DE2061984A1 - Reagens zur Bestimmung der Lactat-Dehydrogenase im Farbtest - Google Patents

Reagens zur Bestimmung der Lactat-Dehydrogenase im Farbtest

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DE2061984A1 DE19702061984 DE2061984A DE2061984A1 DE 2061984 A1 DE2061984 A1 DE 2061984A1 DE 19702061984 DE19702061984 DE 19702061984 DE 2061984 A DE2061984 A DE 2061984A DE 2061984 A1 DE2061984 A1 DE 2061984A1
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Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. E Wkickmann,
Dipl.-Ing. H.Weickmann, Dipl.-Piiys. Dr.K.Fincke Djpl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Hubeii
• · 8 MÜNCHEN 86, DEN
POSTFACH S6O82O HGK MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 42 3921/22
Boehringer Mannheim GnibH, 68 Mannheim . Sandh'ofer Str. 112-132
•Reagens zur Bestimmung der Lactat-Dehydrogenase im Färbtest
Die Erfindung betrifft ein Reagens zur Bestimmung der Laetat-Delrydrοgenäse, welches gegenüber den bisher bekannten Reagentieii für diesen Zweck verbesserte Eigenschaften aufweist.
Für die Bestimmung der Lactat-Dehydrogenase, insbesondere im Serum, hat sich der Färbtest von Hochella und Weinhouse (Anal.' Biochem. JJ5, 322 (1965)) zu einer Standardmethode entwickelt, die insbesondere Bedeutung hat für die Durchführung der Bestimmung in automatisierten Analysenvorrichtungen.
Durch Serum-Lactat-Dehydrogenase (LDH) wird die Oxydation von L-Lactat zu Pyruvat katalysiert, wobei gleichzeitig FAD (Mcotin-adenin-dinucleotid) zu UADH (reduziertes Nicotin-adenin-di~ nucleotid) reduziert wird. Diese Reaktion kann photometrisch im Ultravioletten gemessen werden. Vorteilhaft ist jedoch eine Meßwellenlänge im sichtbaren Bereich. Im oben erwähnten Farbtest wird daher in einer angekoppelten Reaktion mit Hilfe des Enzyms Diaphorase gebildetes NADH durch ein Tetrazoliumsalz (üblicherweise 3~p-Nitrophenyl-2-p-jodphenyltetrazoliumchlorid i= INT) oxydiert, wobei das Tetrazoliumsalz zum gefärbten Formazan reduziert, welches im Sichtbaren (500 nm)_photometrsich bestimmt werden kann. . .
209828/0187 "^"
Die Bestimmung läßt sich durch folgende Gleichungen wiedergeben:
Serum-LDH
L(+)-Iactat + NAD^r ^ Pyruvat + NADH
Diaphorase
NADH + HTT -<r- 2^ MD + Formazan
Zur Durchführung dieses Farbtestes sind Reagent ien-Koinbina-P tionen im Handel, die eine NAD/Diaphorase-Mischung umfassen. Diese als lyophilisiertes Pulver oder eingefrorene Lösung vorliegende Mischung enthält eine Diaphorase, die aus Clostridium cluyveri gewonnen wird. Dieses bekannte Reagens ist nicht nur teuer, bedingt durch das Ausgangsmaterial, aus dem die Diaphorase hergestellt wird, sondern weist auch eine ungenügende Beständigkeit auf.
Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines verbesserten Reagens zur Bestimmung der LDH im Färbtest, welches wesentlich stabiler ist und zudem einfacher und aus billigerem Ausgangsmaterial hergestellt werden kann.
Das erfindungsgemäße Reagens zur Bestimmung der LDH im Färbtest, enthaltend Serumalbumin, Diaphorase und IS&D sowie gegebenenfalls Puffersubstanzen und Stabilisatoren in vorgemischtem Zustand, ist dadurch gekennzeichnet, daß es eine Schweineherz-Diaphorase enthält, welche aus der in 1,6 bis 2,8 M Ammon-Sulfat-Lösung unlöslichen Proteinfraktion von Schweineherz durch Behandlung mit 0,1 bis 0,3 Gew.-$ Polyäthylenimin bezogen auf das Volumen der Proteinlösung, Hitzeschritt bei 70 bis 80° C und Adsorption und Elution an einem Kationenaustauscher gewonnen wird.
209828/0187
Die Herstellung der im erfindungsgemäßen Reagens enthaltenen Schweineherz-Diaphorase erfolgt im wesentlichen, indem homogenisierter Herzpressrückstand mit verdünnter Ammonsulfat-Lösung extrahiert, aus dem Extrakt die bei 1,6 bis 2,8 M amrnonsulfatunlösliche Fraktion gewonnen, nach Auflösen und Dialyse zur Entfernung von Ammonsulfat mit Polyäthylenimin versetzt, der Überstand wenige Minuten auf vorzugsweise 75° C .erhitzt und1 nach Entfernung des Niederschlags an schwachsaurem Kationenaustauscher adsorbiert und durch Erhöhung der PuffersalK-konzentration wieder eluiert wird. Aus dem Eluat wird das gewünschte Protein in üblicher Weise gewonnens beispielsweise durch Ausfällung, auflösen in dem für das Reagens gewünschten Puffer, Zusatz von Stabilisatoren und gegebenenfalls IiAD und Gefriertrocknung des so erhaltenen Reagens.
