DE112013002316T5

DE112013002316T5 - Systeme und Verfahren für Assays von im nicht-nüchternen Zustand gewonnenem LDL-Cholesterin

Info

Publication number: DE112013002316T5
Application number: DE112013002316.4T
Authority: DE
Inventors: Timothy Riley; Aniruddha Patwardhan; Frank LaDuca
Original assignee: Polymer Technology Systems Inc
Current assignee: Polymer Technology Systems Inc
Priority date: 2012-05-04
Filing date: 2013-05-01
Publication date: 2015-04-23
Also published as: GB201313383D0; BR112013025913A2; MX2013012368A; EP2845012A4; MX343923B; RU2014148800A; CN103562726A; PH12014502463A1; CA2872525A1; US9207184B2; CN103562726B; EP2845012A1; US9470698B2; GB2514858A; WO2013166160A1; US20160084858A1; US20130295678A1

Abstract

Bei einem Ausführungsbeispiel umfasst ein Teststreifen zum Testen von cholesterinbezogenen Blutanalyten im Vollblut eine Erythrozytenabtrennschicht, wobei die Erythrozyten-btrennschicht rote Blutzellen von einer Blutprobe abtrennt, die auf den Teststreifen aufgebracht wird, während die Blutprobe durch die Erythrozytenabtrennschicht nach unten fließt. Der Teststreifen umfasst ferner eine Reaktionsschicht, die die Blutprobe von der Erythrozytenabtrennschicht aufnimmt, wobei die Reaktionsschicht POE-POP-POE-Blockcopolymer, ein Tensid und ein das Reflexionsvermögen veränderndes Reagens umfasst, wobei die POE-POP-POE-Blockcopolymere im Wesentlichen nur Nicht-LDL-Cholesterin-Analyten löslich machen, wobei die Nicht-LDL-Cholesterin-Analyten mit dem das Reflexionsvermögen verändernden Reagens reagieren, um ein Reflexionsvermögen der Blutprobe zu verändern.

