnCl _{2} \+ X \+ \+ \\ CeCl _{3} \+ X \+ \+
\\ MgCl _{2} \+ X \+ \+ \\ AlCl _{3} \+ X \+ \+ \\ CuCl _{2}
\+ X \+ \+ \\ CuSO _{4} \+ \+ \+ X \\ MOCl _{3} \+ \+ \+
X \\ Pb(NO _{3} ) _{2} \+ X \+ \+ \\ FeCl _{3}
\+ X \+ \+ \\ TiCl _{3} \+ \+ \+ X \\ K _{2} Cr _{2} O _{7}
\+ \+ X \+ \\\hline\multicolumn{4}{|c|}{Resultados pasados 12
días}\\\hline CrCl _{3} ( > 1 día) \+ \+ \+ X \\ CrCl _{3}
(tras 16 meses) \+ \+ X \+ \\ Cr _{2} (SO _{4})_{3} \+
\+ X \+ \\ CrF _{3} \+ X \+ \+ \\ Cr(NO _{3})_{3} \+
\+ X \+ \\ Cr(acetato) _{3} \+ X \+ \+ \\
MnCl _{2} \+ \+ \+ X \\ PtCl _{2} \+ X \+ \+ \\ ScCl _{2}
\+ X \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
\newpage
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|}\hline
Compuesto \+ Falla \+ Pasa \+ Bueno
\\\hline\multicolumn{4}{|c|}{Resultados pasados 12 días}\\\hline
VCl _{3} \+ X \+ \+ \\ WCl _{4} \+ X \+ \+ \\ SnCl _{2} \+ X
\+ \+ \\ ZnCl _{2} \+ X \+ \+ \\ CeCl _{3} \+ X \+ \+ \\
MgCl _{2} \+ X \+ \+ \\ AlCl _{3} \+ X \+ \+ \\ CuCl _{2} \+
X \+ \+ \\ CuSO _{4} \+ X \+ \+ \\ MOCl _{3} \+ X \+ \+ \\
Pb(NO _{3})_{2} \+ X \+ \+ \\ FeCl _{3} \+ X \+ \+ \\
TiCl _{3} \+ X \+ \+ \\ K _{2} Cr _{2} O _{7}
\qquad\qquad \+ X \+ \+ \\ \+ \+ X \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Estos resultados muestran la superioridad de los
compuestos de metales de los grupos VIa y VIIa sobre otros
compuestos de metales pesados, aunque varios de estos últimos se
consideraron aceptables, puesto que se obtuvo una mejora en la
estabilidad frente a un control sin estabilizar, que mostró un
deterioro sustancial después de sólo 4 días.
Se halló que la solución envejecida de cloruro
crómico (16 meses) fue menos efectiva que la solución preparada
recientemente (> 1 día), presumiblemente debido a la formación de
complejos de especies iónicas de cromo hidratado en la solución o a
la precipitación de especies poliméricas de hidróxido de cromo
insolubles que dejan la solución delecionada de iones de cromo.
La atención del lector se dirige hacia los
artículos y documentos que se archivan simultáneamente con esta
memoria descriptiva y que están abiertos a la inspección pública con
esta memoria descriptiva, y los contenidos de todos estos artículos
y documentos se incorporan en la presente invención mediante
referencia.
Todas las características descritas en esta
memoria descriptiva (incluyendo cualquiera de las reivindicaciones,
resumen y figuras adjuntas) y/o todos los pasos o cualquiera de los
procedimientos así descritos, pueden combinarse de cualquier forma,
excepto en combinaciones donde al menos una de las características
y/o pasos son mutuamente excluyentes.
Cada características descrita en esta memoria
descriptiva (incluyendo cualquiera de las reivindicaciones, resumen
y figuras adjuntas), puede sustituirse por características
alternativas que sirvan para un propósito igual, equivalente o
similar, salvo que se indique lo contrario. Por lo que, salvo que se
indique lo contrario, cada característica descrita es un ejemplo
sólo de una serie genérica de características equivalentes o
similares.
Claims (53)
1. Una preparación celular que comprende
leucocitos estabilizados, en la que el agente estabilizante
comprende una cantidad efectiva de un compuesto de metal pesado.
2. Una preparación celular según la
reivindicación 1, en la que la preparación celular es una
suspensión celular.
3. Una preparación celular según las
reivindicaciones 1 y 2, en la que la preparación celular es una
preparación de sangre completa.
4. Una preparación celular según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en la que el metal pesado es un metal
de transición.
5. Una preparación celular según la
reivindicación 4, en la que el metal de transición es un metal del
Grupo VIa o del Grupo VIIa.
6. Una preparación celular según la
reivindicación 5, en la que el metal de transición es el cromo.
7. Una preparación celular según cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en la que el compuesto es una
sal.
8. Una preparación celular según la
reivindicación 7, en la que la sal es una sal de un ácido
inorgánico, especialmente, un cloruro.
9. Una preparación celular según cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en la que el agente estabilizante
es el cloruro crómico.
10. Una preparación celular según cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en la que el agente estabilizante
es una solución envejecida de una sal de metal pesado.
11. Una preparación celular estabilizada según
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el agente
estabilizante comprende una cantidad efectiva de un aldehído.
12. Una preparación celular estabilizada según la
reivindicación 11, en la que el aldehído es paraformaldehído.
13. Un procedimiento de estabilización de una
preparación celular que comprende la adición de una cantidad
estabilizante efectiva de un primer agente estabilizante que
comprende una solución tamponada envejecida de un compuesto de metal
pesado.
