DE2212285C3

DE2212285C3 - Verfahren zur Bestimmung der carcinogenen Aktivität und heptatoxischen Eigenschaften von Substanzen

Info

Publication number: DE2212285C3
Application number: DE2212285A
Authority: DE
Inventors: Brian Robert Rabin
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1971-03-16
Filing date: 1972-03-14
Publication date: 1981-02-12
Also published as: SE406646B; DE2212285B2; JPS5432357B1; DE2212285A1; GB1389662A; NL7203383A; AT334325B; ZA721457B; CA969457A; FR2129656A5; NL176792B; US3816263A; NL176792C; CH587916A5; BE780592A; ATA213572A

Description

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Die Erfindung betrifft eine neue Methode zur Bestimmung der carcinogenen Aktivität einschließlich der heptatoxischen Eigenschaften von Substanzen. Die erfindungsgemäße neue Bestimmungsmethode ermöglicht es, insbesondere festzustellen, ob bestimmte Substanzen eine carcinogene Aktivität aufweisen.

Es ist von größter Bedeutung, festzustellen, ob von Mensch und Tier aufgenommene Drogen oder andere Substanzen carcinogene Aktivität bzw. heptatoxische Eigenschaften aufweisen.

Die derzeit zugänglichen Testverfahren zur Bestimmung der carcinogenen Eigenschaften sind außerordentlich zeitraubend. Beispielsweise müssen die zu w untersuchenden Substanzen eine beträchtliche Zeit lang im lebenden Organismus zur Einwirkung kommen, und die entsprechenden Auswirkungen müssen über einen längeren Zeitraum beobachtet werden, um auf diese Weise feststellen zu können, ob ein Gewebe krebsartig wird oder nicht Verdächtige Substanzen werden den verschiedensten Laboruntersuchungen unterworfen, da bisher kein schnell durchführbarer und verläßlicher in-vitro-Überprüfungstest bekannt ist, der es ermöglicht, zwischen relativ harmlosen Substanzen und anderen Substanzen zu unterscheiden, welche dann weiter im lebenden Organismus geprüft werden müssen.

Im Gewebe kommt im allgemeinen ein Enzym vor, welches die Umlagerung von Disulfidbindungen in Proteinen katalysiert. Dieses Enzym ist fest mit der b? Zellmembran verbunden und in Rattengeweben wird das betreffende Enzym beispielsweise sowohl in den rauhen als auch in den glatten Bestandteilen des endoplasmischen Reticulums gefunden. In dem rauhen Reticulum ist jedoch die Aktivität des Enzyms im allgemeinen durch an die Zellmembran gebundene Ribosomen maskiert, so daß die enzymatische Aktivität latent bleibt, bis diese Ribosomen von der Zellmembran abgelöst werden.

Die Membranen des Reticulums können in zwei Fraktionen aufgetrennt werden, wobei die glatten Membranen keine daran gebundenen Ribosomen enthalten, während an die rauhen Membranen derartige Ribosome gebunden sind.

Die glatten Membranen zeigen die volle Enzym-Aktivität, welche jedoch dadurch maskiert werden kann, daß Ribosome an diese glatten Membranen angelagert werden. Im reinen Zustand enthalten dagegen die rauhen Membranen das Enzym im vollständig maskierten Zustand, doch kann die Enzymaktivität durch Entfernung der Ribosome reaktiviert werden.

Es wurde nun gefunden, daß eine Reihe von carcinogenen Substanzen eine Degranulierung der rauhen Mikrosomal-Membran hervorrufen und dadurch eine Ablösung der Ribosome bewirken, wodurch das aktive Enzym freigesetzt wird. Der Anstieg der Enzymaktivität kann bei Anwendung geeigneter Untersuchungsmethoden verfolgt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren rur Bestimmung der carcinogenen Aktivität und heptatoxischen Eigenschaften von Substanzen ist demgemäß dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Substanz mit isolierten Zellmembranen, die ein maskiertes Enzym mit Aktivität zur Umlagerung von Disulfidbindungen in Proteinen aufweisen, sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von reduziertem Nicotinamid-adenindinucleotid-phosphat kontaktiert und dann nach einem vorher bestimmten Zeitraum die freigesetzte Enzymaktivität mißt.

Das für die Durchführung des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens anzuwendende Membranpräparat wird vorzugsweise ?us de:*j endoplasmischen Reticulum von Rattenlebern gewonnen, obwohl an sich auch aus anderen Körperteilen erhaltene Reticularmembranen für diesen Zweck eingesetzt werden können. Zweckmäßig werden dabei solche Reticularmembranen verwendet, bei denen die Aktivität des Enzyms vollständig durch die Ribosomen maskiert ist und erst in dem Maße wieder zur Wirkung kommt, wie die Ribosome von der Membran abgelöst werden. Gemäß einer speziellen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode können jedoch auch Reticularmembranen eingesetzt werden, welche von Haus aus keine angelagerten Ribosome enthalten. Diese Ausführungsform wird nachstehend noch im einzelnen beschrieben werden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens beginnt man daher zweckmäßig mit einer Reticularmembran, welche von sich aus intakte Ribosomen enthält.