Description

HINTERGRUND
Die Messung von Low-Density-Lipoprotein-Cholesterin (LDL-Cholesterin, LDL = Lipoprotein geringer Dichte) ist eine wichtige Gesundheitsmaßnahme bei der Feststellung der Gesundheit, vor allem der Herz-Kreislauf-Gesundheit. Es ist wünschenswert, schnelle, in situ vorliegende Messsysteme für LDL zu haben, die kein Labor oder sonstige Einrichtungen erfordern. Auf diese Weise können Angehörige von Heilberufen unmittelbar nach einer Probenahme mit Patienten sprechen, statt tagelang darauf warten zu müssen, dass Testergebnisse von einem Labor zurück kommen. Auf diese Weise haben sie die Vorgeschichte und den Status des Patienten noch frisch im Kopf, was zu besseren Ergebnissen und einer besseren Analyse der Gesundheit des Patienten führt.
Derzeit gibt es fünf bekannte Verfahren zum Quantifizieren von Low-Density-Lipoprotein-Cholesterin (LDL-Cholesterin) an einem Klinische-Chemie-Analysator in der Nasschemie (Chemie nasschemischer Reaktionen). Vier der Verfahren sind aus zwei Schritten bestehende Reaktionen, bei denen das erste Reagens mit allen nicht-LDLs (HDL und VLDL) reagiert, um ein farbloses Produkt zu erzeugen. Nachdem die erste Reaktion abgeschlossen ist, wird dann die Zugabe eines weiteren Reagens zu einem vorbestimmten Zeitpunkt verwendet, um das übrige LDL zu quantifizieren. Diese Verfahren scheinen mit Strippungstechnologie (engl.: strip technology) unvereinbar zu sein, da es keine Möglichkeit gibt, zu den nötigen kritischen Zeitpunkten zuverlässig mehrere Reagenzien einzubringen. Das letzte Verfahren, das von Kyowa-Medex hergestellt wird, beansprucht, ein Verfahren zu haben, bei dem HDL und VLDL durch Zuckerverbindungen (Zyklodextrine) blockiert werden, während LDL mit speziellen Tensiden und Enzymen selektiv einer Mizellenbildung unterzogen wird. Am wichtigsten ist, dass das Verfahren beansprucht, in einer einzigen Reaktion stattzufinden, die zu Strippungschemie komplementär ist.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG
Bei einem Ausführungsbeispiel umfasst ein Teststreifen zum Testen von cholesterinbezogenen Blutanalyten im Vollblut eine Erythrozytenabtrennschicht, wobei die Erythrozyten-btrennschicht rote Blutzellen (Erythrozyten) von einer Blutprobe abtrennt, die auf den Teststreifen aufgebracht wird, während die Blutprobe durch die Erythrozytenabtrennschicht nach unten fließt. Der Teststreifen umfasst ferner eine Reaktionsschicht, die die Blutprobe von der Erythrozytenabtrennschicht aufnimmt, wobei die Reaktionsschicht POE-POP-POE-Blockcopolymer, ein Tensid und ein das Reflexionsvermögen veränderndes Reagens umfasst, wobei die POE-POP-POE-Blockcopolymere im Wesentlichen nur Nicht-LDL-Cholesterin-Analyten löslich machen, wobei die Nicht-LDL-Cholesterin-Analyten mit dem das Reflexionsvermögen verändernden Reagens reagieren, um ein Reflexionsvermögen der Blutprobe zu verändern. Optional umfasst der Teststreifen eine Verteilungsschicht, die auf der Erythrozytenabtrennschicht orientiert ist. Bei einer Alternative ist das POE-POP-POE-Blockcopolymer aus der Liste ausgewählt, die aus Pluronics L101: MW (MW = molecular weight, relative Molekülmasse) 3800, POE₇-POP₅₄-POE₇; Pluronics L121: MW 4400, POE₅-POP₆₈-POE₅; Pluronics P123: MW 5750, POE₂₀-POP₇₀-POE₂₀; und Pluronics F127: MW 12600; POE₁₀₆-POP₇₀-POE₁₀₆ besteht. Alternativ dazu ist das Tensid Triton-X. Der Teststreifen kann ferner eine sekundäre Blutabtrennschicht neben der Erythrozytenabtrennschicht umfassen, wobei die sekundäre Blutabtrennschicht zusätzliche rote Blutzellen von der Blutprobe abtrennt. Optional umfasst die sekundäre Blutabtrennschicht ferner Dextransulfat. Alternativ dazu liegt eine relative Molekülmasse (ein Molekulargewicht) des Dextransulfats zwischen 10 K und 1.000 K. Alternativ dazu kann Magnesiumchlorid (oder können Magnesiumionen) in ähnlichen Mengen verwendet werden. Bei einer weiteren Alternative liegt eine relative Molekülmasse des Dextransulfats zwischen 50 K und 750 K. Optional beträgt eine relative Molekülmasse des Dextransulfats 500 K. Alternativ dazu ist das POE-POP-POE-Blockcopolymer Pluronics P123: MW 5750, POE₂₀-POP₇₀-POE₂₀. Optional ist ein Verhältnis von POE-POP-POE-Blockcopolymer zu Triton-X 10 Teile POE-POP-POE-Blockcopolymer zu einem Teil Triton-X. Bei einer Alternative beträgt eine Konzentration des Triton-X zumindest 0,01%. Bei einer anderen Alternative beträgt eine Konzentration des Triton-X zumindest 0,1%. Bei einer wieder anderen Alternative beträgt eine Konzentration des POE-POP-POE-Blockcopolymers zumindest 1%. Optional beträgt eine Konzentration des POE-POP-POE-Blockcopolymers zumindest 2%. Alternativ beträgt eine Konzentration des POE-POP-POE-Blockcopolymers zumindest 3%. Optional liegt ein pH-Wert der Reaktionsschicht bei zumindest 5,4. Alternativ dazu liegt ein pH-Wert der Reaktionsschicht bei zumindest 6,8. Bei einer anderen Alternative beträgt ein pH-Wert der Reaktionsschicht zumindest 7,4.
Optional beträgt ein pH-Wert der Reaktionsschicht 6,8. Alternativ dazu umfasst die Blutabtrennschicht D-23-Borsilikat-Glasfaser, die mit Phaselous Vulgaris (PHA-P) Lectins imprägniert ist.
Bei einem Ausführungsbeispiel umfasst ein Verfahren zum Bestimmen einer Konzentration von Nicht-LDL-Cholesterin in einer Vollblutprobe unter Verwendung eines Trockenphasenteststreifens ein Inberührungbringen der Vollblutprobe mit einer Blutabtrennschicht des Teststreifens. Das Verfahren umfasst ferner ein Abtrennen von Blutzellen von der Vollblutprobe, wobei Plasma produziert wird und man das Plasma durch die Blutabtrennschicht zu einer Testschicht fließen lässt. Das Verfahren umfasst ferner ein Zur-Reaktion-Bringen einer Nicht-LDL-Fraktion bevorzugt vor einer LDL-Fraktion und ein Erzeugen einer Farbe in der Testschicht, die im Wesentlichen proportional zu einer Konzentration der Nicht-LDL-Fraktion in der Probe ist. Das Verfahren umfasst ferner ein Messen der erzeugten Farbe.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst ein Teststreifen zum Bestimmen der Konzentration von LDL-Cholesterin in einer Vollblutprobe eine Testmatrix (einen Testmatrixstreifen), die zumindest zwei Stapel aufweist, einen ersten Stapel der zumindest zwei Stapel für Gesamtcholesterin und einen zweiten Stapel der zumindest zwei Stapel für Nicht-LDL. In den ersten Stapel sind Reagenzien integriert, um eine kolorimetrische Reaktion zu erzeugen, die zu der Menge an Gesamtcholesterin in den Proben proportional ist. In den zweiten Stapel sind Reagenzien integriert, um eine kolorimetrische Reaktion zu erzeugen, die zu der Menge an Nicht-LDL-Cholesterin in der Probe proportional ist. Der Teststreifen ist dazu konfiguriert, durch ein Testmessgerät gelesen zu werden, wobei das Testmessgerät einen Nicht-LDL-Cholesterin-Wert von dem zweiten Stapel erhält und den Nicht-LDL-Cholesterin-Wert von einem Gesamtcholesterinwert, der von dem ersten Stapel erhalten wird, subtrahiert, um einen LDL-Cholesterin-Wert in der Probe zu ergeben.
Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel umfasst eine Kombination aus Teststreifen und -messgerät zum Bestimmen der Konzentration von LDL-Cholesterin in einer Vollblutprobe einen Teststreifen. Der Teststreifen umfasst eine Testmatrix (einen Testmatrixstreifen), die zumindest zwei Stapel aufweist, einen ersten Stapel der zumindest zwei Stapel für Gesamtcholesterin und einen zweiten Stapel der zumindest zwei Stapel für Nicht-LDL. In den ersten Stapel sind Reagenzien integriert, um eine kolorimetrische Reaktion zu erzeugen, die zu der Menge an Gesamtcholesterin in den Proben proportional ist. In den zweiten Stapel sind Reagenzien integriert, um eine kolorimetrische Reaktion zu erzeugen, die zu der Menge an Nicht-LDL-Cholesterin in der Probe proportional ist. Die Kombination umfasst ein Testmessgerät, das dazu konfiguriert ist, den Teststreifen abzulesen. Das Testmessgerät ist dazu konfiguriert, einen Nicht-LDL-Cholesterin-Wert von dem zweiten Stapel zu erhalten und den Nicht-LDL-Cholesterin-Wert von einem Gesamtcholesterinwert, der von dem ersten Stapel erhalten wird, subtrahiert, um einen LDL-Cholesterin-Wert in der Probe zu ergeben.
Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel umfasst ein Verfahren zum Messen von LDL-Cholesterin von einem menschlichen Subjekt, das eine Blutprobe liefert, ein Bereitstellen eines Trockenteststreifens und ein Aufnehmen der Blutprobe an dem Trockenteststreifen. Das Verfahren umfasst ein Abtrennen roter Blutzellen von der Blutprobe in einer ersten Schicht des Trockenteststreifens und ein Zur-Reaktion-Bringen von Nicht-LDL-Cholesterin in der Blutprobe in einer Reaktionsschicht. Das Verfahren umfasst ein Erzeugen einer Farbänderung, die zu dem Nicht-LDL-Cholesterin proportional ist, und ein Messen der Farbänderung, um eine Menge an Nicht-LDL-Cholesterin in der Blutprobe zu ermitteln. Das Verfahren umfasst ein Subtrahieren der Menge an Nicht-LDL-Cholesterin von einer Gesamtcholesterinmenge in der Blutprobe, um eine Menge an LDL-Cholesterin für die Blutprobe zu ergeben. Optional stammt die Blutprobe von einer nicht nüchternen Person, und die resultierende Menge an LDL-Cholesterin ist genauer als die Friedwald-Gleichung. Alternativ dazu liegt eine Neigung einer Kurve, die zum Bestimmen des Nicht-LDL-Cholesterins verwendet wird, zwischen 0,90 und 1,10. Optional wird VLDL-Cholesterin nicht als LDL-Cholesterin gemessen. Alternativ dazu umfasst eine Reaktionsschicht ein POE-POP-POE-Blockcopolymer, ein Tensid und ein das Reflexionsvermögen veränderndes Reagens, wobei das Zur-Reaktion-Bringen ein Löslichmachen im Wesentlichen lediglich von Nicht-LDL-Cholesterin-Analyten umfasst, wobei die Nicht-LDL-Cholesterin-Analyten mit dem das Reflexionsvermögen verändernden Reagens reagieren, um ein Reflexionsvermögen der Blutprobe zu verändern. Optional ist das POE-POP-POE-Blockcopolymer aus der Liste ausgewählt, die aus Pluronics L101: MW 3800, POE₇-POP₅₄-POE₇; Pluronics L121: MW 4400, POE₅-POP₆₈-POE₅; Pluronics P123: MW 5750, POE₂₀-POP₇₀-POE₂₀; und Pluronics F127: MW 12600: POE₁₀₆-POP₇₀-POE₁₀₆ besteht. Bei einer Alternative ist das Tensid Triton-X. Optional umfasst das Verfahren ein Verteilen der Blutprobe mit einer Verteilungsschicht, die auf der ersten Schicht orientiert ist. Bei einer Alternative umfasst das Verfahren ferner ein Zur-Reaktion-Bringen der Blutprobe in einer Gesamtcholesterin-Reaktionsschicht, wobei die Gesamtcholesterin-Reaktionsschicht dazu orientiert ist, einen Teil der Blutprobe von der Verteilungsschicht aufzunehmen; eine zu einem Gesamtcholesterin proportionale Farbänderung zu erzeugen; und eine Farbänderung zu messen, um die Gesamtcholesterinmenge in der Blutprobe zu ermitteln. Optional umfasst der Teststreifen eine sekundäre Blutabtrennschicht neben der Erythrozytenabtrennschicht, wobei die sekundäre Blutabtrennschicht zusätzliche rote Blutzellen von der Blutprobe abtrennt, wobei die sekundäre Blutabtrennschicht ferner Dextransulfat umfasst. Alternativ dazu umfasst die erste Schicht D-23-Borsilikat-Glasfaser, die mit Phaselous Vulgaris (PHA-P) Lectins imprägniert ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
1a und 1b zeigen Reaktionskinetikdaten, die an einem Klinische-Chemie-Analysator (beispielsweise Roche Cobas Integra 400+) für ein aus zwei Reagenzien bestehendes System gesammelt werden, wobei Pluronics L121 und Triton X-100 verwendet werden, um eine Selektivität für Nicht-LDL-Cholesterin zu demonstrieren;
2a und 2b zeigen einen Vergleich der Reaktion (Kinetik) der HDL- und LDL-Fraktionen in einem reagensbasierten System mit und ohne Triton-X und Pluronics P123;
3a zeigt die Reaktionskinetik in Bezug auf Prozent Reflexionsgrad (% R) und einen experimentellen Test (P123 und Triton-X);
3b zeigt die Linearisierung der %R-Graphen unter Verwendung einer Kubelka-Munk-Gleichung der 3a;
4a–4b zeigen kinetische Diagramme in Bezug auf K/S von Streifen, die bei zwei verschiedenen Blutspendern getestet wurden, Bedingung 1 ist Kontrolle mit Triton X-100, während Bedingung 2 Versuchsteststreifen sind, die P123 & Triton X-100 enthalten;
5a–5h zeigen Graphen von Tests mit P123 und Triton X-100, die die einzigen Wechselbeziehungen mit diversen Analyten zeigen;
6 zeigt die nicht-hämolytischen Eigenschaften eines Gemischs aus P123 und Triton X-100;
7 zeigt einen Kontrolltest einer aktuellen Reaktionsschicht von Polymer Technology Systems, Inc. (PTS), die 2% P123 und 0,1% Triton X-100 umfasst; und
8a–8d zeigen Konzentrationstests für verschiedene Kombinationen von Dextransulfat.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine gewisse Terminologie wird hierin lediglich der Zweckmäßigkeit halber verwendet und soll nicht als Einschränkung der Ausführungsbeispiele eines Teststreifens für im nicht-nüchternen Zustand gewonnenes LDL verstanden werden. In den Zeichnungen werden dieselben Bezugszeichen verwendet, um in allen Figuren dieselben Elemente zu bezeichnen.
Die Worte „rechts”, „links”, „vorne” und „hinten” bezeichnen Richtungen in den Zeichnungen, auf die Bezug genommen wird. Die Worte „nach innen” und „nach außen” beziehen sich auf Richtungen hin zu bzw. weg von dem geometrischen Zentrum des Teststreifens für im nicht-nüchternen Zustand gewonnenes LDL und benannte Teile desselben. Die Terminologie umfasst die oben speziell erwähnten Worte, Ableitungen derselben und Worte ähnlicher Bedeutung. Die Zeichnungen sind proportional.
Gleiche Bezugszeichen bezeichnen ähnliche oder entsprechende Teile in allen Ansichten und unter besonderer Bezugnahme auf jede der Figuren, wie sie nachstehend geschildert werden.
Kurz gesagt wurde ein Assay für im nicht-nüchternen Zustand gewonnenes LDL erzeugt, bei dem das gesamte Nicht-LDL zur Reaktion gebracht und gemessen und anschließend von einer Gesamtcholesterinmenge subtrahiert wird, um die LDL-Konzentration zu ermitteln. Der Assay beruht darauf, eine Chemie bereitzustellen, die alle Cholesterine, die nicht LDL sind, für eine Messung löslich macht. Bei manchen Ausführungsbeispielen umfasst die Chemie Triton X-100 und Pluronics P123. Bei manchen Ausführungsbeispielen ist ein anfänglicher unvollständiger Ausfällschritt enthalten, um die resultierende Beseitigung von LDL zu verbessern. Bei manchen Ausführungsbeispielen ist diese anfängliche unvollständige Ausfällung vorgesehen, und um die Selektivität von Triton X-100 und Pluronics P123 zu verbessern, umfasst sie zusätzlich ein Hinzufügen von Dextransulfat/Mg⁺², was den systematischen Fehler (engl.: bias) des Assays auf maximal 10% bringt. Der Assay wird als im nicht-nüchternen Zustand erfolgend bezeichnet, da der Assay spezifisch genug ist, dass die Genauigkeit nicht durch das Vorhandensein von Chylomikronen beeinträchtigt wird. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist die Fähigkeit des Assays, Dichteklassen von Lipoprotein ohne die Verwendung standardmäßiger Ultrazentrifugierung zu isolieren, einzigartig und resultiert aus der selektiven Löslichmachung von Lipoproteinpartikeln, die sich bezüglich ihrer Dichte unterscheiden, wobei LDL ausgeschlossen ist.
Wie oben erwähnt wurde, ist es wünschenswert, eine direkte LDL-Messtechnologie zu haben, die sich nicht auf von Gesamtcholesterin ausgehende schätzungsbasierte Berechnungen stützt. Da es wünschenswert wäre, einen derartigen Assay zu haben, analysierten Anmelder das Patent von Kyowa-Medex. Der Autor des Patents von Kyowa-Medex ( US 6,794,157 B1 ), Hirochi Sugiuchi, benennt ein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen(POE-POP)-Triblock-Copolymer, Pluronics L121, als entscheidende Komponente zum direkten Messen von LDL in einem wässrigen, auf zwei Reagenzien basierenden System („Nasschemie”), das auf einen Klinische-Chemie-Analysator von Roche wie beispielsweise Integra 917, Modula P und Cobas Integra 400+ angewendet wird. Nasschemie-Systeme unterscheiden sich beträchtlich von Trockenteststreifensystemen darin, dass Reagenzien von Nasschemie-Systemen zu bestimmten Zeiten hinzugefügt werden können und dass deshalb die Zeitgebung sorgfältig gesteuert werden kann. Ferner werden bzw. sind bei Nasschemie-Systemen alle Reagenzien tendenziell mobilisiert und aktiv im Gegensatz zu Trockenteststreifen, die aufgrund einer qualitativen Verschlechterung und anderer Mobilisierungsprobleme höhere Konzentrationen an Reagenzien erfordern können. Nachforschungen bezüglich dieser Komponente zeigten, dass sie keine Selektivität für LDL an sich aufwies. Das Patent erwähnt kurz die Verwendung von mehreren Cotensiden (wobei ein derartiges Beispiel die Verwendung von Emulgen L40) ist, alpha-sulfatierten Zyklodextrinen und Enzymen, was zu der anfänglichen Annahme ihrer relativ geringfügigen Rolle bei der Reaktion führt. Nach dem mangelnden Erfolg eines Untersuchens von Pluronics L121 auf eine LDL-Selektivität in einem zwei Reagenzien umfassenden Format wie dem von Sugiuchi wurde klar, dass diese Zusatzstoffe wesentlicher waren als zuvor gedacht. Ferner hat man festgestellt, dass Emulgen L40 (von Kao Corporation hergestellt) nicht im Handel erhältlich ist; und wir glauben, dass Kyowa-Medex exklusive Rechte an diesem Cotensid hat. Anmelder haben die in der U.S.-Patentschrift Nr. 6,794,157 B1 umrissene Methodologie wiederholt gründlich getestet; jedoch wird angenommen, dass gesetzlich geschützte Verfahren und Reagenzien nicht offenbart wurden oder der Öffentlichkeit nicht zur Verfügung stehen.
Nach umfassenden Nachforschungs- und Untersuchungsbemühungen, wie sie oben beschrieben wurden, die viele Tenside, Enzyme und Zuckerverbindungen abdeckten, wurde klar, dass das Patent von Kyowa-Medex nicht ohne Weiteres reproduzierbar war. Ein gewisses gesetzlich geschütztes Verfahren wurde ausgeschlossen, was verhinderte, dass ein weiterer erfolgreicher, aus einem Schritt bestehender LDL-Assay geschaffen wurde. Jedoch ergaben manche Kombinationen von Pluronics L121 mit Triton X-100, von dem man weiß, dass es Lipoproteine unterschiedslos strippt, interessante Ergebnisse bei einem auf zwei Reagenzien basierenden System, wie es an einem Klinische-Chemie-Analysator beobachtet wurde.
Im Rahmen von Bemühungen, einen bezüglich LDL selektiven Test zu identifizieren, der zu einem Trockenteststreifen führt, wurde ein grundlegenderer Ansatz verfolgt, um die Rolle von L121 und Triton X-100 umfassend zu verstehen. Anfänglich wurde ein ähnlicher, auf zwei Reagenzien beruhender („Nasschemie”-)Lösungsansatz verwendet. Wie aus der nachstehenden Reaktionskinetik ersichtlich ist (1a und 1b; Daten, die an einem Klinische-Chemie-Analysator gesammelt wurden), reagierte das HDL (Trendlinie 100) mit einer viel schnelleren Rate als die LDL-Fraktion (Trendlinie 110). Bei diesen Graphen wird die Probe bei Punkt 120 hinzugefügt. Dieses Ergebnis war höchst unerwartet, da Triton X-100 traditionell als allgemeines Tensid verwendet wird, um all die Lipoproteine löslich zu machen, und vorwiegend als Tensid der Wahl für einen Gesamtcholesterin-Assay verwendet wird. Deshalb führt die Kombination einer Verbindung, die dafür bekannt ist, alle Lipoproteine löslich zu machen, in Kombination mit einer Verbindung, von der man annimmt, dass sie nur LDL löslich macht, in der Tat zu einem Ergebnis, dass das gesamte Nicht-LDL löslich gemacht wird. 1a (HDL) und 1b (LDL) zeigen Graphen bezüglich Absorbanz gegenüber der Zeit einer TX100/L121-Lösung, die mit einer Enzyme/MAOS-N-Ehtyl-N-(2-Hydroxy-3-Sulfopropyl)-3,5-Dimethylanilin/4AAP (pH-Wert 6,8), Natriumsalzlösung kombiniert wurde, um eine endgültige Tensidlösung 0,25% TX100/0,5% L121 zu erzielen. Dieses Reagens wird dann bei der Marke 120 mit einer Probe kombiniert, und bis zum Ende der Reaktion werden in definierten Abständen Messungen vorgenommen. Man bedenke, dass die Menge an verwendetem Triton-X viel geringer ist als üblicherweise zum Löslichmachen aller Lipoproteine verwendet wird. Kurz gesagt, im Rahmen von Bemühungen, dem U.S.-Patent Nr. 6,794,157 B1 zu entsprechen, den LDL-Assay zu wiederholen und eine direkte LDL-Messung zu erzielen, wurde ein völlig anderes Ergebnis erzielt. Gemäß den in der Tabelle 1 aufgeführten Patentbeispielen verwendeten die Autoren 0,2% Pluronics L121 und 0,1% Emulgen 911, um eine hohe LDL-zu-HDL-Selektivität zu erzielen. Nach Wiederholen derselben Konzentrationen in unserem Labor beobachteten wir eine hohe HDL-zu-LDL-Selektivität, was dem Anspruch des U.S.-Patents Nr. 6,794,157 B1 entgegensteht. Ein Titrieren einer anderen Kombination von Emulgen 911 und L121 ergab nur dieselbe Selektivität (hohes HDL:LDL) und manchmal keine gegenteilige Selektivität. Diese Umkehr der Selektivität führte zum Testen mit TX-100 und anderen Octylphenolen und Nonylphenolen.
Ursprünglich dachte man, dass dies zu einem Assay führen würde, der nur LDL zur Reaktion bringen würde. Stattdessen zeigen die Testergebnisse, dass das Potential für einen Test, der alle anderen Bestandteile außer LDL zur Reaktion bringt. Obwohl dies das Gegenteil der ursprünglich gewünschten Reaktion ist, wurde ein Assay ermittelt, in dem das gesamte Nicht-LDL zur Reaktion gebracht wird und man den Wert von einem bekannten Gesamtcholesterinwert subtrahiert. Obwohl dieses Verfahren kein direktes Verfahren ist, bietet es dennoch mehrere Vorteile gegenüber der Friedwald-Gleichung. Die größte Unzulänglichkeit der Friedwald-Gleichung ist die Schätzung von VLDL, das man als 1/5 der Konzentration von Triglyceriden annimmt. Für viele Menschen trifft dies nicht zu, und die Friedwald-Gleichung unterschätzt üblicherweise LDL für nicht-nüchterne Personen. Diese Probleme würden gelöst, indem man Nicht-LDL (HDL + VLDL + CM) misst, was einen LDL-Wert liefert, der identisch mit einem direkten LDL-Assay ist.
Pluronics L121 zeigte eine überraschende HDL-Selektivität, wenn es mit Triton X-100 löslich gemacht wurde. Deshalb wurde schlussgefolgert, dass Kombinationen von Triton X-100 und POE_X-POP_Y-POE_X eine hohe Spezifität für HDL- und alle Nicht-LDL-Cholesterine liefern könnten. Man erachtete es als lohnendes Experiment, verschiedene Pluronics-Serien auszuprobieren, um zu versuchen, diese Selektivität zu erhöhen. Bei manchen Ausführungsbeispielen werden optional verschiedene Pluronics verwendet, einschließlich, aber nicht beschränkt auf:

• Pluronics L101: MW 3800, POE₇-POP₅₄-POE₇;
• Pluronics L121: MW 4400, POE₅-POP₆₈-POE₅;
• Pluronics P123: MW 5750, POE₂₀-POP₇₀-POE₂₀;
• Pluronics F127: MW 12600, POE₁₀₆-POP₇₀-POE₁₀₆

Das Reagens wurde hergestellt, indem 0,7 ku Cholesterinesterase, 0,5 ku Cholesterinoxidase, 12 ku Meerrettichperoxidase in MOPS-Puffer mit 0,58 mM 4-Aminoantipyrin und 2,9 mM MAOS kombiniert wurden, worauf die folgenden Konzentrationen von Gemischen aus Pluronics (P123) und Triton X-100 folgten. Dieses Reagens wurde an einem automatisierten Klinische-Chemie-Analysator (nämlich Cobas Integra 400+ von Roche) getestet, um die Selektivität zu bestimmen. Die nachstehende Tabelle zeigt die Selektivität. Die höchste beobachtete Selektivität von ~15:1 HDL:LDL lag bei einem Verhältnis von 10:1 von P123:Triton X-100. In den 2a & 2b ist ein Vergleich der HDL- und LDL-Fraktionen gezeigt, die unter ähnlichen Bedingungen wie in 1a und 1b reagieren, wobei eine abschließende Tensidkonzentration aus 0,01% P123/0,0005% TX100 bestand. Zyklus 28, Marke 255, gibt die Reaktion etwa 2 Minuten nach der Zugabe einer Probe an, wobei er eine mögliche Zeitgrenze für eine Teststreifenablesevorrichtung, beispielsweise den Cardiochek-Assay, benennt. 2a zeigt die Kombination aus P123 und Triton X-100, wobei die HDL-Trendlinien 205, die LDL-Trendlinien 215 und die VLDL-Trendlinien 210 gezeigt sind. 2b zeigt lediglich P123 ohne Triton X-100-Bedingung, wobei sie die HDL-Trendlinie 240, die LDL-Trendlinie 250 und die VLDL-Trendlinie 245 zeigt. Dies demonstriert deutlich eine Selektivität für HDL vor LDL.