14. Un procedimiento de estabilización de una
preparación celular que comprende la adición de una cantidad
estabilizante efectiva de un primer agente estabilizante que
comprende una solución acuosa isotónica de un compuesto de metal
pesado.
15. Un procedimiento según las reivindicaciones
13 ó 14, en el que la preparación celular es una suspensión
celular.
16. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15, en el que la preparación celular
comprenda leucocitos.
17. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 16, en el que la preparación celular es una
preparación de sangre completa.
18. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 17, en el que el metal pesado es un metal de
transición.
19. Un procedimiento según la reivindicación 18,
en el que el metal de transición es un metal del Grupo VIa o del
Grupo VIIa.
20. Un procedimiento según la reivindicación 19,
en el que el metal de transición es cromo.
21. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 20, en el que el compuesto es una sal.
22. Un procedimiento según la reivindicación 21,
en el que la sal es una sal de un ácido inorgánico, especialmente,
un cloruro.
23. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 22, en el que el agente estabilizante es
cloruro crómico.
24. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 23, en el que el primer agente estabilizante
se añade a la preparación celular en cantidad suficiente para
llegar a una concentración final de solución acuosa de 0,01% a 0,5%
p/v.
25. Un procedimiento según la reivindicación 24,
en el que el pH de la solución es de 6,5 a 7,0.
26. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 25, en el que las células se exponen al
primer agente estabilizante durante un periodo de 5 minutos a 18
horas a una temperatura entre 0ºC y 8ºC.
27. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 26, en el que el primer agente estabilizante
comprende una solución acuosa de un compuesto de metal pesado que
se ha envejecido durante al menos 24 horas.
28. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 27, en el que se añade un segundo agente
estabilizante a la preparación.
29. Un procedimiento según la reivindicación 28,
en el que el segundo agente estabilizante es un aldehído.
30. Un procedimiento según la reivindicación 29,
en el que el aldehído es paraformaldehído.
31. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 30, en el que el segundo agente estabilizante
se añade en una cantidad de 0,1% a 0,5% p/v en solución acuosa.
32. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 31, en el que el segundo agente estabilizante
comprende una solución acuosa de una aldehído y un compuesto de
metal pesado que tiene un pH en el intervalo de 6,5 a 7,0.
33. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 32, en el que la preparación celular se
expone al segundo agente estabilizante durante un periodo entre 6 y
24 horas a una temperatura entre 0ºC y 8ºC.
34. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 33, en el que los segundos agentes
estabilizantes se añaden a la preparación celular
secuencialmente.
35. Una preparación celular estabilizada según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, preparada mediante un
procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 24.
36. Un procedimiento según la reivindicación 17,
en el que la preparación de sangre completa se ha obtenido juntando
las muestras de diferentes donaciones de sangre.
37. Un material de control de calidad para el uso
en inmunofenotipaje de leucocitos que comprende una preparación de
sangre completa estabilizada según la reivindicación 3.
38. Un procedimiento para el control de calidad
del inmunofenotipaje de leucocitos, en el que se usa como material
de referencia de control de calidad una preparación de sangre
completa según la reivindicación 3.
39. Un procedimiento para el control de calidad
de técnicas de monitorización sanguínea de la protoporfirina de
cinc, el folato de células rojas, recuento total de células blancas
y recuento de linfocitos en las que se una como material de
referencia de control de calidad una preparación de sangre completa
según la reivindicación 3.
40. Una preparación de sangre completa
estabilizada que comprende una preparación de leucocitos según la
reivindicación 1.
41. Un procedimiento de fabricación de una
preparación de sangre completa estabilizada que comprende la adición
de una preparación de leucocitos estabilizados según la
reivindicación 1 a sangre completa deplecionada de leucocitos.
42. Un procedimiento según la reivindicación 41,
en el que la sangre completa deplecionada de leucocitos se ha
obtenido mediante filtración de la sangre a través de un filtro de
leucocitos.
43. Un agente estabilizante para uso en
materiales celulares estabilizantes que comprende una solución
acuosa de un compuesto de metal pesado y paraformaldehído.
44. Un agente estabilizante según la
reivindicación 43, en el que el metal pesado es un metal de
transición.
45. Un agente estabilizante según la
reivindicación 44, en el que el metal de transición es un metal de
transición del Grupo VIa o del Grupo VIIa.
46. Un agente estabilizante según la
reivindicación 45, en el que el metal de transición es cromo.
47. Un agente estabilizante según cualquiera de
las reivindicaciones 43 a 46, en el que el compuesto es una
sal.
48. Un agente estabilizante según cualquiera de
las reivindicaciones 43 a 47, en la que la sal es una sal
inorgánica, especialmente, un cloruro.
49. Un agente estabilizante según cualquiera de
las reivindicaciones 43 a 48, en el que el compuesto de metal
pesado es el cloruro crómico.
50. Un agente estabilizante según cualquiera de
las reivindicaciones 43 a 49, en el que el compuesto de metal
pesado está presente en una cantidad de 0,01% a 0,5% p/v y el
paraformaldehído está presente en una cantidad de 0,1% a 0,5%
p/v.
51. Un agente estabilizante según cualquiera de
las reivindicaciones 43 a 50, en el que el cociente entre el
compuesto de metal pesado y el aldehído es de 5:1 a 1:50.
52. Una preparación de sangre completa
estabilizada que comprende leucocitos estabilizados según la
reivindicación 1 y células rojas sanguíneas sin tratar.
53. Un procedimiento según la reivindicación 17,
en el que el primer agente estabilizante se añade a la preparación
de sangre completa de la que se ha retirado el plasma.
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