JP5543798B2

JP5543798B2 - 低密度リポ蛋白コレステロールの測定方法

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Publication number: JP5543798B2
Application number: JP2010032267A
Authority: JP
Inventors: マリジョイフマウィド; 弘子猪股
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2009-03-25
Filing date: 2010-02-17
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2030-02-17
Also published as: JP2010246526A; CN101864475A; CN101864475B; EP2233578B1; US8357502B2; US20100248276A1; EP2233578A1

Description

本発明は、検体中の低密度リポ蛋白コレステロール（LDL-C）を測定する方法に関する。

血液中に存在する脂質は、遊離脂肪酸がアルブミンと結合している以外はリポ蛋白の構造の中に組み込まれており、カイロミクロン（CHM）、超低密度リポ蛋白（VLDL）、低密度リポ蛋白（LDL）、高密度リポ蛋白（HDL）等として存在している。コレステロールは特にVLDL、LDL、及びHDLに分布している。LDLはコレステロールを運搬する働きをするが、高値になると動脈硬化を促進することが知られている。低密度リポ蛋白コレステロール（LDL-C）の血中レベルを測定することにより、動脈硬化の発症および進展の指標となることが知られている。

特許文献１には、ａ）生体試料、ｂ）コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ（以下、ＣＨ酵素類という）およびｃ）低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬという）中のコレステロール（以下、ＬＤＬコレステロールという）のみにｂ）記載のＣＨ酵素類を作用させる試薬の存在下、コレステロールの反応を行い、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することによりＬＤＬコレステロール濃度を定量することを特徴とする、生体試料中のＬＤＬコレステロールの定量方法が記載されている。特許文献１では、ＬＤＬ選択性的試薬として、ポリオキシエチレンーポリオキシプロピレンコポリマー及びポリオキシエチレン誘導体を使用している。しかしながら、特許文献１に記載の方法でLDL-Cの定量を行なう場合でも、LDL-Cの選択性が十分ではない場合がある。また、特許文献１で使用するポリオキシエチレン誘導体であるポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルは、環境ホルモンの懸念が大きい化合物を含むものであり好ましくない。

特許文献２には、少なくとも一つの水透過性層と多孔性液体展開層を液体接触しうる状態で有する乾式分析要素であって、前記展開層にコレステロールエステル加水分解活性を有する酵素を含み、前記展開層又は前記の少なくとも一つの水透過性層にアルキルフェノキシポリグリシドールを含む乾式分析要素が記載されている。なお、特許文献２におけるポリグリシドールは塗布性の改良のために使用されている。特許文献２に記載の乾式分析要素は、低密度リポ蛋白コレステロール（LDL-C）に対する選択性は有していない。

国際公開ＷＯ００／１７３８８号公報特開昭６３‐１０９７９９号公報

本発明は、体液中の低密度リポ蛋白コレステロールの測定方法において、内分泌攪乱化学物質を発生するおそれのある低密度リポ蛋白コレステロール（LDL-C）選択的界面活性剤を使用することなく、体液中の低密度リポ蛋白コレステロールを選択的に測定できる方法を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマーおよびポリグリセリルエーテルの存在下において、（ａ）コレステロールエステラーゼ及び（ｂ）コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼを用いることによって、低密度リポ蛋白コレステロール(LDL-C)を選択的に測定でき、かつ多検体相関性にも優れていることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。

本発明によれば、体液中の低密度リポ蛋白コレステロール(LDL-C)の測定方法であって、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマーおよびポリグリセリルエーテルの存在下において、（ａ）コレステロールエステラーゼ及び（ｂ）コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼを用いて低密度リポ蛋白コレステロール(LDL-C)を測定する方法が提供される。