Verhältnisse und Konzentrationen von P123:Triton X-100	HDL:LDL-Selektivität
1:1
1%:1%	1,17
0,1%:0,1%	2,32
0,01%:0,01%	2,57
3:1
1%:0,33%	1,84
0,1%:0,033%	3,86
0,01%:0,0033%	5,40
6:1
1%:0,165%	6,28
0,1%:0,0165%	9,65
0,01%:0,00165%	5,29
10:1
1%:0,1%	10,71
0,1%:0,01%	14,82
0,01%:0,001%	5,22
20:1
0,1%:0,005%	9,56
0,01%:0,0005%	8,72

Tabelle 1: Selektivität und Konzentration für P123 und Triton X-100.

Gemäß der Tabelle 1 scheint die beste Konzentration für „Nasschemie” ungefähr 10:1 zu betragen.
P123 ist ein größeres, hydrophileres POE-POP-Copolymer, von dem man feststellte, dass es viel leichter löslich gemacht wurde als L121, was ermöglichte, dass größere Konzentrationen und Verhältnisse getestet wurden. Die Selektivität für HDL zu LDL ist bei Zyklus 28 sehr hoch (10:1), was zur Verwendung von P123 als des am stärksten optimierten Tensids der Wahl führte, das mit Triton X-100 zu verwenden ist, um Nicht-LDLs selektiv löslich zu machen.
Deshalb umfassen Ausführungsbeispiele einer Reagenskombination, die in Bezug auf Nicht-LDL-Cholesterine selektiv ist, Kombinationen von Triton X-100 und POE_X-POP_Y-POE_X. Optional umfassen diese Kombinationen Verbindungen von POE_X-POP_Y-POE_X, die eine relative Molekülmasse zwischen 2.500 und 15.000 haben. Optional liegt die relative Molekülmasse zwischen 4.000 und 10.000. Optional liegt die relative Molekülmasse zwischen 5.000 und 7.000. Optional liegt die relative Molekülmasse des POE_X-POP_Y-POE_X bei 5.750.
Das „Nasschemie”-Protokoll, das zum Identifizieren der Eigenschaften dieser Tenside verwendet wird, war notwendig, um die vielen getesteten Tenside/Inhaltsstoffe zu untersuchen. Jedoch erforderte eine Übertragung auf einen Trockenteststreifen ein beträchtliches Neuoptimieren von Konzentration und Verhältnissen. Der auf zwei Reagenzien beruhende „Nasschemie”-Lösungsansatz diente nicht länger einem weiteren Zweck auf einem klinischen Analysator. Ursprünglich waren auf zwei Reagenzien beruhende Systeme von Interesse, da bei einem Trockenteststreifen nicht mehrere Reagenzien zu unterschiedlichen Zeiten hinzugefügt werden können, um verschiedene Teile der Reaktion durchzuführen. Alle Reagenzien müssen dann, wenn die Probe aufgebracht wird, in dem Teststreifen vorliegen. Je mehr Reagenzien bei einem Nasschemie-Test benötigt werden, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass sich die Reagenzien gegenseitig beeinflussen und dadurch die Effizienz des Tests beeinflussen, wenn sie alle in einem Trockenteststreifen platziert und gleichzeitig benetzt werden. Auch bei der Umwandlung zu einem Trockenteststreifen wird üblicherweise eine viel höhere Konzentration an Reagenzien benötigt.
Um ein funktionierendes Teststreifensystem zu entwickeln, wurde der Teststreifen bei einem Ausführungsbeispiel wie folgt angeordnet. Bei einem auf zwei Reagenzien beruhenden System lieferte das Verhältnis von 10 Teilen P123 zu einem Teil Triton X-100 die besten Ergebnisse, wobei die Konzentration von Triton X-100 bei 0,01% lag. Bei dem vorherigen Gesamtcholesterin-Assay von Polymer Technology Systems, Inc. (PTS) liegt die Triton X-100-Konzentration bei 0,1%. Die Reagenzien für einen Trockenteststreifen wurden hergestellt, indem Biodyne A von Pall mit einer Lösung aus 241 ku/L Cholesterinesterase, 74 ku/L Cholesterinoxidase, 232 ku/L Peroxidase in MOPS-Puffer mit 5 mM 4-Aminoantipyren und 40 mM MAOS (N-Ethyl-N-(2-Hydroxy-3-Sulfopropyl)-3,5-Dimethylanilin, Natriumsalz), gefolgt von den folgenden Konzentrationen des Systems aus P123:Triton X-100, imprägniert wird. Die Lage wurde vor dem Herstellen der Trockenteststreifen in einem Trockentunnel mit konstanter Temperatur getrocknet. Bei Teststreifen wird eine höhere Konzentration an Bestandteilen benötigt, um ähnliche Ergebnisse wie bei Nasschemie-Umgebungen zu erhalten. Als Ausgangspunkt für den Nicht-LDL-Assay verblieb die Konzentration an TX-100 für einen direkten Vergleich mit einem Gesamtcholesterinstreifen bei 0,1%. Die Enzymkonzentration wurde ebenfalls auf demselben Niveau gehalten wie bei der PTS-Gesamtcholesterin-Reaktionsmembran. Um ein Verhältnis von 10:1 aufrechtzuerhalten, wurde die P123-Konzentration auf 1% erhöht, und der pH-Wert wurde auf 6,8 angehoben. Anschließend wurde eine Biodyne-A-Membran von 0,45 μ mit dem Reagens beschichtet und bei Raumtemperatur getrocknet.
Das Nicht-LDL-Biodyne wurde unter Verwendung des folgenden Formats in Einzelanalyt-Teststreifen gegossen:

Blutverteilungsschicht Petex

Blutabtrennschicht Alhstrom 144

Sekundäre Blutabtrennschicht Cytosep 1660

Reaktionsmembran Nicht-LDL-Reaktionsmembran

Tabelle 2: Zeigt ein Beispiel eines Nicht-LDLs gemäß vorliegend beschriebenen Methodologien.
Anschließend wurden die Streifen mit einer HDL-Fraktion (178 mg/dL), einer LDL-Fraktion (188 mg/dL) und einem Fraktionsgemisch (368 mg/dL) auf Messgeräten getestet, die einen prozentualen Reflexionsgrad (% R) aufzeichneten, wie er auf einem CardioChek^®-Messgerät bis zum Abschluss der Reaktion gemessen wurde. 3a und 3b zeigen die % R bzw. K/S für einen experimentellen Test (P123 und Triton-X) einer Probe, die HDL 325, 360, LDL 320, 365, und ein Gemisch aus (HDL:LDL) 330, 350 zeigte. Der Reflektionsgrad wurde unter Verwendung einer Kubelka-Munk-Gleichung in K/S-Einheiten umgewandelt, um eine lineare Beziehung bezüglich der Konzentration (ähnlich der Absorbanz) zu bilden, wo die Verringerung der Konzentration direkt proportional zu der Verringerung an K/S ist.
Die Ergebnisse mit den Versuchsstreifen, die P123 enthielten, waren sehr ermutigend. Die LDL- und die HDL-Fraktion waren bezüglich ihrer Konzentrationen ungefähr äquivalent (was durch eine andere Testmethodologie, die Integra, bestätigt wurde), und das Gemisch betrug etwa das Doppelte der Reaktion beider einzelner Fraktionen. Die Hinzufügung des Gemischs aus P123:Triton X-100 verringerte die kinetische Spur der LDL-Fraktion und des Gemischs beträchtlich, während es die HDL-Fraktion nur geringfügig hemmte. Dies legt nahe, dass der Großteil der Mischreaktion, die mit P123-Streifen beobachtet wird, aus HDL besteht. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Lipoproteinfraktionen einer verringerten Konzentration beobachtet. Wie die Ergebnisse zeigen, ist das durch eine LDL-Fraktion erzeugte Reflexionsvermögen im Vergleich zu dem Reflexionsvermögen, das durch eine HDL-Fraktion einer ungefähr äquivalenten Konzentration hervorgerufen wird, verringert. Das Reflexionsvermögen steht mit der Menge an zur Reaktion gebrachter Fraktion in der Probe in Wechselbeziehung (Wechselbeziehung). Je höher das Reflexionsvermögen, desto weniger Analyt steht zur Reaktion zur Verfügung. Deshalb weist ein hohes Reflexionsvermögen für die LDL-Fraktion, wie gezeigt ist, auf eine geringe Menge an LDL-Cholesterin hin, die zur Erfassung zur Verfügung steht. Da das Reflexionsvermögen nicht linear mit der Konzentration eines Analyten in Wechselbeziehung steht, werden K/S-Auftragungen erzeugt, die eine lineare Beziehung zu der Konzentration eines Analyten liefern. Für den Zweck der Quantisierung, und um eine beobachtbare verringerte LDL-Reaktivität/ein verringertes LDL-Reaktionsvermögen zu bestimmen, werden beim weiteren Vorgehen lediglich K/S-Auftragungen verwendet.
Das „Nasschemie”-Protokoll, das zum Identifizieren der Eigenschaften dieser Tenside verwendet wird, war notwendig, um die vielen getesteten Tenside/Inhaltsstoffe zu untersuchen. Jedoch erforderte eine Übertragung auf einen Trockenteststreifen ein beträchtliches Neuoptimieren von Konzentration und Verhältnissen. Der auf zwei Reagenzien beruhende „Nasschemie”-Lösungsansatz diente nicht länger einem weiteren Zweck auf einem klinischen Analysator. Bei einem Nasschemie-Ansatz können Reagenzien zu den entsprechenden Zeiten hinzugefügt werden. Im Gegensatz dazu sind derartige Zeitgebungsmechanismen bei Trockenteststreifen allgemein nicht möglich, da die Reagenzien bei den Teststreifen vorimprägniert werden müssen. Außerdem ist die Konzentration an Reagenzien, die bei Teststreifen benötigt wird, üblicherweise viel höher, da Reagenzien während des Trocknungsvorgangs eventuell deaktiviert werden.
Schließlich wurde Vollblut getestet, um zu bestimmen, ob die Matrix von Blut die Funktion von P123 und TX100 stören würde. Farbe wurde reduziert, und die K/S-Werte der P123-Streifen zwischen den zwei Blutproben waren proportional zu der Menge an Nicht-LDL in den nativen Blutproben. 4a bis 4b zeigen kinetische Diagramme von Streifen, die mit zwei verschiedenen Blutspendern getestet wurden, Probe Nr. 254 und Spender-Kennung Nr. 66. Bedingung 1, 415, 435 stellt die Kontrolle dar; und Bedingung 2, 420, 440 stellt die P123 enthaltenden Streifen dar. Für diesen Test wurde der Endpunkt des Messgeräts auf eine 0,01% R betragende Änderung alle zwei Sekunden erweitert, um eine vollständige kinetische Reaktion zu beobachten. Der rote Datenpunkt gibt einen typischen Messgerät-Endpunkt an, der eine Veränderung des Reflexionsvermögens von < 0,2% als Reaktionsverlauf angibt.
Daten aus dem Vollbluttest zeigten, dass ein reproduzierbares Verfahren eines Unterscheidens zwischen LDL und Nicht-LDL bei einem Teststreifenformat möglich ist.
Für diesen Test wurde der Endpunkt des Messgeräts auf eine 0,01% R betragende Änderung alle zwei Sekunden erweitert, um eine vollständige kinetische Reaktion zu beobachten. Der rote Datenpunkt gibt einen typischen Messgerät-Endpunkt an, der eine Veränderung des Reflexionsvermögens von < 0,2% als Reaktion angibt. Dies erfolgte, um zu bestätigen, dass sich das kinetische Profil von Nicht-LDL in Richtung Vervollständigung bewegt.

