DE2537127B2 - Kontrollserum fuer die klinischchemische analyse mit einem bestimmten gehalt an alkalischer phosphatase - Google Patents
Kontrollserum fuer die klinischchemische analyse mit einem bestimmten gehalt an alkalischer phosphataseInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein KontroHserum für die klinisch-chemische Analyse mit den im Oberbegriff
des Patentanspruchs 1 angegebenen Merkmalen, sowie ein Verfahren zur Konstanthaltung der Aktivität von
alkalischer Phosphatase in wäßriger Lösung, insbesondere in rekonstruiertem Serum.
Die Bestimmung der alkalischen Phosphalasc spielt in der klinisch-chemischen Analyse eine wichtige
Rolle. Zur Kontrolle derartiger Analysen ist es erforderlich, die Richtigkeit der Analyse ständig anhand
von Kontrollprobcn mit bestimmtem bekannten Gehalt an alkalischer Phosphatase zu kontrollieren. Derartige
Kontrollseren, bei alkalischer Phosphatase vorliegend Humanseren, müssen geeignet sein, für eine
Vielzahl *on Komponenten zur Überprüfung der
Richtigkeit clei \nalysenergebnisse sogenannte Soll-Werte,
die in der Kontrollserumprobe in einem Toleranzbereich
wiedergefunden werden müssen, zu liefern. Dieses Konzept setzt voraus, daß die Komponenten
im gebrauchsfertigen KontroHserum stabil sind. Die Erreichung dieser Stabilität bei Enzymen wirft
beträchtliche Probleme auf.
Insbesondere die alkalische Phosphatase (AP: EC 3.1.3.1) zeigt in wäßrigen Lösungen, insbesondere
in Serum, einen sehr starken Anstieg ihrer Aktivität. Über diese erstaunliche und in einem Kontrollserum
äußerst unerwünschte Eigenschaft wird z. B. in Clin. Chem. 18, 366-373 (1972) und Ärztl. Lab. 8, 272-279
(1972) berichtet. Der rasche Anstieg der Aktivität, der mehr als 100% innerhalb weniger Stunden betragen
kann, zwingt dazu, nur ganz frisch rekonstituiertes Kontrollserum einzusetzen.
Es ist bekannt, diese Zunahme der Aktivität durch mehrstündiges Erhitzen des rekonstituierten Serums
(6 Stunden bei 37 Grad C) auszuschalten. Nach Ablauf der Erhitzungsperiode ergibt sich eine annehmbare
Aktivitätskonstanz der AP. Dieses Verfahren hat jedoch schwerwiegende Nachteile. So wird durch den
Erhitzungsschritt in der Rege! die Aktivität weiterer im Kontrollserum enthaltener Enzyme wesentlich verringert
oder zerstört, so daß es für die üblichen Kontrollseren,
die stets mehrere Enzyme enthalten, unbrauchbar ist. Außerdem ist ein mehrstündiges Lirhitzen
bei exakt einzuhaltender Temperatur eine äußerst umständliche Prozedur, welche in der Routineanalyse
kaum akzeptabel ist.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Kontrollserum zu schaffen, das nach dem Rekonstituieren
über einen längeren Zeitraum hinweg Aktivitätswerte für die AP liefern, die innerhalb der
Toleranzgrenzen liegen.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Kontrollserum der eingangs genannten Art, welches
gekennzeichnet ist durch einen Gehalt von 0.05 bis 0,5 mMol/1 Mn3* oder/und 0,05 bis o.! mMoI/i
Cu2*, bezogen auf die gelöste Form.
Mn3+ und Cd3' werden in Form ihrer gut wasserlöslichen
Salze eingesetzt, deren Anionen keinen störenden Einfluß auf andere Bestandteile des Kontrollserums
ausüben. Als Anionen werden daher vorzugsweise solche verwendet, die ohnedies in natürlichem
Serum bereits vorhanden sind. Hierzu gehören neben den Anionen der weitverbreiteten Mineralsäuren, wie
Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Borsäure u. dgl., auch die Anionen organischer Säuren, wie
Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure u.dgl. Das verwendete Anion ist jedoch im Rahmen der Erfindung
ohne Bedeutung, soweit es nur die obengenannte Bedingung erfüllt.