好ましくは、ポリグリセリルエーテルが、脂肪族炭化水素ポリグリセリルエーテルまたは多環ポリグリセリルエーテルである。

好ましくは、多環ポリグリセリルエーテルが下記式（１）で示される化合物である。

（式中Ｘは水素、C１〜C18のアルキル基、又はハロゲンを示し、アルキル基は直鎖でも分岐でもよい。ＬはC1〜C5のアルキレン基を示す。ｍは1〜5の整数を示し、nは3〜20の整数を示す）

好ましくは、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼにより低密度リポ蛋白コレステロールから生成した過酸化水素にペルオキシダーゼと色原体とを作用させて発色反応を行なうことにより低密度リポ蛋白コレステロールを測定する。

本発明によればさらに、（ａ）コレステロールエステラーゼ、（ｂ）コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ、（ｃ）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、および（ｄ）ポリグリセリルエーテルを含有する、低密度リポ蛋白コレステロール(LDL-C)を測定するための試薬が提供される。

本発明によればさらに、（ａ）コレステロールエステラーゼ、（ｂ）コレステロールオキシダーゼ、（ｃ）ペルオキシダーゼ、（ｄ）色原体、（ｅ）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、および（ｆ）ポリグリセリルエーテルを含む、低密度リポ蛋白コレステロール(LDL-C)測定用キットが提供される。
本発明によればさらに、（ａ）コレステロールエステラーゼ、（ｂ）コレステロールオキシダーゼ、（ｃ）ペルオキシダーゼ、（ｄ）色原体、（ｅ）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、および（ｆ）ポリグリセリルエーテルを含む、低密度リポ蛋白コレステロール(LDL-C) 測定用乾式分析要素が提供される。

本発明によれば、低密度リポ蛋白コレステロールを選択的に測定することができる。本発明によれば、内分泌攪乱化学物質を発生するおそれのない界面活性剤を使用するため、環境に対して安全である。また、本発明による低密度リポ蛋白コレステロールの測定方法は優れた多検体相関性を示す。

図１は、本発明の方法での多検体相関を示す。図２は、比較例の方法での多検体相関を示す。図３は、LDL-C測定用乾式分析素子を用いた本発明の方法での多検体相関を示す。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の方法は、体液中の低密度リポ蛋白コレステロール(LDL-C)の測定方法であって、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマーおよびポリグリセリルエーテルの存在下において、（ａ）コレステロールエステラーゼ及び（ｂ）コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼを用いて低密度リポ蛋白コレステロール(LDL-C)を測定する方法である。

体液としては、血液又は尿などを用いることができる。体液試料としては、血液又は尿をそのまま使用してもよく、あるいは適宜の前処理を施したものを使用してもよい。

本発明で用いるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマーとしては、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのランダムコポリマーでもブロックコポリマーでもよく、例えば式：ＨＯ−（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_a−（Ｃ₃Ｈ₆Ｏ）_b−（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_c−Ｈ［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表す。］で表される化合物があげられる。上記の式で表される化合物としては、例えば、プルロニックＬ−１２１、プルロニックＬ−１２２、プルロニックＬ−１０１、プルロニックＰ−１０３、プルロニックＦ−１０８等の市販品（いずれも旭電化社製）があげられる。また、上記の式で表される化合物中のポリプロピレングリコール基の分子量としては、２，０５０以上が好ましく、２，７５０以上がより好ましく、３，２５０以上が特に好ましい。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体のＨＬＢは、１〜６が好ましい。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマーの使用濃度は特に限定されないが、０．００１〜２０％が好ましく、０．０１〜１０％がより好ましい。

本発明で用いるポリグリセリルエーテルの構造は特に限定されないが、好ましくは脂肪族炭化水素ポリグリセリルエーテル（例えば、アルキルポリグリセリルエーテル）、または多環ポリグリセリルエーテルである。