Aufgabe des reduzierten Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphats (nachstehend abgekürzt als »NADPH«) ist es, die in der Microsomal-Membran vorhandene Hydroxylase zur Wirkung zu bringen. Es wird nämlich angenommen, daß diese Hydroxylase eine Wirkung auf Substanzen hat, die eine latente carcinogene Aktivität zeigen und erst nach Umwandlung durch dieses Enzym die carcinogenen Eigenschaften voll zur Auswirkung kommen lassen. Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren ist daher nicht nur auf Substanzen anwendbar, die eine direkte carcinogene Aktivität

seigen, sondern es können damit auch Substanzen festgestellt werden, welche als carcinogene Vorläufer bezeichnet werden können und bei denen die carcinogene Aktivität durch die Hydroxylase zum Tragen gebracht wird.

Das angewendete Zellmembran-Präparat kann auch Bestandteile von glatten Membranen enthalten, um auf diese Weise microsomale Hydroxylase zur Verfugung zu stellen.

Das Bebrütungsmedium für die Reticularmembran to wird mehrere Stunden lang auf konstanter Temperatur und konstantem pH-Wert gehalten. Nach Beendigung dieser Bebrütungsbehandlung hat die Anwesenheit von carcinogenen Substanzen zur Ablösung von Ribosomen von der Reticularmembran geführt und demcntsprechend ist das Enzym freigesetzt worden und zeigt seine bisher maskierte Aktivität Das Ausmaß der Enzymaktivität läßt sich auf Grund ihrer Fähigkeit zur Umlagerung von Disulfid-Bindungen in einem Protein mit statistisch angeordneten Disulfid-Bindungen bestimmen. Als Substrat für die messung der Enzym-Aküvitäi kann beispielsweise ungezielt oxydierte Riüonuclease verwendet werden, in welcher die Cystein-Scbwefelatome statistisch gepaart sind. Zu diesem Zweck wird das Substrat zusammen mit einem Mercaptan, beispielsweise Mercatoäthanol, zu der Untersuchungsmischung zugesetzt, welche anschließend wiederum bebrütet wird. Das in der ersten Verfahrensstufe freigesetzte Enzym überführt die inaktive ungezielt oxydierte Ribonuclease in eine aktive Form. Diese aktive Ribonuclease läßt sich dann anhand von Standardmethoden bestimmen, weiche in der Literatur beschrieben sind, beispielsweise durch Messung der Veränderungen in der optischen Dichte (J. Biol. Chem. 207 [1954], S. 201) oder durch Messung der Veränderung des pH-Werts mittels eines entsprechenden Meßgerätes (Biochim. Biophys. Acta 26 [1957], S. 502).

Die Menge an aktiver Ribonuclease läßt sich aber auch aufgrund ihrer Fähigkeit zur hydrolytischen Umwandlung von Cytidin-2',3'-phosphat in Cytidin-3'-phosphat bestimmen. Diese Umwandlung läßt sich durch Messung der Veränderung in der optischen Dichte verfolgen (Biochem. J. 74 [I960], S. 234). Die betreffende hydrolytische Umlagerung kann auch anhand von Veränderungen im pH-Wert bestimmt werden.

Theoretisch kann die Aktivität des Enzyms zur Umlagerung von Disulfidbindungen durch die Reaktivierung jedes beliebigen Proteins mit falsch angeordneten Cysteinbausteinen bestimmt werden, weil diese Reaktivierung durch das freigesetzte Enzym katalysiert wird, doch ist Ribonuclease für diesen Zweck besonders bevorzugt, weil die Geschwindigkeit einer spontanen Reaktivierung sehr gering ist und eine Anzahl von Standardmethoden zur Bestimmung der Ribonuclease- 5s Aktivität zur Verfügung steht Anstelle von Ribonuclease kann bei diesem Aktivitätstest auch ein Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor eingesetzt werden.

Das Ausmaß der insgesamt durch die carcinogene Substanz freigesetzten Enzym-Aktivität läßt sich ω berechnen und kann als Bewertungsmaßstab für die carcinogene Aktivität der untersuchten Substanz verwendet werden.