Erfolgskriterium bei einem Trockenteststreifen war das höchste Maß an Formelsammlung-Selektivitätspräferenz für HDL, z. B. gibt ein Verhältnis von 5:1 (HDL:LDL) ein hohes Maß an HDL-Selektivität an. Wie in der nachstehenden Tabelle zu sehen ist, lieferte somit das Verhältnis von 20:1 von P123:Triton X-100 die gewünschte Selektivität.

Verhältnisse und Konzentrationen von P123:Triton X-100	HDL:LDL-Selektivität
10:1
0,5%:0,05%	2,29
1%:0,1%	3,62
2%:0,2%	3,72
15:1
0,75%:0,05%	4,95
1,5%:0,1%	3,69
3%:0,2%	3,50
20:1
1%:0,05%	3,56
2%:0,1%	5,11
4%:0,2%	4,00

Tabelle 3: Auswählen des Verhältnisses von P123 zu Triton X-100.

7 zeigt einen Versuchsteststreifen, der eine aktuelle Reaktionsschicht von Polymer Technology Systems, Inc. (PTS) umfasst, die 2% P123 und 0,1% Triton X-100 enthält, wobei eine Trendlinie 810 ein Gemisch aus LDL und HDL darstellt, eine Linie 815 HDL darstellt und eine Linie 820 LDL darstellt. Bei einer HDL:LDL-Selektivität von 5:1 wird eine gute Unterdrückung von LDL beobachtet, wobei das Gemisch aus sowohl LDL- als auch HDL-Fraktionen in gleichen Konzentrationen besteht, wodurch sich ein ähnlicher Wert für die Gesamt-HDL-Fraktion ergibt.
Bisherige Studien beschrieben den ersten Ausflug in die Trockenstreifentechnologie, wobei sie die Kinetik der Reaktionsmittel der Quantifizierung erfassten und das Potential der Chemie demonstrierten.

Der Vorstoß in die Trockenstreifenchemie sah sehr vielversprechend aus, die Ergebnisse konnten jedoch nicht mehr mit Lipoproteinfraktionen und Reaktionskinetik quantifiziert werden. Unter Verwendung von Proben frischen Serums wurden Streifen, die P123/Triton X-100 enthielten, mit Nicht-LDL in Wechselbeziehung gebracht, das auf einem Klinische-Chemie-Analysator erhalten wurde, wobei eine Kalibrierungskurve erhalten wurde, um jeden Datenpunkt auf einen Nicht-LDL-Wert zu setzen. Anschließend wurde jeder Datenpunkt von dem mittels Integra ermittelten Gesamtcholesterin subtrahiert, um einen Wert eines „gemessenen LDL” zu ergeben. Ein In-Wechselbeziehung-Bringen des gemessenen LDL-Werts mit dem Wert des Integra-Direkt-LDLs lieferte eine Angabe eines etwaigen systematischen Fehlers in dem Nicht-LDL-Assay.

Bedingung	Nicht-LDL R²	Gleichung Nicht-LDL gegenüber K/S	LDL-Gleichung	LDL R²
pH 5,4; 1% P123	0,6212	y = 0,0183x + 0,119	y = 0,7731x + 30,224	0,8729
pH 5,4; 2% P123	0,661	y = 0,0159x + 0,1843	y = 0,7662x + 31,028	0,9041
pH 5,4; 3% P123	0,6511	y = 0,0165x – 0,0285	y = 0,7941x + 27,424	0,8882
pH 6,8; 1% P123	0,8017	y = 0,0163x – 0,0632	y = 0,8533x + 19,451	0,9544
pH 6,8; 2% P123	0,8503	y = 0,0126x + 0,025	y = 0,86x + 19	0,9736
pH 6,8; 3% P123	0,8253	y = 0,0108x – 0,0231	y = 0,8612x + 18,517	0,9625
pH 7,4; 1% P123	0,7916	y = 0,0105x + 0,0206	y = 0,813x + 24,918	0,9635
pH 7,4; 2% P123	0,7182	y = 0,0099x + 0,0193	y = 0,7707x + 30,691	0,9418
pH 7,4; 3% P123	0,8278	y = 0,0098x – 0,0368	y = 0,8553x + 19,841	0,9661

Tabelle 4: Listet die Wechselbeziehungsergebnisse aus drei verschiedenen P123-Konzentrationen bei drei verschiedenen pH-Pegeln auf.

Eine pH-Studie, die mit einer sich verändernden P123-Konzentration bei einem konstanten Verhältnis von 10:1 von P123:Triton X-100 gekoppelt war, wurde mit Serum getestet, um etwaige Abhängigkeiten zu untersuchen. Alle neun Bedingungen wurden am selben Tag mit 12 verschiedenen Serumproben getestet, einmal über fünf Meter hinweg.
Aus den obigen Daten geht klar hervor, dass P123 eine gewisse Selektivität für Nicht-LDL liefert. Ein pH-Wert von 5,4 scheint weniger wünschenswert, da die Nicht-LDL-Kurven sehr ähnlich aussehen wir ein Gesamtcholesterin-Teststreifen; und ein pH-Wert von 7,4 erscheint ebenfalls weniger linear als Streifen bei einem pH-Wert von 6,8. Von den Streifen mit einem pH-Wert von 6,8 bildet 1% P123 in Bezug sowohl auf die Genauigkeit als auch auf einen systematischen LDL-Fehler das Schlusslicht. 2% P123 wies ein besseres R2 auf als 3%, jedoch wiesen die Streifen, die 3% P123 enthielten, einen etwas geringeren systematischen LDL-Fehler auf. Die Neigung der abschließenden LDL-Gleichung, die das Niveau eines systematischen Fehlers in dem Assay angibt, legt nahe, dass ein Teil des LDL immer noch mit den Nicht-LDL-Streifen in Wechselwirkung steht.
Deshalb wurde ermittelt, dass Kombinationen von Triton X-100 und POE_X-POP_Y-POE_X zur Verwendung bei Teststreifen von einem pH-Wert von ungefähr 5,4 bis ungefähr 8 verwendbar sind. Optional beträgt der pH-Wert von 6 bis 7,5. Optional liegt der pH-Wert bei 6,8. Deshalb wurde ermittelt, dass Kombinationen von Triton X-100 und POE_X-POP_Y-POE_X zur Verwendung bei Teststreifen in einem Verhältnis von 0,1% Triton X-100 zu zwischen 0,5% bis 5% POE_X-POP_Y-POE_X vorliegen. Optional liegt das Verhältnis bei 0,1% Triton X-100 zu zwischen 1% bis 3% POE_X-POP_Y-POE_X. Optional liegt das Verhältnis bei 0,1% Triton X-100 zu 2% POE_X-POP_Y-POE_X. Bei manchen Ausführungsbeispielen wird P123 für die verschiedenen Kombinationen aus pH-Wert und Triton X-100 gewählt.
Es ist erwähnenswert, dass während des Verlaufs wissenschaftlicher Untersuchungen bestimmt wurde, dass eine neue Borsilikat-Glasfaser-Membran D-23 von IW Treamont, die mit Phaseolous Vulgaris Lectins PHA-P imprägniert war, eine bessere Leistung lieferte als das „Non-Woven Tuffglass” (Alhstrom 144) von Pall.
Das Ziel beim weiteren Vorgehen bestand darin, die Übereinstimmung (Neigung) zu erhöhen und sie im Vergleich zu LDL-Werten, die auf Roche LDL C+ erhalten wurden, nahe an Eins heran oder in den Bereich von 0,90 bis 1,10 zu bringen, und den Niveau-Unterschied (engl.: intercept) vorzugsweise auf ≤ 5 mg/dL zu verringern.
Bei manchen Alternativen wird die Neigung der Kurve verbessert, indem ein Teil des LDL vor der Mobilisierung der Nicht-LDL-Cholesterine ausgefällt wird. Dies ermöglicht, dass das P123/TX100-System und die LDL-Kurve 0,9x für die Neigung übersteigen, was für einen erfolgreichen Assay als wünschenswert angesehen wurde. Obwohl viele Chemien für ein Vorab-Ausfällen von LDL verwendet werden können, wird bei manchen Ausführungsbeispielen Dextransulfat gewählt. Bei manchen Ausführungsbeispielen kann Polyvinylsulfat verwendet werden, um LDL vor der Behandlung von Triton X-100 und POE_X-POP_Y-POE_X, die oben beschrieben wurde, auszufällen.
Frühe LDL-Assays von Boehringer Mannheim (Polyvinylsulfat) und Immuno AG (Dextransulfat) verwendeten eine Polyanion-Ausfällung, um LDL auszufällen und den Unterschied an Gesamtcholesterin vor und nach der Ausfällung zu messen. Siekmeir, Rudiger, Clinical Chemistry, 1990; 36(12):2109–2113, untersucht die Zuverlässigkeit dieser Assays und eine Wechselbeziehung hinsichtlich Betaquantifizierung. Beide Assays unterlagen bei den Polyanion-Konzentrationen, die benötigt wurden, um das gesamte LDL in der Probe auszufällen, einer gewissen VLDL-Mitfällung, wobei das Dextransulfat-Verfahren weniger VLDL ausfällte.
Während die obigen Verfahren alleine nicht ausreichend sind für einen präzisen LDL-Assay, werden Spurenmengen an Polyanionen verwendet, um einen Teil des LDL zu beseitigen, jedoch bei ausreichend niedrigen Konzentrationen, um das VLDL intakt zu lassen. Die zugrunde liegende Idee besteht darin, dass die LDL-Partikel verringert werden könnten, bevor sie mit der Nicht-LDL-Reaktionsmembran zur Reaktion gebracht werden, wodurch die Menge an LDL, die die Nicht-LDL-Membran ausschließen muss, verringert wird. Zu viel Polyanion (beispielsweise Dextransulfat) eliminiert die Selektivität für LDL.