本明細書において、多環ポリグリセリルエーテルとは、ポリグリシドール鎖の一方の末端に2個以上の環を含む部分構造を有する化合物を意味する。好ましい化合物は、ポリグリシドール鎖の一方の末端にアリール基が結合しており、該アリール基は必要に応じてリンカーを介して結合するアリール基を1個又は2個以上有している。さらに好ましい化合物は、ポリグリシドール鎖の一方の末端にアリール環が結合しており、該アリール環はリンカーを介して結合するアリール基を1個又は2個以上有する構造を有する。上記の多環ポリグリシドール化合物において、アリール環としてはベンゼン環が好ましい。リンカーとしては直鎖状又は分枝鎖状のアルキレン基などを用いることができ、該アルキレン基は必要に応じて置換基を有していてもよく、主鎖中に窒素原子、酸素原子、又はイオウ原子などのヘテロ原子を含んでいてもよい。アリール環に必要に応じてリンカーを介して結合するアリール基としてはフェニル基が好ましく、リンカーを介して2個以上のフェニル基がアリール環に結合していることが好ましい。該フェニル基は1個又は2個以上の置換基を有していてもよい。

多環ポリグリセリルエーテルとしては、下記式（１）で示される化合物が好ましい。

Lが示すC1〜C5のアルキレン基は直鎖状又は分枝鎖状のいずれであってもよい。Lを構成するメチレン単位としては、-C(R¹)(R²)-（式中、R¹及びR²はそれぞれ独立に水素原子又はC₁-C₄アルキル基を示す）で表されるメチレン単位が好ましく、上記のメチレン単位を1〜5個含むアルキレン基が好ましい。上記のメチレン単位において、R¹が水素原子であり、R²が水素原子又はメチル基であることが好ましい。アルキレン基が上記のメチレン単位を2個以上含む場合には、それらのメチレン単位は同一でも異なっていてもよい。より具体的には、例えば、メチレン基、メチルメチレン基、エチレン基、メチルエチレン基、プロピレン基、ブチレン基などが挙げられる。Lで表されるアルキレン基が1個のメチレン単位を含むことが好ましく、Lが-C(R¹)(R²)-で表される基であることがより好ましい。この場合、R¹が水素原子であり、R²が水素原子又はメチル基であることがより好ましい。

Ｘは水素、C１〜C18のアルキル基、又はハロゲンを示す。C１〜C18のアルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組合せのいずれであってもよい。アルキル基としてメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、tert-ブチル基、2-エチルヘキシル基、オクチル基、ノニル基、又はデシル基などを挙げることができ、ハロゲン原子としてはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子などを用いることができる。Ｘで表される基の存在位置及び数は特に限定されず、2個以上の置換基Ｘを有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。

ｍは1〜5の整数を示し、ｍが２以上の場合、それぞれの基は同一でも異なっていてもよい。ｍは好ましくは1〜3の整数を示す、より好ましくは２又は３であり、特に好ましくは３である。

nは3〜20の整数を示すが、5〜18であることが好ましく、8〜16であることがより好ましい。

上記式（１）で表される多環ポリグリセリルエーテルは1個又は2個以上の不斉炭素を有する場合があり、該不斉炭素に基づく立体異性体（光学異性体又はジアステレオ異性体）が存在する場合があるが、純粋な形態の任意の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の方法に使用可能である。また、上記式(１)で表される多環ポリグリセリルエーテルは任意の水和物又は溶媒和物として存在する場合があるが、これらの物質も本発明の方法に使用可能である。

上記式（１）で表される多環ポリグリセリルエーテルの具体例を以下に示す。いずれもベンゼン環の置換ベンジル基の結合位置は特に限定されない。

特に好適な化合物(5)ないし化合物(10)を下記に示す（いずれもベンゼン環の置換ベンジル基の結合位置は特に限定されない）。

式（１）で示される多環ポリグリセリルエーテルは、例えば、下記の一般式(11)：

(式中、Rはアリール基（該アリール基はC₁-C₁₈アルキル基又はハロゲン原子からなる群から選ばれる1又は2以上の置換基を有していてもよい）を示す。L、及びmは上記の定義と同義である)で表されるフェノール化合物に触媒の存在下でグリシドールを付加させることによって製造することができる。この反応において、原料化合物であるフェノール化合物とグリシドールとの比率を変えることで、グリシドール鎖長を変えることが可能である。