Die erfindungsgemäße Bestimmungsmethode ermöglicht daher eine einfache und direkte Überprüfung von Substanzen bezüglich ihrer carcinogenen Aktivität Die verschiedenen Verfahrtfistufen können standardisiert werden, und die mittels Substanzen mit bekannter carcinogener Aktivität erhaltenen Ergebnisse können als Eichmaßstab verwendet werden, so daß eine Bezugsgröße vorhanden ist, mittels welcher das Vorhandensein und die relative Höhe der carcinogenen Aktivität irgendeines Untersuchungsmaterials abgeschätzt werden können. Die erfindungsgemäße Bestimmungsmethode hat daher besonderen Wert für Herstellungsverfahren der verschiedensten Art, weil sie es dem Hersteller ermöglicht, festzustellen, ob das von ihm zu verarbeitende Material etwa potentielle carcinogene Eigenschaften aufweist, und der Hersteller kann dadurch den gesamten Herstellungsprozeß aufgrund solcher Untersuchungsergebnisse überwachen und regeln.

Gemäß einer speziellen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode wird ein Membranpräparat verwendet, welches aus einer glatten Oberfläcben-Reticularmembran ohne daran gebundene Ribosomen besteht, wobei aber solche Ribosomen in Gegenwart eines Steroidhormon:. an das Reticulum gebunden werden. Für diesen Zwe'k eignet sich beispielsweise östradiol, falls männliche Ribosomen an von männlichen Lebewesen stammende glatte Oberflächenmembrane gebunden werden sollen, während Testosteron für von weiblichen Lebewesen stammende Gewebe Anwendung findet östradiol kann auch durch einen Extrakt von weiblichen Ribosomen ersetzt werden und anstelle von Testosteron kann ein Extrakt von männlichen Ribosomen Anwendung finden. In beiden Fällen kann das betreffende Hormon auch durch einen Extrakt des rauhen Reticulums ersetzt werden.

Das glatte endoplasmische Reticulum zeigt eine hohe Enzymaktivität zur Umlagerung von. Disulfidbindungen, aber wenn Ribosomen in Anwesenheit eines Steroid-Hormons an das Reticulum angelagert werden, verschwindet diese enzymatische Aktivität vollständig. Wenn jedoch ein solches glattes Reticulum vor der Behandlung zwecks Anlagerung von Ribosomen mit einer carcinogenen Substanz behandelt wird, dann lassen sich die Ribosomen nicht an die Membran anlagern und daher tritt keine Veränderung in der ursprünglichen Enzym-Aktivität ein. Die vorstehend beschriebene Methode zur Bestimmung der Enzym-Aktivität kann daher auch in diesem Fall zur Bestimmung der carcinogenen Aktivität der untersuchten Substanz Anwendung finden.

Eine Untersuchungs-Ausstattung zur Durchführung des vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens enthält die folgenden Reagentien:

(a) Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat oder ein diese Verbindung lieferndes Material

(b) -;ifts Sucrose-MgClrKCl-Tris-Pufferlösung

(c) Protein mit statistischer Verteilung der Disulfid-Bindungen, daj durch Einwirkung des freigesetzten Enzyms in eine enzymatisch aktive Form umgelagert wird

(d) 2-Mercaptoäthanol oder ein äquivalent wirkendes Thiol

(e) ein Substrat zur Bestimmung des Ausmaßes der enzymatischen Aktivität des in die aktive Form umgelagerten Proteins gemäß (c).

Die Untersuchungs-Ausstattung enthält zweckmäßig auch eine detailliei se Gebrauchsanleitung zur Durchführung der folgenden Maßnahmen:

1) Herstellung einer ersten Lösung durch Zusatz der zu untersuchenden Substanz zu Reaerenzial·

2) Zusatz von Reagenz (b) zu dieser Lösung und weiterer Zusatz von isolierten Zellmembranen mit maskierter Enzym-Aktivität zur Umlagerung von Disulf idbindungen;

3) Herstellung einer zweiten Lösung durch Zusatz von Reagenz (c) zu einem Elektrolyt und Einstellung des pH-Werts mittels einer Base auf einen vorherbestimmten Wert sowie weiterer Zusatz von Reagenz (d) zu dieser Lösung;

4) Herstellung einer dritten Lösung durch Zusatz von Reagenz (e) zu einem Elektrolyten;

5) Zusetzen einer Probe der ersten Lösung zu einem vorherbestimmten Zeitpunkt zu einer Probe der zweiten Lösung;

6) Zusatz einer Probe der Mischung von der vorhergehenden Stufe (5) zu einem vorherbestimmten Zeitpunkt zu einer Probe der dritten Lösung;

7) Bestimmung und Verfolgung einer Eigenschaftsänderung dieser Mischung, welche auf den Grad der Aktivierung des Proteins gemäß (c) durch das freigesetzte Enzym anspricht;

8) Auswertung des Ausmaßes der Degranulierung der rauhen Microsomal-Membran.