Der erste Schritt in Richtung dieses Lösungsansatzes erforderte ein Experiment, das zeigte, dass ein Teil des LDL ausgefällt werden konnte, ohne das Nicht-LDL zu beeinträchtigen. Dextransulfat einer relativen Molekülmasse von 5 K, 10 K, 50 K und 500 K wurde mit 150 mM MgCl₂ getestet, wobei 500 K Dextransulfat als am geeignetsten ermittelt wurde.

Verhältnis (LDL-Fraktion:Reagens)		Integra TC (mg/dL)	Integra HDL (mg/dL)	Integra LDL (mg/dL)	VLDL (TC-HDL-LDL)
20:1	Kontrolle (Sole)	216,5	2,1	171,9	42,5
20:1	0,15% 500 K Dextransulfat/150 mM MgCl	179,9	1,9	134,9	43,1

Tabelle 5: Die Ergebnisse von 20 Teilen einer LDL-Fraktion, die mit 1 Teil eines DS-Reagens kombiniert wurde (Sole zur Kontrolle)

Unmittelbar nach der Hinzufügung von Reagens wurden Proben zentrifugiert, und der Überstand wurde auf der Integra in Bezug auf Gesamtcholesterin, HDL und LDL getestet.
5 zeigt, dass die LDL-Konzentration gesenkt wurde, ohne die VLDL- oder HDL-Konzentration zu beeinträchtigen. Diese Ergebnisse aus einem Untersuchen von Dextransulfat führten zu der Überzeugung, dass ungefähr 20% an LDL vor Ausfällung jeglichen Nicht-LDLs aus einer Probe entfernt werden könnten.
Zusammen mit einer großen Bandbreite an MgCl₂-Konzentrationen wurde eine Vielfalt an Dextransulfat (DS) mit einer relativen Molekülmasse von 5 K; 50 K; 500 K; > 500 K getestet. Die meisten Tests wurden als Reagens auf Cobas Integra 400+ durchgeführt, um die optimale Konzentration zu ermitteln. Eine Stammlösung aus Dextransulfat mit einer relativen Molekülmasse von 500 K bei 0,15% Gewicht zu Volumen mit 150 mM MgCl₂ wurde getestet, um zu ermitteln, an welchem Punkt lediglich LDLs ausgefällt werden.

Die nachstehende Tabelle 6 zeigt, dass 20 Teile einer Sole, die ein feststehendes Niveau an LDL-Fraktion enthielt, die mit 1 Teil der Lösung gemischt war, als bevorzugte Kombination hervorging. Die Konzentration an LDL wurde um ~33 mg/dL gesenkt, während die VLDL-Konzentration im Vergleich zu dem Aliquot derselben Probe, die mit Sole als Kontrolle behandelt wurde (siehe hervorgehobene Zeile), praktisch unverändert bei 43,3 mg/dL gehalten wurde. Dies zeigt, dass zumindest eine gewisse Menge an LDL in der Gegenwart von VLDL ausgefällt wurde, ohne die VLDL-Konzentration zu beeinträchtigen.

Lösungskonzentration von Dextransulfat/MgCl₂	Verhältnis LDL:Lösung DS/MgCl₂	Abschließende DS/Mg⁺²-Konzentration	Beschreibung des Tests	TC (mg/dL)	HDL (mg/dL)	LDL (mg/dL)	VLDL (TC-HDL-LDL) (mg/dL)

0,15% DS/150 mM MgCl₂	1:1	0,075% DS/75 mM MgCl₂	Kontrolle (Sole)	117,3	3	93,5	20,8
0,15% DS/150 mM MgCl₂	1:1	0,075% DS/75 mM MgCl₂	Reagens	1	0	0	1

0,15% DS/150 mM MgCl₂	5:1	0,025% DS/25 mM MgCl₂	Kontrolle (Sole)	192,2	2,3	153,5	36,4
0,15% DS/150 mM MgCl₂	5:1	0,025% DS/25 mM MgCl₂	Reagens	0,9	0,2	0	0

0,15% DS/150 mM MgCl₂	10:1	0,014% DS/13,64 mM MgCl₂	Kontrolle (Sole)	216,2	2,2	173,1	40,9
0,15% DS/150 mM MgCl₂	10:1	0,014% DS/13,64 mM MgCl₂	Reagens	49,7	2	35,5	12,2

0,15% DS/150 mM MgCl₂	20:1	0,007% DS/7,14 mM MgCl₂	Kontrolle (Sole)	229,5	1,9	182,2	45,5
0,15% DS/150 mM MgCl₂	20:1	0,007% DS/7,14 mM MgCl₂	Reagens	194,3	2,2	148,8	43,3

0,15% DS/150 mM MgCl₂	50:1	0,0029% DS/2,94 mM MgCl₂	Kontrolle (Sole)	231,5	2,1	187,9	41,5
0,15% DS/150 mM MgCl₂	50:1	0,0029% DS/2,94 mM MgCl₂	Reagens	237,6	1,6	185,1	50,9

Tabelle 6: Auswirkungen verschiedener Dextransulfat-Konzentrationen.