触媒としてはアルカリ触媒が挙げられ、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の水酸化物、例えば水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムなどが挙げられるが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウムが好ましく、特に水酸化カリウムが好ましい。触媒の使用量としては、例えば原料化合物に対して0.0001〜1％であり、0.001〜0.8％が好ましく、特に0.005〜0.5％が好ましい。上記反応は通常は無溶媒にて行なうことができる。反応温度は室温〜200℃であり、好ましくは50〜200℃、より好ましくは100〜180℃である。反応時間は反応温度によって異なるが、1〜150時間であり、より好ましくは2〜24時間であり、特に2〜10時間が好ましい。

反応後に反応液を室温に戻し、酸で中和した後に常法の処理を行なうことにより、目的物を単離することができる。酸としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、リン酸のような鉱酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酢酸、p-トルエンスルホン酸のような有機酸が挙げられる。好ましくは塩酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、酢酸を用いることができ、塩酸、リン酸、メタンスルホン酸、酢酸を用いることが特に好ましい。中和後、目的物が水不溶性の場合には濾取により目的物を単離することができる。目的物の粘性が高い場合には、水を添加し、水溶液の状態で目的物を得ることもできる。上記一般式(１)で表されるポリグリシドール化合物は異なるnを有する化合物の混合物として製造される場合もあり、その混合物を本発明の方法において界面活性剤として用いることもできる。

なお、上記した本発明で用いる多環ポリグリセリルエーテルは、特願２００７−３０６７１６号明細書に記載されており、その内容は全て本明細書に引用されるものとする。

本発明の方法において用いられる酵素としては、例えば、コレステロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼを挙げることができる。コレステロールエステラーゼとしてリパーゼを用いることもできる。酵素由来の微生物は特に限定されるものではないが、例えば、コレステロールエステラーゼに関しては、Schizophyllum commune由来又はPseudomonas sp.由来、その他の微生物由来のエステラーゼなどを用いることができる。コレステロールオキシダーゼに関しては、Pseudomonas sp由来、Streptomyces sp.由来、その他微生物由来のオキシダーゼを用いることができる。本発明で用いる酵素は微生物由来の酵素又は周知の方法で製造されたリコンビナント酵素のいずれであってもよい。

Schizophyllum commune由来のコレステロールエステラーゼとしては、例えば、東洋紡社製のCOE-302、Pseudomonas sp由来の由来のコレステロールエステラーゼとしては東洋紡社製のCOE-311、LPL-312、LPL-314、旭化成社製のCEN等が挙げられる。Pseudomonas sp由来由来のコレステロールオキシダーゼとしては、キッコーマン社製のCHO-PELやCHO-PEWL等が挙げられる。

本発明の方法では、これらの試薬のほかに、コレステロールを検出するための試薬として、周知の酵素試薬、色原体、及びpH緩衝剤を用いることができる。
より具体的には、酵素としてペルオキシダーゼを挙げることができ、色原体としては、4-アミノアンチピリン(4-AA)、水素供与性カップリングして発色するフェノール性又はアニリン性のトリンダー試薬、及びロイコ色素などを挙げることができる。トリンダー試薬としては、好ましくはアニリン性試薬を用いることがき、例えば、同仁化学研究所製のN-エチル- N-スルホプロピル-3-メトキシアニリン（ADPS）、N-エチル- N-スルホプロピルアニリン（ALPS ）、N-エチル- N-スルホプロピル-3-メチルアニリン（TOPS）、N-エチル- N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン（ADOS ）、N-エチル- N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン（DAOS）、N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン（HDAOS）、N-エチル- N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン（MAOS）、N-エチル- N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン（TOOS）等が挙げられる。

pH緩衝剤の例としては、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩やBiochemistry, 5, pp.467-477, 1966に記載のGoodのpH緩衝剤などがある。これらのpH緩衝剤は、例えば、蛋白質・酵素の基礎実験法、堀尾武一ほか著、南江堂、1981年、Biochemistry, 5, pp.467-477, 1966等の文献の記載を参考にして選択することができる。
前記緩衝剤のpHは用いる酵素の至適pHに応じて決定することができるが、好ましくはｐH5.0〜8.0の範囲に調整することができ、より好ましくはｐH6.0〜7.0の範囲に調整することができる。