Als Protein (c) wird vorzugsweise ungezielt oxydierte Ribonuclease und als Substrat (e) wird vorzugsweise Cytidin-2',3'-cyclische Phosphorsäure oder ein davon abgeleitetes Salz, insbesondere das Natriumsalz, verwendet. Als Elektrolyt für die Auflösung des Proteins (c) und des Substrats (e) wird zweckmäßig Kaliumchlorid oder eine äquivalent wirkende Verbindung verwendet, und als Base zur Einregelung des pH-Wertes der zweiten Lösung ist Borax oder eine äquivalent wirkende Verbindung gut geeignet. Diese Elektrolytsubstanz bzw. die Base sowie ein Präparat aus isolierten Zellmembranen können gleichfalls als Reagentien in der erfindungsgemäßen Untersuchungs- Ausstattung vorhanden sein.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

5 μg je rnl der zu untersuchenden Substanz werden zu einem Präparat zugesetzt, welches die rauhe Microsomal-Membran aus der Leber männlicher Ratten zusammen mit etwa 10 mg Protein/ml in Anwesenheit von 1 mMol NADPH, 50 mMol Tris-Pufferlösung (Tris ist die Abkürzung von der Verbindung Tris-(hydroxymethylj-aminomethan), 25 mMol KCI, 5 mMol MgCb und 250 mMol Sucrose enthält. Das die rauhe Microsomal-Membran enthaltende Präparat enthält außerdem einige Bestandteile von glatter Membran, welche die microsomale Hydroxylase liefert, die zur Aktivierung bestimmter carcinogcncr Substanzen erforderlich ist Anschließend setzt man 10 Volumenprozent überstehender Flüssigkeit des Microsomal-Präparates hinzu und bebrütet dann diese Untcsuchungsmischung 2 Stunden lang bei 20⁰C und einem pH-Wert von 73-

Außerdem wird eine entsprechend zusammengesetzte Untersuchungsmischung in gleicher Weise bebrütet welche jedoch kein NADPH enthält um so der Möglichkeit Rechnung zu tragen, daß die carcinogene Aktivität der zu untersuchenden Substanz durch die Microsomal-Hydroxylase nicht gefördert sondern zerstört wird.

Anschließend wird der prozentuale Anteil dei insgesamt vorhandenen latenten Enzymaktivität, wel ehe freigesetzt worden ist, aufgrund ihrer Wirkung aul ungeziclt oxydierte Ribonuclease bestimmt.

Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend ir Tabelle I zusammengefaßt. In der Fußnote rsi angegeben, falls die zu untersuchende Substanz nicht ir einer Konzentration von 5 μg/ml eingesetzt worden isi bzw. falls keine NADPH mitverwendet wurde.

Tabelle I

Geprüfte Substanz	Prozent	In der
	Gesamt-	Literatur an
	Enzym-	gegebenes
	Aktivität nach	carcinogenes
	2 Stunden	Verhalten
Naphtaiin	0	Null
2-Napthylamin	0-5	+
Anthracen	0	Null
2,7-Diaminofluoren	15	+
1,2-Benzanthracen	10	+
1,2-Benzanthrachinon	15	+
2-Aminochrysen	15	+
6-Aminochrysen	0	Null
3-Amifupyren	17	+
3,4-Benzopyren	40	+
Benzo-(b)-chrysen	0	Null
3,4,8,9-Dibenzpyren	25	+
CCl₄*)	15	+
Aflatoxin B**),	20	+

*) 15 ,ug/ml.
_r, **) 10 .ug/ml, ohne NADPH.

Beispiel 2

In diesem Beispiel werden die einzelnen Verfahrensschritte mehr im einzelnen erläutert.

Bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Meßverfahren wird Ribonuciease verwendet, weiche auf chemischem Wege reduziert wurde und die dann wieder oxydiert wurde. Da sich bei diesem Oxydationsvorgang die

4> Disulfid-Brücken nicht wieder in ihren ursprünglichen Stellungen ausbilden, wird das Enzym durch eine solche Oxydation inaktiv. Die Reaktivierung erfolgt dann durch das freigesetzte Umlagerungsenzym in der vorstehend erläuterten Weise. Wenn man daher den

•ίο Anstieg der Menge an aktiver Ribonuclease verfc'zt so ist dieser Anstieg dem Ausmaß der Degranulation proportional.

Der Geschwindigkeitsanstieg, mit dem sich aktive Ribonuclease bildet wird bei diesem Meßverfahren durch Beobachtung der Veränderungen im pH-Wert

bigi, der eintritt weil Ribonucieaac im aküven Zustand Cytidin-2',3'-cyclisches Monophosphat hydrolysiert

1. Herstellung der reduzierten Ribonuclease

50 mg einer Ribonuclease, die viermal umkristallisiert worden war und 40 bis 50 Kunitz-Einheiten je mg entspricht werden zu 13 ml einer 8-m-Harnstofflösung fc5 zugesetzt und der ρ H - Wert wird unter Verwendung von Methylamin auf etwa 8,5 eingestellt Dann setzt man 0,05 ml Mercapto-äthanol hinzu und leitet Stickstoff in Blasen durch die Lösung.