Aufgrund der augenblicklichen gegenseitigen Beeinflussung von Dextransulfat/MgCl₂ mit LDL war die beste Schicht, um eine LDL-Ausfällung und -Beseitigung zu platzieren, die Cytosep. Die Imprägnierung von Cytosep 1660 mit 0,15% Dextransulfat (relative Molekülmasse 500 K) mit 150 mM MgCl₂ wurden in Streifen über der Nicht-LDL-Reaktionsmembran, die P123:Triton X-100 enthielt, platziert. Ein Testen mit Vollblutproben lieferte hervorragende abschließende Wechselbeziehungen mit LDL. Dies weist darauf hin, dass ein ähnliches Verhältnis einer gegenseitigen Beeinflussung von Plasma zu Dextransulfat/MgCl₂ bei dem Teststreifen aufrechterhalten wird oder vorliegt wie das, das bei nachstehend hervorgehobenen Testproben beobachtet wurde.
Eine Titrationsstudie wurde unter Verwendung von LDL-Fraktionen in bekannten Konzentrationen durchgeführt, um die Niveaus einer Konzentration von Dextransulfat/MgCl₂ in einem Teststreifen zu identifizieren. Es wurden drei Konzentrationen getestet: i) 0,007% DS/7,5 mM MgCl₂, 8a, Trendlinie 910; ii) 0,015% DS/15 mM MgCl₂, 8C, Trendlinie 930; und iii) 0,075% DS/75 mM MgCl₂, 8B, Trendlinie 920; in einem Teststreifen, der neben einer Kontrolle die Nicht-LDL-Cholesterinmembran enthielt. Der Kontrollstreifen enthielt die Nicht-LDL-Reaktionsmembran, jedoch ohne das Dextransulfat/MgCl₂ in Cytosep 1660, 8D, Trendlinie 940. Die nachstehenden Wechselbeziehungen zeigen, dass lediglich 0,075 DS/75 mM MgCl₂ eine gute Wechselbeziehung und Übereinstimmung mit dem Integra-LDL aufwiesen. Jedoch musste diese Konzentration beim Testen mit Vollblut verdoppelt werden.
Eine Titration von Dextransulfat/Mg+2 ergab, dass 0,15% Dextransulfat ideal für Serumproben ist. Das Cytosep enthält 0,15% Dextransulfat/150 mM MgCl und befindet sich auf einer P123/TX100-Reaktionsmembran.
Die Graphen in 5a–5h zeigen, dass die einzige Wechselbeziehung bezüglich eines Nicht-LDL vorliegt. In 5a zeigt der Graph die Menge an Nicht-LDL, die gemäß der hierin beschriebenen Verfahren ermittelt wird, im Vergleich zu der Menge an Integra-Nicht-LDL, die gemäß in der Industrie akzeptierten Techniken ermittelt wird. Der Begriff Integra wird in diesem Fall dazu verwendet, auf die Messung des ausgewählten Analyten unter Verwendung von Integra 917, Modula P und Cobas Integra 400+ Bezug zu nehmen. Die Trendlinie 510 zeigt, dass die Wechselbeziehung hinsichtlich des akzeptierten Standards ausgeprägt ist. 5B und die Trendlinie 520 zeigen die Beziehung zwischen Nicht-LDL gemäß den hierin beschriebenen Verfahren im Vergleich zu einem Integra-Gesamtcholesterin. 5B könnte der 5C gegenübergestellt werden, die eine Messung von Integra-Nicht-LDL im Vergleich zu einem Integra-Gesamtcholesterin zeigt (Trendlinie 530). In beiden Fällen ist die Wechselbeziehung gering und sehr ähnlich, was zeigt, dass sowohl das Integra-Nicht-LDL als auch das Nicht-LDL gemäß den hierin beschriebenen Verfahren gleichermaßen nicht mit Gesamtcholesterin in Wechselbeziehung stehen. 5D zeigt einen kombinierten Graphen der Trendlinien 520, 530 zum Vergleich. 5E und die Trendlinie 550 zeigen die Beziehung zwischen Nicht-LDL gemäß den hierin beschriebenen Verfahren im Vergleich zu einem Integra-LDL. 5E sollte 5F gegenübergestellt werden, die eine Messung von Integra-Nicht-LDL im Vergleich zu einem Integra-LDL zeigt (Trendlinie 560). In beiden Fällen ist die Wechselbeziehung gering und sehr ähnlich, was zeigt, dass sowohl das Integra-Nicht-LDL als auch das Nicht-LDL gemäß den hierin beschriebenen Verfahren gleichermaßen nicht mit LDL in Wechselbeziehung stehen. 5G zeigt einen kombinierten Graphen der Trendlinien 550, 560 zum Vergleich.
Die abschließende LDL-Kurve in 5h sieht hervorragend aus, da kein systematischer LDL-Fehler (Neigung von 0,99) bezüglich der Integra vorliegt und die Wechselbeziehung sehr gut ist (R² = 0,9813). Damit ist das LDL gemäß den hierin präsentierten Techniken mit Integra-LDL-Messungen vergleichbar. Die Trendlinie 540 zeigt eine sehr starke Wechselbeziehung. Als Kontrolle wurde, als dieselbe Selektivitätsmembran in Verbindung mit einer Gesamtcholesterin-Reaktionsmembran (die lediglich aus Triton X-100 besteht) platziert wurde, keine Wechselbeziehung mit Nicht-LDL beobachtet, was darauf hinwies, dass P-123 in der Nicht-LDL-Reaktionsmembran eine sehr wichtige Rolle spielt.
Mit anderen Worten zeigt die Trendlinie 520 die Wechselbeziehung von Nicht-LDL zu Gesamtcholesterin. Die Trendlinien 520 und 550 zeigen praktisch keine Wechselbeziehung mit Gesamtcholesterin bzw. LDL. In der 5h zeigt die Trendlinie 540 die Wechselbeziehung zwischen dem gemessenen LDL ausgehend von einer Integra-LDL-Messung und dem gemessenen LDL aus dem Ausführungsbeispiel des hierin beschriebenen Tests und in den unmittelbar vorhergehenden Absätzen. Wie deutlich wird, besteht eine sehr starke Wechselbeziehung, fast 1 zu 1, was nahe legt, dass die resultierende Methodologie äußerst präzise ist.
Die abschließende LDL-Kurve in 5h sieht hervorragend aus, da kein systematischer LDL-Fehler (Neigung von 0,99) bezüglich der Integra vorliegt und die Wechselbeziehung sehr gut ist (R² = 0,9813). Als Kontrolle wurde, als dieselbe Selektivitätsmembran in Verbindung mit einer Gesamtcholesterin-Reaktionsmembran (die lediglich aus Triton X-100 besteht) platziert wurde, keine Wechselbeziehung mit Nicht-LDL beobachtet, was darauf hinwies, dass P-123 in der Nicht-LDL-Reaktionsmembran eine sehr wichtige Rolle spielt.
Bevor das Vollbluttesten beginnen konnte, wurden die Auswirkungen der Tenside auf die Hämolyse in Betracht gezogen. Es ist hinreichend bekannt, dass Triton X-100 sehr hämolytisch ist, was teilweise das Erfordernis einer guten Blutabtrennmembran erforderlich macht. 6 veranschaulicht, dass P123 nicht hämolytisch ist und jegliche hämolytische Aktivität verhindert, wenn es mit Triton X-100 kombiniert wird, wobei das Röhrchen 610 Ergebnisse von Vollblut in Sole darstellt, das Röhrchen 620 Ergebnisse von Vollblut in 0,1% Triton X-100 darstellt, das Röhrchen 630 Ergebnisse von Vollblut in 2% P123 darstellt, das Röhrchen 640 Ergebnisse von Vollblut in 0,1% Triton X-100 und 2% P123 darstellt und Vollblut, das mit Sole, TX100, P123 oder einem Gemisch derselben kombiniert ist. Man kann deutlich beobachten, dass P123 nicht hämolytisch ist und jegliche hämolytische Aktivität verhindert, wenn es mit TX100 kombiniert wird.
Die Hämolysedaten sind spannend, da sie die nicht-offensichtliche Veränderung von TX100-Eigenschaften im Fall einer Kombination mit P123 veranschaulichen. Das Fehlen jeglicher erhöhter Hämolyse im Vergleich zu TX100 ermöglichte ein Testen mit Vollblut ohne Angst vor einem erhöhten Hämolysefehler.

Bei vier verschiedenen Gelegenheiten wurde das Vollbluttesten auf Versuchsteststreifen fortgeführt. Die nachstehende Tabelle fasst die Ausgabe der Kalibrierungskurven und der abschließenden Wechselbeziehung mit dem LDL-Analyten zusammen.

Eintrag	Nicht-LDL R²	Gleichung Nicht-LDL gegenüber K/S	LDL-Gleichung	LDL R²
1	0,8548	Y = 0,01x – 0,1826	Y = 0,9629x + 4,2732	0,9802
2	0,5979	Y = 0,0102x – 0,2011	Y = 0,9313x + 6,897	0,9529
3	0,9333	Y = 0,0098 – 0,1936	Y = 0,973x + 3,3117	0,9765
4	0,874	Y = 0,0104x – 0,2372	Y = 0,9835x + 0,9834	0,9203

Tabelle 7: Tabelle, die die Ergebnisse vier verschiedener Serien eines Vollbluttestens vergleicht.

Alle Streifen bestanden aus dem nachstehend beschriebenen Format.

Die Daten für Vollblut sehen in Bezug auf systematische LDL-Fehler und -Wechselbeziehung hervorragend aus. Aus den vorangegangenen Daten kann man schließen, dass in dem folgenden Format ein erfolgreicher Nicht-LDL-Streifen erzeugt wurde, um LDL ausgehend von einem zuverlässigen Gesamtcholesterin-Assay zu berechnen:

Blutverteilungsschicht	Petex
Blutabtrennschicht	D-23-Borsilikat-Glasfaser mit Phaselous Vulgaris Lectins
Sekundäre Blutabtrennschicht	Cytosep (0,15% Dextransulfat/150 mM MgCl)
Reaktionsmembran	Nicht-LDL-Reaktionsmembran (3% P123/0,2% TX100)

Es ist wichtig zu beachten, dass sich dieser Aufbau bei einem aus einem einzelnen Analyten bestehenden Streifen in einem Konzeptnachweisstadium befindet. In dem letzten Entwicklungsstadium befände sich der Nicht-LDL-Assay auf einer Stufe mit zumindest Cholesterin und einem anderen Analyten, wie gezeigt ist.

Schicht	Gesamtcholesterin	LDL	Beliebiger Analyt
Blutverteilungsschicht	Polyethersulfon (PES) 18/13 TW Hyphil
Blutabtrennschicht	D-23-Borsilikat-Glasfaser mit Lectins
Sekundäre Blutabtrennschicht	Cytosep 1660	LDL-Selektivität	entsprechende Membran
Reaktionsmembran	Gesamtcholesterin-Reaktionsmembran	Nicht-LDL-Reaktionsmembran	Reaktionsmembran für einen Analyten
Haftmittel	Haftmittel

Ferner sollte man beachten, dass jede in diesem Bericht zu sehende LDL-Kurve berechnet wurde, indem der Nicht-LDL-Wert von dem Integra-Gesamtcholesterin-Assay subtrahiert wurde. Es muss noch beträchtliche Arbeit geleistet werden, um den besten Nicht-LDL-Assay zu entwickeln, beispielsweise ein Bestimmen von Herstellungsverfahren, Störsubstanzen und Stabilität. Jedoch hat sich herausgestellt, dass die anfängliche Chemiereaktion mit Nicht-LDL bei einem Format eines Streifens mit einem einzelnen Analyten funktioniert. Falls die Chemie bei diesem Format funktioniert, besteht eine logische Schlussfolgerung darin, dass sie in ein Format derselben Stufe (engl.: panel format) mit einem Cholesterin-Assay von Polymer Technology Systems, Inc. (PTS) platziert werden kann, um einen einfachen LDL-Assay zu liefern, der gut mit dem direkten Integra-LDL-Assay korreliert.
Obwohl spezifische Ausführungsbeispiele in der vorstehenden ausführlichen Beschreibung ausführlich beschrieben und in den beiliegenden Zeichnungen veranschaulicht wurden, werden Fachleute erkennen, dass angesichts der Gesamtlehren der Offenbarung und der breiten erfindungsgemäßen Konzepte derselben verschiedene Modifikationen und Alternativen zu diesen Einzelheiten entwickelt werden könnten. Deshalb versteht es sich, dass der Schutzumfang dieser Offenbarung nicht auf die jeweiligen Beispiele und Implementierungen, die hierin offenbart sind, beschränkt ist, sondern Modifikationen, die innerhalb der Wesensart und des Schutzumfangs derselben liegen, wie sie durch die angehängten Patentansprüche und jegliche und alle Äquivalente derselben definiert sind, abdecken soll. Man beachte, dass, obwohl bestimmte Ausführungsbeispiele gezeigt sind, zwischen einzelnen Ausführungsbeispielen Merkmale jedes Zubehörs ausgetauscht werden können.