測定系が溶液の場合における本発明の測定方法について説明するが、本発明の範囲は下記の特定の態様に限定されることはない。試薬液の組成としては、次の(1)〜(6)を含む組成の溶液が好ましい。
(1)コレステロールエステラーゼ
(2)コレステロールオキシダーゼ
(3)ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー
(4ポリグリセリルエーテル
(5)ペルオキシダーゼ
(6)色原体（4-AA及びトリンダー試薬）
(7)pH緩衝剤

これらの試薬を最適な濃度に調整した試薬液1〜1000μL、好ましくは100〜500μLを約20℃〜約45℃の範囲の一定温度で、好ましくは約30℃〜約40℃の範囲内の一定温度で1〜10分間、予めインキュベーションする。この試薬溶液に溶液試料0.5〜50μL、好ましくは1〜20μLを加え、一定温度でインキュベートしながら色原体の発色に応じた波長の時間経時変化を測定する。予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により検体中の被験物質の量を求めることができる。

必要な酵素量は適宜決定することができるが、例えば、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、及びペルオキシダーゼのいずれの酵素も0.2〜500U/mLの範囲で用いることが好ましく、0.2〜100U/mLの範囲で用いることがより好ましく、より好ましくは1〜50U/mLで用いることができる。

測定系が溶液の場合、界面活性剤としてポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマーおよびポリグリセリルエーテルのみを使用してもよいが、必要に応じてその他の界面活性剤を1種又は2種以上組み合わせることもできる。界面活性剤の濃度は特に限定されないが、例えば0.01〜20％の濃度で用いることが好ましく、より好ましくは0.1〜15％の濃度で用いることができる。

測定系がドライ試薬である乾式分析素子を用いた本発明の測定方法について説明する。乾式分析素子は、水不透過性支持体の上に、少なくとも１層の接着層及び多孔性の展開層を有するように構成することができる。
多孔性層は繊維質又は非繊維質のいずれであってもよく、液体試料の展開層として機能することから、液体計量作用を有する層であることが好ましい。液体計量作用とは、層の表面に点着供給された液体試料を、その中に含有する成分を実質的に偏在させることなく、層の面方向に単位面積当りほぼ一定量の割合で広げる作用である。展開層には、展開面積や展開速度等を調節するために、特開昭60-222770号公報、特開昭63-219397号公報、特開昭62-182652号公報に記載された親水性高分子又は界面活性剤を配合することができ、界面活性剤として多環ポリグリシドール化合物を配合することもできる。

繊維性の多孔層は、特開昭55-164356号公報、特開昭57-66359号公報、特開昭60-222769号公報等に代表されるような、ポリエステル繊維のものが好ましい。非繊維性多孔層としては、ポリスルホン酸等の有機高分子であることが好ましい。
接着層は、前記水不透過性支持体、及び前記多孔層を接着する機能を有する層であり、ゼラチン及びこれらの誘導体(例、フタル化ゼラチン)、セルロース誘導体(例、ヒドロキシプロピルセルロース)、アガロース、アクリルアミド重合体、メタアクリルアミド重合体、アクリルアミド又はメタアクリルアミドと各種ビニル性モノマーとの共重合体等の親水性ポリマーが利用できる。

親水性ポリマーを含む水溶液を周知の方法で均一に塗布するが、塗布の方法は公知の方法を利用できる。塗布には、例えば、ディップ塗布、押し出し塗布、ドクター塗布、ホッパー塗布、カーテン塗布等を適宜選択して用いることができる。