Das Teströhrchen wird dann abgeschmolzen und 4 bis 5 Stunden lang bei 30 bis 35'C bebrütet. Anschließend gibt man die Lösung auf eine lonenaustauschersäule (verneintes Dextran) und eluiert mit 0,1 -m Essigsäure. Die ein/einen Fraktionen werden gesammelt und ihre optische Dichte wird bei 280 ιημ bestimmt.

D"·; Reduzierte Ribonuclease enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und mittels 0,1-m Essigsäure bis zu einer optischen Dichte von 0,500 bei 280 ηιμ verdünnt. Diese verdünnte Lösung wird dann fü~ die weitere Messung verwendet.

2. Oxydation der reduzierten Ribonuclease

Man läßt die Ribonuclease-Lösungen sich spontan oxydieren. Für diesen Zweck sind etwa 3 Tage vollständig ausreichend.

0,25molar an Sucrose ist, verdünnt. Diese Suspension wird anschließend zentrifugiert (120 000 g, I Stunde, 4°C) und das aus der rauhen Membran bestehende Pellet wird in etwa 6 ml einer TKM-Pufferlösung, welche etwa 0,25molar an Sucrose ist. suspendiert.

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3. Herstellung von Membranpräparaten aus Rattenleber Lösungen

a) TKM-Pufferlösung
TRIS - 5OmMoI
KCI - 25mMol
MgCl2 — 5 mMol
Einstellen auf pH 7,6 mit HCI

b) 2-m Sucrose in TKM

c) 0,25-m Sucrose in TKM

d) 1,35-m Sucrose in TKM

Methode

5 Ratten werden getötet, ihre Lebern werden entfernt und in kalte TKM-Pufferlösung eingelegt, welche 0,25molar an Sucrose ist. Unter Verwendung von Scheren werden die Rattenlebern in kleine Stückchen zerschnitten. Anschließend werden die Lebern homogenisiert. Dieses Homogenat wird dann zentrifugiert (Ij OCCg, 20 'viiiiuicii, 4"C). Die übersiehende Suspension wird abgetrennt und das gebildete Pellet wird verworfen.

Die Fraktionierung der Membransuspension erfolgt in einer Sucrose-Gradientenlösung in Zentrifugenröhrchen von 12 ml. Die Gradientenlösung wird hergestellt, indem man jeweils 2,5 ml einer 2,0molaren Sucroselösung in jedes Röhrchen einpipettiert und dann mit 3 ml einer 1,35-m Sucroselösung überschichtet. Man füllt jedes Röhrchen mit der Membransuspension auf, wobei man diese sorgfältig über die Gradientenlösung überschichtet und dabei ein Vennischen der einzelnen Schichten vermeidet Man zentrifugiert dann diese Röhrchen (120 000 g, 4 Stunden, 4⁰C). Auf diese Weise fr.rd d;c Mcmbrarisuspension in 4 IlaupikouipüneiUen aufgetrennt Man erhält eine überstehende rotgefärbte Lösung, welche als SII bezeichnet wird. In der Grenzschicht zwischen der 0,25-m Sucroselösung und der 1,35-m Sucroselösung hat sich die glatte Membran angereichert, während sich die rauhe Membran an der Grenzschicht zwischen der 1,35-m Sucrose- und der 2-m Sucroselösung befindet Außerdem erhält man ein Pellet aus Polysomen. Die einzelnen Komponenten werden unter Verwendung einer Injektionsspritze voneinander getrennt und die die rauhe Membran enthaltende Fraktion wird im Verhältnis von etwa 1:2 unter Verwendung einer TKM-Pufferlösung, welche etwa

4. Bestimmung der Ribonuclease
im Membranpräparat

Von der in der vorstehenden Weise erhaltenen Membransuspension werden 2 Proben von etwa jeweils 100 μΙ für die Bestimmung der Ribonuclease entnommen. Zu jeder Probe werden 3 ml einer 0,1 n-Perchlorsäurelösung zugesetzt, und die Teströhrchen werden 10 Minuten lang in Eis gestellt. Anschließend werden die Röhrchen auf einer niedrigtourigen Zentrifuge zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Dann setzt man zu jedem Teströhrchen 3,2 ml einer 3 n-Kaliumhydroxidlösung hinzu und bebrütet die Mischung 1 Stunde lang bei 37°C. Nach dem Abkühlen der Mischung in Eis setzt man zu jedem Röhrchen 0,8 ml einer 2,2 n-Perchlorsäurelösung hinzu und läßt diese Mischung 5 Minuten lang stehen. Die Suspension wird dann zentrifugiert und die dabei erhaltene überstehende Lösung wird im Verhältnis 1:2 mit Wasser verdünnt. Anschließend bestimmt man die optische Dichte dieser Lösung bei 260 ιτιμ.