Claims

Ein Teststreifen zum Testen von auf Cholesterin bezogenen Blutanalyten in Vollblut, wobei der Teststreifen Folgendes aufweist: eine Erythrozytenabtrennschicht, wobei die Erythrozytenabtrennschicht rote Blutzellen von einer Blutprobe abtrennt, die auf den Teststreifen aufgebracht wird, während die Blutprobe durch die Erythrozytenabtrennschicht nach unten fließt; und eine Reaktionsschicht, die die Blutprobe von der Erythrozytenabtrennschicht aufnimmt, wobei die Reaktionsschicht POE-POP-POE-Blockcopolymer, ein Tensid und ein das Reflexionsvermögen veränderndes Reagens umfasst, wobei die POE-POP-POE-Blockcopolymere im Wesentlichen nur Nicht-LDL-Cholesterin-Analyten löslich machen, wobei die Nicht-LDL-Cholesterin-Analyten mit dem das Reflexionsvermögen verändernden Reagens reagieren, um ein Reflexionsvermögen der Blutprobe zu verändern.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 1, der ferner eine Verteilungsschicht aufweist, die auf der Erythrozytenabtrennschicht orientiert ist.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 1, bei dem das POE-POP-POE-Blockcopolymer aus der Liste ausgewählt ist, die aus Pluronics L101: MW (MW = molecular weight, relative Molekülmasse) 3800, POE₇-POP₅₄-POE₇; Pluronics L121: MW 4400, POE₅-POP₆₈-POE₅; Pluronics P123: MW 5750, POE₂₀-POP₇₀-POE₂₀; und Pluronics F127: MW 12600; POE₁₀₆-POP₇₀-POE₁₀₆ besteht.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 3, bei dem das Tensid Triton-X ist.
Der Der Teststreifen gemäß Anspruch 4, der ferner eine sekundäre Blutabtrennschicht neben der Erythrozytenabtrennschicht aufweist, wobei die sekundäre Blutabtrennschicht zusätzliche rote Blutzellen von der Blutprobe abtrennt.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 5, bei dem die sekundäre Blutabtrennschicht ferner Dextransulfat umfasst.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 6, bei dem eine relative Molekülmasse des Dextransulfats zwischen 10 K und 1.000 K liegt.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 6, bei dem eine relative Molekülmasse des Dextransulfats zwischen 50 k und 750 K liegt.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 6, bei dem eine relative Molekülmasse des Dextransulfats 500 K ist.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 4, bei dem das POE-POP-POE-Blockcopolymer Pluronics P123: MW 5750; POE₂₀-POP₇₀-POE₂₀ ist.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 10, bei dem ein Verhältnis von POE-POP-POE-Blockcopolymer zu Triton-X 10 Teile POE-POP-POE-Blockcopolymer zu einem Teil Triton-X ist.
Der Der Teststreifen gemäß Anspruch 11, bei dem eine Konzentration des Triton-X zumindest 0,01% beträgt.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 11, bei dem eine Konzentration des Triton-X zumindest 0,1% beträgt.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 11, bei dem eine Konzentration des POE-POP-POE-Blockcopolymers zumindest 1% beträgt.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 11, bei dem eine Konzentration des POE-POP-POE-Blockcopolymers zumindest 2% beträgt.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 11, bei dem eine Konzentration des POE-POP-POE-Blockcopolymers zumindest 3% beträgt.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 11, bei dem ein pH-Wert der Reaktionsschicht zumindest 5,4 beträgt.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 11, bei dem ein pH-Wert der Reaktionsschicht zumindest 6,8 beträgt.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 11, bei dem ein pH-Wert der Reaktionsschicht zumindest 7,4 beträgt.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 11, bei dem ein pH-Wert der Reaktionsschicht 6,8 beträgt.
Der Teststreifen gemäß Anspruch 1, bei dem die Blutabtrennschicht D-23-Borsilikat-Glasfaser umfasst, die mit Phaselous Vulgaris (PHA-P) Lectins imprägniert ist.
Ein Verfahren zum Bestimmen einer Konzentration von Nicht-LDL-Cholesterin in einer Vollblutprobe unter Verwendung eines Trockenphasenteststreifens, wobei das Verfahren Folgendes aufweist: Inberührungbringen der Vollblutprobe mit einer Blutabtrennschicht des Teststreifens; Abtrennen von Blutzellen von der Vollblutprobe, wobei Plasma produziert wird; Fließenlassen des Plasmas durch die Blutabtrennschicht zu einer Testschicht; Zur-Reaktion-Bringen einer Nicht-LDL-Fraktion bevorzugt vor einer LDL-Fraktion; Erzeugen einer Farbe in der Testschicht, die im Wesentlichen proportional zu einer Konzentration der Nicht-LDL-Fraktion in der Probe ist; und Messen der erzeugten Farbe.
Ein Teststreifen zum Bestimmen der Konzentration von LDL-Cholesterin in einer Vollblutprobe, der Folgendes aufweist: eine Testmatrix (einen Testmatrixstreifen), die zumindest zwei Stapel aufweist, einen ersten Stapel der zumindest zwei Stapel für Gesamtcholesterin und einen zweiten Stapel der zumindest zwei Stapel für Nicht-LDL; wobei in den ersten Stapel sind Reagenzien integriert sind, um eine kolorimetrische Reaktion zu erzeugen, die zu der Menge an Gesamtcholesterin in den Proben proportional ist; und wobei in den zweiten Stapel sind Reagenzien integriert sind, um eine kolorimetrische Reaktion zu erzeugen, die zu der Menge an Nicht-LDL-Cholesterin in der Probe proportional ist, wobei der Teststreifen dazu konfiguriert ist, durch ein Testmessgerät gelesen zu werden, wobei das Testmessgerät einen Nicht-LDL-Cholesterin-Wert von dem zweiten Stapel erhält und den Nicht-LDL-Cholesterin-Wert von einem Gesamtcholesterinwert, der von dem ersten Stapel erhalten wird, subtrahiert, um einen LDL-Cholesterin-Wert in der Probe zu ergeben.
Eine Kombination aus Teststreifen und -messgerät zum Bestimmen der Konzentration von LDL-Cholesterin in einer Vollblutprobe, die Folgendes aufweist: einen Teststreifen, der Folgendes umfasst: eine Testmatrix (einen Testmatrixstreifen), die zumindest zwei Stapel aufweist, einen ersten Stapel der zumindest zwei Stapel für Gesamtcholesterin und einen zweiten Stapel der zumindest zwei Stapel für Nicht-LDL; wobei in den ersten Stapel sind Reagenzien integriert sind, um eine kolorimetrische Reaktion zu erzeugen, die zu der Menge an Gesamtcholesterin in den Proben proportional ist; und wobei in den zweiten Stapel Reagenzien integriert sind, um eine kolorimetrische Reaktion zu erzeugen, die zu der Menge an Nicht-LDL-Cholesterin in der Probe proportional ist; und ein Testmessgerät, das dazu konfiguriert ist, den Teststreifen abzulesen, wobei das Testmessgerät dazu konfiguriert ist, einen Nicht-LDL-Cholesterin-Wert von dem zweiten Stapel zu erhalten und den Nicht-LDL-Cholesterin-Wert von einem Gesamtcholesterinwert, der von dem ersten Stapel erhalten wird, zu subtrahieren, um einen LDL-Cholesterin-Wert in der Probe zu ergeben.
Ein Verfahren zum Messen von LDL-Cholesterin von einem menschlichen Subjekt, das eine Blutprobe liefert, wobei das Verfahren Folgendes aufweist: Bereitstellen eines Trockenteststreifens; Aufnehmen der Blutprobe an dem Trockenteststreifen; Abtrennen roter Blutzellen von der Blutprobe in einer ersten Schicht des Trockenteststreifens; Zur-Reaktion-Bringen von Nicht-LDL-Cholesterin in der Blutprobe in einer Reaktionsschicht; Erzeugen einer Farbänderung, die zu dem Nicht-LDL-Cholesterin proportional ist; Messen der Farbänderung, um eine Menge an Nicht-LDL-Cholesterin in der Blutprobe zu ermitteln; und Subtrahieren der Menge an Nicht-LDL-Cholesterin von einer Gesamtcholesterinmenge in der Blutprobe, um eine Menge an LDL-Cholesterin für die Blutprobe zu ergeben.
Das Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem die Blutprobe von einer nicht nüchternen Person stammt und die resultierende Menge an LDL-Cholesterin genauer ist als die Friedwald-Gleichung.
Das Verfahren gemäß Anspruch 26, bei dem eine abschließende Neigung von LDL-Cholesterin zwischen 0,90 und 1,10 liegt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 26, bei dem VLDL-Cholesterin nicht als LDL-Cholesterin gemessen wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem eine Reaktionsschicht ein POE-POP-POE-Blockcopolymer, ein Tensid und ein das Reflexionsvermögen veränderndes Reagens umfasst, wobei das Zur-Reaktion-Bringen ein Löslichmachen im Wesentlichen lediglich von Cholesterin von Nicht-LDL-Analyten umfasst, wobei das Cholesterin von Nicht-LDL-Analyten mit dem das Reflexionsvermögen verändernden Reagens reagiert, um ein Reflexionsvermögen der Blutprobe zu verändern.
Das Verfahren gemäß Anspruch 29, bei dem das POE-POP-POE-Blockcopolymer aus der Liste ausgewählt ist, die aus Pluronics L101: MW 3800, POE₇-POP₅₄-POE₇; Pluronics L121: MW 4400, POE₅-POP₆₈-POE₅; Pluronics P123: MW 5750, POE₂₀-POP₇₀-POE₂₀; und Pluronics F127: MW 12600: POE₁₀₆-POP₇₀-POE₁₀₆ besteht.
Das Verfahren gemäß Anspruch 29, bei dem das Tensid Triton-X ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 25, das ferner Folgendes aufweist: Verteilen der Blutprobe mit einer Verteilungsschicht, die auf der ersten Schicht orientiert ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 32, das ferner Folgendes aufweist: Zur-Reaktion-Bringen der Blutprobe in einer Gesamtcholesterin-Reaktionsschicht, wobei die Gesamtcholesterin-Reaktionsschicht dazu orientiert ist, einen Teil der Blutprobe von der Verteilungsschicht aufzunehmen; Erzeugen einer zu einem Gesamtcholesterin proportionalen Farbänderung; und Messen einer Farbänderung, um die Gesamtcholesterinmenge in der Blutprobe zu ermitteln.
Das Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem der Teststreifen eine sekundäre Blutabtrennschicht neben der Erythrozytenabtrennschicht umfasst, wobei die sekundäre Blutabtrennschicht zusätzliche rote Blutzellen von der Blutprobe abtrennt, wobei die sekundäre Blutabtrennschicht ferner Dextransulfat umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem die erste Schicht D-23-Borsilikat-Glasfaser umfasst, die mit Phaselous Vulgaris (PHA-P) Lectins imprägniert ist.