Die Erscheinung der unerwünschten Aktivitätszunahme der AP tritt auf. gleichgültig ob das Serum in
so aufgetautem oder gefrorenem Zustand vorliegt. Bei in
lyophilisierter Form vorliegendem Serum tritt die Aktivitätserhöhung auf, sobald das Lyophilisat mit
Wasser wieder rekonstituiert wird. Das erfindungsgemäße Kontrollserum kann daher sowohl in lyophilisierter
als auch in gelöster Form vorliegen.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Konstanthaltung der Aktivität von alkalischer
Phosphatase in wäßriger Lösung mit den im Patentanspruch 3 angegebenen Merkmalen. Lyophilisicrtcs
Serum kann also entweder den erforderlichen (ichall an erfindungsgemäßem Stabilisatorzusatz bereits enthalten
oder os wird statt dessen zur Rekonstitution ein wäßriges Lösungsmittel verwendet, in dem das Stabilisierungsmittel
enthalten ist. Die Rekonstitution erfolgt dabei üblicheiweise mit Wasser, insbesondere entionisiertem
oder bidestilliertcm Wasser.
Die Fähigkeil zur Konstanthaltung der ΛΡ-Aklivität
unter den oben geschilderten Umständen ist eine spe-
zifische Eigenschaft von Mn2t- und Cd:+-!onen und
konnte bei anderen zweiwertigen oder anderswertigen Metallionen nicht gefunden werden.
Kontrollseren enthalten in der Regel mehrere Enzyme, beispielsweise 10 bis 20 Enzyme, bei denen
sämtlich die Aktivität konstant gehalten werden muß. Normalerweise ist diese Konstanthaltung erforderlich,
um einen Aktivitätsverlust zu verhindern. Nur die AP macht hier eine Ausnahme. Ein wesentlicher Vorteil
von erfindungsgemäß hinsichtlich der Aktivitätskonstanz von AP stabilisiertem Kontrollserum besteht
darin, daß hierdurch die Aktivität der übrigen, im Serum vorliegenden Enzyme nicht beeinflußt wird,
die Stabilisierungswirkung sich daher selektiv au!" die AP erstreckt.
Ein erfindungsgemäßes Kontrollserum enthält vorzugsweise 0,1 bis 5 mgCreatinin, 0,1 bis 5 mg Bilirubin,
50 bis 300 mg Glucose. 0,2 bis 5 mg Mn'' oder Cd3+.
alkalische Phosphatase und gegebenenfalls weitere Enzyme in 100 ml natürlichem Serum oder serumartigen
Zusammensetzungen in lyophilisierter oder gelöster Form.
Besonders bevorzugt ist ein Kontrollserum, bestehend aus 0,5 bis 1,5 mg Creatinin. 0,5 bis 1,5 mg
Bilirubin. 100 bis 200 mg Glukose, 1 bis 3 mg Man- js
gan-(!l)-chloridhydrat, Essigsäure zur Einstellung eines
pH /wischen 6,0 und 7.0 alkalischer Phosphatase und weiteren Enzymen in 100 ml Serum.
Weitere Enzyme, die im Kontrollserum in bestimmter Menge enthalten sein können, sind z. B. Glutamat-Oxalacetal-Transaminase
(GOT), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Lactat-Dehvdrogcnase (LI)II),
tf-Hydroxybulyrat-Dehydrugenasc (a-HBDIl). Glucose
-6-Phosphatdehydrogenase (G-6-PDII). Crcatinphosphokinase
(CPK). Glutaniat-Dehydrogenase 3s (GI-DH), Leucin-Aminopeptidase (LAP), ff-Amylase.
}'-Glutamyltranspeptidasc (y-GT), Aldolasc (ALD) und
saure Phosphatase (SP).