Als Kationenaustauscher wird vorzugsweise ein carboxymethyl- \ äthergruppentragendes, dreidimensionalvernetztes Dextran verwendet, welches im Handel z. B. unter der Bezeichnung CM-Sephadex erhältlich ist.
Als Puffer wird vorzugsweise ein Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5 bis 7,3 verwendet. Bevorzugte Stabilisatoren sind Saccharose und Alkaliazid, die zweckmäßig gemeinsam im Reagens enthalten sind. Eine bevorzugte Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Reagens besteht demgemäß aus
0,003 bis 0,01 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5
bis 7,3,
0,5 bis 5 g/l Rinderserumalbumin, 4 bis 12 g/l NAD,
0,7 bis 3 IU/ml Schweineherz-Diaphorase,
3 bis 20 g/l Saccharose und · 0,1 bis 3 g/l Natriumazid.
209828/0187
- 4 Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung besteht aus
0,005 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, 1,5 g/l Seruinalbumin, 6 g/l KAD,
1 bis 1,5 IU/ml Diaphorase, 5 bis 10 g/l Saccharose und 1 g/l Natriuinazid,
Die Angabe "g/l" bzw. "IU/ml" bezieht sich auf das Reagens als Lösung bzw. eine trockene Pulverndschung, die bei Auflösung in der vorgeschriebenen Menge Lösungsmittel die angegebene Zusammensetzung aufweist.
Das erfindungsgemäße Reagens ist nicht nur aus billigerem und leichter zugänglichem Ausgangsmaterial und nach einfacherem Verfahren -hergestellt, sondern besitzt überraschenderweise auch eine überlegene Haltbarkeit sowie allgemein günstige Gebrauchseigenschaften, wie insbesondere leichte Löslichkeit.
Um die überlegene Stabilität des erfindungsgemäßen Reagens gegenüber einem bekannten, handelsüblichen Reagens mit einem Gehalt an Diaphorase aus Cl. cluyveri zu zeigen, wurden beide Reagentien auf ihre Lagerungsfähigkeit bei +40C als fertige Reagenelösungen untersucht. Zu bestimmten Zeitabständen wurde"der NAD-Gehalt enzymatisch mit Alkohol-Dehydrogenase und der Diaphorase-Gehalt mit INT und NADH bei pH 8,8 und 37,0° C gemessen. Die Meßung erfolgte bei 492 nm. Als NADH-regenerierendes System wurde Lactat-Dehydrogenase, Lactat und NAD verwendet. Die Ergebnisse zeigt·die folgende Tabelle.
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Stabilität der fertigen Reagen.s-Lo.sun.gen
NAD/Diaphorase (Herz;;
NAD/Diaphorase (Cl. cluyveri);
Lagerung: +40C (Kühlschrank)
lest: KAD enzymatisch mit ADH
Diaphorase mit INT und HADH; pH = 8,8; 37° C; 492 μ.
(LDH; Lactat und NAD als NADH-regenerierendes System)
Lagerung erfindungsgemäßes Reagens NAD
mg/ml		 % Jerz-DiaOhorase
U/ml		 * bekanntes fo Reagens 1 f>
Oft Tage NAD
mg/ml		 Cl. cluyveri
Diaphorase
U/ml
OO 5,12 100 1,25 Z 1° # 100 100 100
"ν. - 5,19 101 1,19 95,5 3,86 95 0,22 + 10 f> 95,5
2 1 5,06 99 1,40 112 3,68 90,5 0,21 57
14 5,0 98 1,35 107 3,50 75 0,12 71
21 5,0 ■ 98 1,14 91,5 2,94' 89 0,15 47,5
27 3,44 0,10
206Ί984
Zur v/eiteren Untersuchung der Stabilität des erfindungsgemäßen Reagens wurde dieses als Lyophilisat längere 2eit bei einer Temperatur von + 33° C aufbewahrt. Als Indikator für die Stabilität diente die verbleibende Diaphorase-Aktivität pro ml fertiger Reagenslösung, wozu 530 bis 550 mg Lyophilisat in je 4-0 ml destilliertem Wasser gelöst wurden. Zur AktivitätsbeStimmung der Diaphorase wurde folgender Inkubationsansatz verwendet:
In die Küvette wird in folgender Reihenfolge einpipettie.rt:
0,1 M Lactat/0,1 M Trispuffer, pH 8,8 INT-Lösung (625 mg/l)
NAD-Lösung (1,5 .g/250'ml 0,07 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,4)
LDH-Lösung (1 mg/ml; 360 ü/mg)
2,00 ml 0,30 ml
0,14 ml 0,01 ml
Start durch Zugabe von
NAD/Diaphorase-Reagens gemäß Erfindung (1 : 10 verdünnt)
0,05 ml
Bei 37° C wird die Extinktionsdifferenz pro Min. bei 492 nm abgelesen, im lineraren Bereich der Kinetik wird gemittelt.