256 μg/ml der ursprünglichen Probe entsprechen einer optischen Dichte von 0,1.

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5. Bestimmung des Proteingehalts
der rauhen Membran

Hierfür verwendet man die Methode nach Lowry, weiche in einer Verdünnung von 1: 50 bzw. 1: 100 an der gemäß Absatz 3) erhaltenen Membransuspension durchgeführt wird.

Für diese Bestimmung sind die folgenden Lösungen erforderlich:

A 2 Prozent Natriumcarbonat in 0,1 n-Natriumhydroxid

1 Prozent Kupfersulfat
B2 2 Prozent Na- oder K- oder KNa-Tartrat
B 1:1 Bi + B₂
C 50 ml A+ImI B
D 1 :2,5 in Wasser zu Folin-Ciocalteu

Zu 3 ml der Lösung C setzt man 0,2 ml der Membransuspension hinzu. Man bebrütet dann 15 Minuten lang bei Zimmertemperatur, setzt weiterhin 03 ml der Lösung D hinzu und vermischt ganz rasch. Nach 30 Minuten wird die optische Dichte bei 750 ηιμ uesiiiiiiTii. Ais Standard kann für diese Methode ein Ochsenserum-Albumin verwendet werden.

6. Verhältnisse von Ribonuclease zu Protein

Damit ein Membranpräparat als rauh bezeichnet werden kann, soll das Verhältnis von Ribonuclease zu Protein im Bereich von 0,14 bis 0,19 liegen. Durch dieses Verhältnis unterscheidet sich eine rauhe Membran sehr deutlich von einer glatten Membran, bei der das entsprechende Verhältnis einen Wert im Bereich von 0,02 bis 0,03 hat

7. Bestimmung der carcinogenen Aktivität

Für diese Bestimmungsmethode sind die folgenden Lösungen erforderlich:

*) Cytidin-2',3'-cyclische
Phosphorsäure Natriumsalz (abgekürzt CMP)
carcinogene Substanz

*) Mercaptoäthanol
*) Rauhe Membrane

KCI

Essigsaure
Borax-Lösung

·) NADPH

") ungezielt oxidierte
Ribonuclease

10 mg/ml 0,1-m KCl

1 mg/ml Wasser oder

DMF···)

ΙΟμΙ in 7 ml Wasser

10-20 mg Protein/ml

0,25-m Sucrose in TKM

0,1-min Wasser

0,05-m in Wasser

5mMolinTKM

Lösung mit einem
Wert für die
optische Dichte bei
280 ιημ von 0,500 in
0,1-m Essigsäure

ίο

·) In Eis gekühlt
"j DMF = Dimethylformamid

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Erforderliche Meßvorrichtung

Diese Bestimmungsmethode beruht auf der Veränderung des pH-Werts einer Lösung von cyclischer CMP während der durch Ribonuclease hervorgerufenen Hydrolyse. Da jedoch die Veränderung im pH-Wert nur etwa einer Größenordnung von 0,1- bis 0,2-pH-Wert-Einheit entspricht, muß das pH-Wert-Meßgerät mit einem Scalenverbreiterer verbunden werden, damit die Messungen mit dem erforderlichen Genauigkeitsgrad durchgeführt werden können. Beispielsweise eignet sich zu diesem Zweck ein E.I.L-pH-Meter Modell 7030. Dieses Meßgerät ist über eine Rückschaltung mit einem Registriergerät mit einem vollen Scalenausschlag für 10 mV verbunden. Alle pH-Wert-Messungen werden in einer mit Wassermantel versehenen Zelle von 5 ml Faccuncrcvprmnopn hei mnor T»mni>rahir »An ¹WP - ----o- - ©-■■ --■ 1 ■ -- -

durchgeführt.

Meßmethode

a) Unter Verwendung geeigneter Puffersubstanzen wird das pH-Wert-Meßgerät standardisiert.

b) Man stellt die degranulierte zu untersuchende Mischung her.

Zu 100 μΐ NADPH werden 5 bis 50 μg der zu untersuchenden carcinogenen Substanz zugesetzt, und dann füllt man mit TKM-Pufferlösung bis auf 03 ml auf. Zu dieser Mischung setzt man 0,2 ml der Membransuspension hinzu und beginnt die Zeitmessung der Degranulierung.

c) Herstellung der Meßlösung.