Bei dem im Anspruch 1 angegebenen Bereich für die Zusätze an Mn:* bzw. Cd2* wird die beste Konstanz
der AP-Aktivität erhalten. Bei Erhöhung über diese Grenzwerte hinaus besteht die Gefahr, daß die Aktivität
abnimmt, bei einer Unterschreitung der unteren Grenze läßt sich eine für alle Fälle ausreichende
Konstanz der Aklivität häufig nicht mehr erzielen und man stellt eine allmähliche Zunahme der Aktivität
lest. Diese Aktivitätszunahme liegt aber immer noch deutlich niedriger als ohne diese Zusätze.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Ein handelsübliches lyophilisiertes Kontrollserum
aus ursprünglich 3 ml Serum mit einem bestimmten Gehalt an alkalischer Phosphatase wird mit 3 ml einer
0.1 mM MnCli-Lösung rekonstituiert. Die Aktivität
der AP unmittelbar nach Rekonstitution und in bestimmten Zeitabständen danach wurde bestimmt. Die
rekonstruierte Lösung wurde dabei konstant hei 25 Grad C gehalten. Die prozentuale Änderung zeigt
nachstehende Tabelle:
48
(Std.l
-3 -3 +7
0,05 mM MnClj-Lösung in Wasser. Die prozentuale
Aktivitätsänderung wurde wiederum wie in Beispiel 1 bestimmt. Die erhaltenen Werte zeigt nachstehende
Tabelle:
(Std.)
| 2 | 4 | 6 | 24 | 3 | 48 |
| + 5 | + 6 | + 9 | + 19 | + 24 | |
| Beispiel | |||||
5° 3 ml Humanserum, welchem die gewünschten Enzymmengen zugesetzt waren, wurden mit soviei
MnCh versetzt, daß die Fndkonzentration an Mn 0,1 mM betrug. Dann wurde das Serum lyophilisiert.
Das lyophilisierte Serum wurde mit 3 ml bidest. Wasser rekonstituiert. Die Aktiivitätsänderung der AP
wurde wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Die erhaltenen prozentualen Werte zeigt nachstehende
Tabelle:
2 4 6 24 48 (Std.)
+ 2 - 1 ±0 ±0 +14 (1U,)
Es wurde wie in Beispiel I beschrieben verfahren,
jedoch erfolgte die Rekonstitution mit 3 ml 0.05 mM wäßriger CdCK-Lösung. Anschließend erfolgte die Bestimmung
der prozentualen Aklivilätsändciung nach
Lagerung bei 4-25 Grad C in der oben beschriebenen
Weise. Nachstehende Tabelle zeigt die erhaltenen Ergebnisse:
2 4 6 24 48 (Ski.!
lis wurde wie in Beispiel 4 beschrieben vorgegangen,
die Rekonstitution erfolgte jedoch mit 3 ml 0.1 mM wäßriger CdCU-Lösung. Die erhaltenen Ergebnisse
zeigt nachstehende Tabelle:
2 4 6 24 48 (Sdt.)
+ 2 +1 M -4 +9 (%)
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch
erfolgte die Rekonstitution des Lyophilisats mit
3 ml bidest. Wasser. Die Aktivitätsänderung nach Lagerung der rekonstituierten Probe bei + 25 G rad C
zeigt nachstehende Tabelle:
21
48
+ (Mi
(Std.)
Hs wurde wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen,
clic Rekonstitution erfolgte jedoch mit 3 ml einer
Aklivitätskonstantes K on trol I serum
100 ml llumanserum wurden mit einem Enzymkonzentrat versetzt, welches die Enzyme AP, GOT. GPT.
CK, LDH, ff-HBDH, Gl-DH, LAP, y-GT, saure Phosphatase,
Amylase, Aldolase und G-6-PDH enthielt. Weiter wurden zugesetzt: 1 mg Creatinin, 1 mg Bilirubin,
Glukose ad 150 mg, 2 mg MnCK-4 HiO, Essigsäure
auf pH 6,5.
Die erhaltene Lösung wurde klar filtriert, in Portionen
von 3 ml in Fläschchen abgefüllt und lyophilisiert. Die lyophilisierten.Proben wurden bei +4GradC gelagert.