Zur Berechnung der Aktivität wird für INT ein Extinktionskoeffizient von 20,4 (cm x μΜοΙ "* ) eingesetzt. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:
Lagerung bei + 33° C Diaphorase
Tage IU/ml Reagens
0 1,0 - 1,1
6 0,77 - 0,85
20 0,78 - 0,86
65 0,75 - 0,83
209828/0187
Die obigen Werte zeigen, daß·das erfindungsgemäße Reagens selbst bei 2-monatiger Lagerung bei einer Temperatur von + 33° C voll gebrauchsfähig bleibt. Die fertige Reagenslösung zeigte nach 10-wöchiger Lagerung bei - 10° C völlig unveränderte Diaphorase-Aktivität.
In der praktischen Anwendung -wird das erfindungsgemäße Reagens, wie vorstehend beschrieben, eingesetzt.
Aufgrund seiner überlegenen Eigenschaften eignet sich das erfindungsgemäße Reagens insbesondere zum Einsatz in automatisierten Analysenvorrichtungen und verbessert deren Anwendungsmöglichkeit und Zuverlässigkeit=
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Beispiel 1 ' ·
Der Preßrückstand von 600 kg Schweineherzen wird homogenisiert und mit 900 1 1 M Ammonsulfat~Lösung extrahiert. Fach Abfiltrieren vom Unlöslichen wird auf 1,64 M Ammoniumsulfat gebracht, der Niederschlag abgetrennt und^der Überstand auf 2,8 M Ammonsulfat gebracht. Der Niederschlag wird abfiltriert, in 0,01 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0 aufgenommen und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Dann wird mit 2 VoI*-$ einer 10-Gew.-$-igen Polyäthylenimin-Lösung versetzt, der Niederschlag abfiltriert und der tJberstand 5 Min. auf 75° C erhitzt. Nach Abtrennung des Niederschlags wird der Überstand auf pH 5,7 gebracht und mit·100 g CM-Sephadex O versetzt. Dann wird der Anionenaustauscher abfiltriert, gewaschen und mit 0,2 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6,0 eluiert.
209828/0187
206198A
Au?j d.tiirt Illuat wird die Diaphorase bei pH 7,0 mit Ammoniumsulfat gefällt, der Niederschlag in 0,01 H Kai iumplio spha t~ pii.i"fer, pH 7,0 aufgenommen, dialysiert und das Dialysat mit den übrigen Bestandteilen des erfindungsgemäßen Reagens versetzt und lyophilisiert.
Die Ausbeute beträgt 42 g Diaphoraoe (ca. 170 g Lyophilisat), spezifische Aktivität mehr als 10 IU/nig Protein,
Beiopiöl 2
100 ml 0,005 H Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0 enthalten:
150 mg Rinderserumalbumin,
600 mg NAD,
100 IU Diaphorase,
1 g Saccharose,
100 mg ITatriumazid.
209828/0187

Claims (6)

  1. E.eagens zur Bestimmung der Iiactat-Dehydrogenase im Farbtest, enthaltend Serumalbumin, Diaphorase, NAD sowie gegebenenfalls Paffersubstanzen und Stabilisatoren, dadurch gekennzeichnet, daß gs eine Schv/eineherzdiaphorase enthält, welche aus der in 1,6 bis 2,8 M Ammonsulfat unlöslichen Proteinfraktion von Schweineherz durch Behandlung mit 0,1 bis OS5 % G-ev^./Vol. Polyäthylenimin, Hitzeschritt bei 70 bis 80n C, Adsorption an schwach sauren Kathionenaustauscher und Elution desselben geviomien wird.
  2. 2.) Reagens'nach Anspruch 1, bestehend aus
    Puffer. pH 6,5 bis 7,3,
    0,5 bis 5 g/l Rinderserumalbuminj
    4 bis 12 g/l SAD,
    0,7 bis 3 Iü/ml Maphorase, ■3 bis 20 g/l Saccharose, 0,1 bis 3 g/l Azid.
  3. 3.) Reagens nach Anspruch 2r bestehend aus
  4. 0,002 bis 0,01 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0
  5. 1»5 g/l Serumalbumin,
  6. 6 g/l HAD,
    1 Iü/ail Diaphorase,
    5 bis 10 g/l Saccharose, 1 g/l Katriuinazid.
    209828/0187
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