Zu 0,65 g ml einer 0,1 molaren KCl-Lösung setzt man 100 μΐ reoxidierte Ribonuclease hinzu und stellt unter Verwendung von 0,05molarer Boraxlösung auf einen pH-Wert von 7,0 ein. Zu dieser Mischung setzt man 50 μΐ Mercaptoäthanol hinzu und unmittelbar nachdem die Degranulierung eingesetzt hat, wird eine Probe von 100 μΐ entnommen und mit der vorstehend beschriebenen Mischung vereinigt Zu diesem Zeitpunkt soll ein iss zweiter Zeitmesser in Gang gesetzt werden. Der pH-Wert der Mischung wird jetzt unter Verwendung von Boraxlösung auf 7,6 eingestellt Diese

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50

55 Mischung wird in eine zweite Meßzelle überführt und bei 35° C bebrütet.

d) Herstellung einer Lösung von cyclischer CM P.
Eine Meßzelle wird mit 0,9 ml Kaliumchloridlösung beschickt, und dann setzt man 100 μΙ cyclische CMP hinzu. Während 2 bis 3 Minuten läßt man das Gleichgewicht sich einstellen.

e) Durchführung der eigentlichen Messung.
Nachdem die durch Verfahrensmaßnahme (c) eingeleitete Reaktivierung der inaktiven Ribonuclease etwa 7 Minuten lang abgelaufen ist, wird eine Probe von 100 μΙ in die Lösung der cyclischen CMP übertragen und das pH-Wert-Meßgerät wird auf die verbreiterte pH-Wert-Scala eingestellt. Der Ablauf der Hydrolyse der cyclischen CMP kann nunmehr anhand der Veränderungen im pH-We> t verfolgt werden. Während der Messung soll Stickstoff über die Oberfläche der Reaktionsmischung geblasen werden, um eine atmosphärische Verseuchung zu vermeiden und damit zufällige pH-Wertänderungen auszuschalten. Diese Bestimmung wird in Zeitabständen von 10 Minuten bis zu einer Gesamtzeit von etwa 40 Minuten wiederholt. Der Gradient der Meßkurven soll allmählich ansteigen, da die Konzentration an aktiver Ribonuclease mit der Zeit in dem Ausmaß zunimmt, wie die inaktive Form durch das Umlagerungsenzym reaktiviert wird.

Eine Stunde nach Beginn der Maßnahmen von Verfahrensstufe (b) wird die Verfahrensstufe (c) wiederholt, und der ganze Meßvorgang wird wiederum so vorgenommen, wie es vorstehend unter (e) beschrieben ist. Diesen gesamten Meßvorgang wiederholt man dann nochmals nach etwa 2 Stunden.

Die gesamte Messung soll außerdem in Abwesenheit von NADPH wiederholt werden.

Auswertung der Meßresultate

Der Anstieg in der Enzym-Konzentration, welche durch den Degranulierungsvorgang freige: 2tzt worden ict lyirH naph Ahlauf pinpr Stunde narh Ahlaiif vnn Stunden gemessen und mit dem Blindwert zum Zeitpunkt 0 verglichen. Zu den jeweiligen Zeitpunkten ist außerdem der Anstieg der Konzentration an aktiver Ribonuclease gemessen worden, indem man eine Serie von pH-Wert-Veränderungen verfolgt, welche sich aus der Hydrolyse cyclischer CMP mittels aktiver Ribonuclease ergeben.

Daher erhält man zu jedem Zeitpunkt der Degranulierungsbestimmung Ta, T\ und T₂ eine Reihe von Meßkurven (a, b und c) mit steigendem Gradienten. Dieser Sachverhalt ist in dem Diagramm von F i g. 1 für einen Zeitpunkt rwiedergegeben.

Es wird dann graphisch die Abhängigkeit der Gradienten der Kurven a, 6 und cgegen die Zeit für jede Probe im Anschluß an die Bestimmung des Ribonuclease-Wertes aufgetragen. Dieser Sachverhalt ist in F i g. 2 der Zeichnung wiedergegeben.

Beide graphischen Darstellungen werden für den Zeitpunkt T=Q, T= 1 Stunde und T = 2 Stunden angefertigt, und im Falle des Vorliegens einer carcinogenen Aktivität, d. h. bei positivem Ausfall der Bestimmung, ergibt sich das Gesamtergebnis aus der graphischen Darstellung von F i g. 3.

Schließlich kann man die Gradienten der Kurven A, B und C von F i g. 3 gegen die Zeit für den Zeitpunkt T= 0,T= I Stunde und T= 2 Stunden auftragen.

Im Falle eines negativen Ergebnisses der Bestimmungsmethode hat keine Degranulierung stattgefunden, und daher nimmt die Menge an Umlagerungsenzym auch nicht zu. Die Blindwert-Bestimmung des Enzyms ergibt daher einen mit der Zeit abnehmenden Wert (Denaturierungseffekt) und daher ist die Neigung der Kurve C < als die Neigung der Kurve B und diese wiederum < als die Neigung der Kurve A.

Beispiel 3

Dieses Beispiel erläutert die Anwendung des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens an der Substanz Aminopyren.