Bei Rekonstitution des Kontrollserums rr.it 3 ml
bidest. Wasser und Lagerung der rekonstituierten Lösung bei 25 Grad C ergibt sich innerhalb von 24 Stunden
eine Aklivitätszunahme der AP von weniger als 1%.
Alkalische Phosphatase wurde in entionisierlcm Wasser gelöst. Die Aktivitäi der AP wurde sofort nach
Auflösung und in bestimmten Zeitabständen danach bestimmt. Dabei wurde die Temperatur bei 25 C konstant
gehalten.
In weiteren Versuchen unter den o. a. Bedingungen wurde der Lösung MnCI3 bis zu einer Konzentration
von 0,1 mMol/l und 0,02 mMol/l zugesetzt. Die prozentuale
Änderung der AP-Aktivität für die oben beschriebenen Versuche ist in nachstehender Tabelle
zusammengefaßt:
| MnCI, | Stunden | 4 | -6 | 24 | 48 |
| Zusatz | 2 | + 1 | |||
| in "·. | -4 | -3 | -8 | - 10 | |
| _ | + 3 | ±0 | ±0 | - I | |
| 0.1 mMol/l | -1 | - I | -3 | _ S | |
| 0,02 rnMol/1 | + 1 | ||||
Die obigen Versuche mit AP-Lösungen mit und ohne MnCI-i-Zusatz wurden wiederholt, wobei jedoch
anstelle von entionisiertem Wasser physiologische Kochsalzlösung (0.9% NaCI) verwendet wurde. Die
erhaltenen Krgebnisse entsprachen den oben angegebenen.
Claims (7)
- Patentansprüche:!. KontroHserum für die kliniich-ehemische Analyse mit einem bestimmten Gehalt an alkalischer Phospbatase neben den üblichen Bestandteilen von Humanserum, tierischem Serum, oder sonstigen serumartigen Zusammensetzungen und gegebenenfalls weiteren in bestimmter Menge vorliegenden Enzymen und standardisierten Substraten in lyophilisierter oder gelöster Form, ge kennzeichnet durch einen Gehalt von 0,05 bis 0,5 mMol/1 Mn1+ oder/und 0,05 bis 0,1 mMoI/1 Cd3+, bezogen auf die gelöste Form.
- 2. Kontrollserum nach Anspruch !,gekennzeichnet durch einen Gehalt von 0,1 bis 5 mg Creatinin, 0,1 bis 5 mg Bilirubin, 50 bis 300 mg Glukose, 0,2 bis 5 mg Mn3+ oder Cd3+, alkalischer Phosphatase und gegebenenfalls weiteren Enzymen und standardisierten Substanzen in 100 ml Serum oder serumähnlichen Zubereitungen in lyophilisierter oder gelöster Form.
- 3. Verfahren zur Konstanthaltung der Aktivität von alkalischer Phosphatase in wäßriger Lösung, insbesondere in Serum und serumartigen Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß Mn3+- oder/und Cd3+-Ionen zugesetzt werden.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Mn3 + auf eine Endkonzentration von 0,05 bis 0,5 mMoi./l zugesetzt wird.
- 5. Verfahren nach Anspruch 3. dadurch gekennzeichnet, daß Cd3* auf eine Endkonzentration von 0,05 bis 0,1 mMol/1 zugesetzt wird.
- 6. Verfahren nach Anspruch 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Mn3* oder/und Cd3' dem Serum vor der Lyophilisierung zugesetzt wird.
- 7. Verfahren nach Anspruch 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Mn2+ oder/und Cd3* dem zur Rekonstitution von lyophilisiertem Serum verwendeten Wasser zugesetzt wird.
Priority Applications (10)
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| DE19752537127 DE2537127C3 (de) | 1975-08-20 | Kontrollserum für die klinischchemische Analyse mit einem bestimmten Gehalt an alkalischer Phosphatase | |
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|---|---|---|---|---|
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| EP0721104A2 (de) * | 1993-07-05 | 1996-07-10 | Northern General Hospital N.H.S. Trust | Herstellung und Stabilisierung von Zellen |
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