Aminopyren wird in einer Konzentration von 5 ng/ml eingesetzt. Die erste Bebrütungsmischung hat die folgende Zusammensetzung:

0,4 ml eines Microsomal-Membranpräparates (rauhe Membran in einer Konzentration von lOmg/ml)

0,1 ml eim>'NADPH-Lösung(5mMol)

5 μΐ einer Lösung, welche 0,5 mg/ml Aminopyren in Dimethylformamid enthält.

Alle Lösungen werden in einem Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

250 mMol Sucrose
50 mMol TRIS-Base
25 mMol KCl
5 mMol MgCl₂

Von dieser ersten Bebrütungslösung werden jeweils Anteile von 100 μΐ zum Zeitpunkt T = 0, T = 60 Minuten und T = 120 Minuten entnommen und mit einer zweiten Bebrütungsmischung der folgenden Zusammensetzung vermischt:

0,7 ml 0,1 -m KCI

0,10 ml eines ungezielt oxydierten Ribonuelease-Sub-

strats (500 μg/ml in 0,1 -m Essigsäure)
0,05 ml 0-Mercaptoäthanol (2 χ 10~² Mol)

0,05 molarer Boratlösung zur Einstellung eines
pH-Wertes von 7,6.

Diese zweite Lösung wird dann bei 32° C gehalten.

Jeweils 100 μΙ-Proben dieser zweiten Lösung werden zum Zeitpunkt ί = 5 Minuten, 12 Minuten, 20 Minuten, 28 Minuten und 35 Minuten in 1 ml einer Lösung von

Cytidin-2',3'-cyclisches Monophosphat in 0,1 molarer KCI (1 mg/ml) eingetragen und der pH-Wert dieser Lösung wird 5 Minuten lang unter Verwendung eines Registriergerätes mit entsprechendem Streifen-Registrierpapier registriert (volle Ablesungsbreiie der Skala = 0,1 pH-Wert-Einheiten).

Die pH-Wert-Änderungen der einzelnen Proben werden zum Zeitpunkt t = 5 Minuten, 12 Minuten, 20 Minuten, 28 Minuten und 35 Minuten gemessen (vgl. nachstehende Tabelle II), und die Geschwindigkeit des Anstiegs der pH-Wertveränderung für Proben der ersten Bebrütungslösung zum Zeitpunkt 0 sowie nach 60 und 120 Minuten wird aus den Enzym-Aktivitäten zu diesen Zeitpunkten berechnet.

Tabelle II

r=- o

T= 60Min. 7"= 120Min.

/= 5 Min.
/= 12Min.
ι = 20Min.
/ = 28 Min.
t = 35 Min.
Geschwindigkeit
des Anstiegs der
pH-Wert-Veränderung
(willkürliche
Einheiten)

*) 80XpH/Min.

0,32
0,35
0,38
0,42
0,45
2

0,32
0,38
0,48
0,55
0,63
5

0,36
0,48
0,61
0,74
0,86

Die pH-Wert-Änderungen sind in Fig.4 gegen die Bebrütungszeit der zweiten Mischung aufgetragen und ergeben die Enzym-Aktivitäten, d. h. den Gradienten der einzelnen Kurven.

A UtIwWu fer»

F i g. 5 gegen die Bebrütungszeit der ersten Beb ,'itungslösung aufgetragen, wodurch man das Ablösen der Ribosome von der Membran verfolgen kann.

Offensichtlich steigt bei der Substanz Aminopyren die Rearrangase-Aktivität im Lauf der Zeit an, so daß diese Verbindung als carcinogen-aktiv eingestuft werden muß.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung der carcinogenen Aktivität und heptatoxischen Eigenschaften von Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Substanz mit isolierten Zellmembranen, die ein maskiertes Enzym mit Aktivität zur Umlagerung von Disulfidbindungen in Proteinen aufweisen, sowohl in Anwesenheit als ι ο auch in Abwesenheit von reduziertem Nicotinamidadenin-dinucleotid-phosphat kontaktiert und dann nach einem vorher bestimmten Zeitraum die freigesetzte Enzymaktivität mißt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem endoplasmischen Reticulum von' Rattenlebern gewonnene Zellmembran einsetzt

3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzaLbnet, daß man die freigesetzte Enzym-Aktivität aufgrund ihrer Fähigkeit zur Umlagerung von Disulfid-Bindungen in einem Protein mit statistischer Anordnung der Disulfidbindungen mißt

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Protein mit statistischer Anordnung der Disulfid-Bindungen eine inaktive, ungezielt oxydierte Ribonuclease einsetzt und deren Aktivität nach Umlagerung der Disulfid-Bindungen mißt.

5. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aktivität der Ribonuclease aufgrund ihrer Fähigkeit zur Hydrolyse von Cytidin-2',3'-phosphat in Cytuim-3'-phosphat mißt