接着層の上に多孔層を塗布することもできるが、好ましくは、予め編み物として供給されている布や多孔膜をラミネートするのが好ましい。ラミネートの方法は、特開昭55-164356号公報に記載のように、親水性ポリマーを含む接着層の表面を水で一様に湿潤させておき、その上に布や多孔性膜を重ねて軽くほぼ一様に圧力をかけて接着させる方法で接着させることができる。接着層の厚さは、0.5〜50μｍが好ましく、より好ましくは、1〜20μmである。

光透過性支持体の材料として好ましいものはポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、セルローストリアセテート等のセルロースエーテル類である。親水性層の吸水層、検出層、実質的に無孔性の試薬層等を支持体に強固に接着させるために、通常、支持体に下塗り層を設けるか、親水化処理を施すことができる。支持体の厚みは、特に制限されないが、10〜1000μmが好ましく、300〜800μmがより好ましい。光透過性のある支持体の場合、最終的な検出は、支持体側又は多孔層側のいずれでもよいが、光不透過性の場合、多孔層側から検出する。
必要に応じ、安定化剤、ｐH緩衝剤、架橋剤（硬膜剤又は硬化剤）、界面活性剤、ポリマー等を含有させることができ、これらは接着層又は多孔層に含有させることができる。

乾式分析素子に用いられるコレステロール測定用試薬組成物及び光学的変化を生じる試薬組成物について説明する。
試薬組成物は、第1の多孔性層に含まれてもよいが、接着層及び多孔性層の両方の層に含まれてもよい。あるいは全部又は大部分の試薬組成物がいずれかの層に含まれていてもよく、あるいは接着層と多孔性層以外の層に試薬組成物を添加しておいてもよい。

LDL-C検出用乾式分析素子において、コレステロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼのいずれの酵素も1 m²あたり0.1〜30 kU程度の量で用いることが好ましい。より好ましくは1 m²あたり0.5〜15 kU程度の量を用いることができる。

界面活性剤は、いずれも1 m²あたり0.2〜30 g程度の量を用いることができ、より好ましくは1 m²あたり1〜20 g程度の量を用いることができる。

ペルオキシダーゼとしては、特に由来は限定されないが、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが好ましい。使用量としては1〜200kU/m²程度が好ましく、より好ましくは10〜100kU/m²程度を用いることができる。

前記色原体に関しては、4-アミノアンチピリン（4-AA）とカップリングして発色する前記試薬の組み合わせが好ましく、特に好ましくは、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン・ナトリウム塩(DAOS)を用いることができる。使用する色原体の量は特に限定されないが、例えば4-AA及び水素供与性カップリング剤をともに0.1〜10g/m²程度用いることが好ましく、より好ましくは、0.1〜5g/m²程度用いることができる。

LDL-Cを検出するための乾式分析素子におけるその他試薬組成物には、必要に応じて安定化剤、ｐH緩衝剤、架橋剤（硬膜剤又は硬化剤）、界面活性剤、又はポリマー等など添加剤の1種又は2種以上を含有させることができる。これらの添加剤は、乾式分析素子の接着層及び／又は多孔層に含有させることができる。
緩衝剤のpHは用いる酵素の至適pHに応じて決定することができ、好ましくはpH5.0〜8.0の範囲に調整することができる。より好ましくは、pH6.0〜7.0の範囲に調整することができる。
本発明の乾式分析素子は、色原体およびペルオキシダーゼを含む層と、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、および、ポリグリセリルエーテルを含む層、を含むことが好ましい。

乾式分析素子は、例えば、一辺約5 mmから約30 mmの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭57-283331号公報、実開昭56-142454号公報、特開昭57-63452号公報、実開昭58-32350号公報、特表昭58-501144号公報等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドとして用いることができる。この態様は、製造、包装、輸送、保存、及び測定操作等の観点で好ましい。使用目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収めて用いることもでき、あるいは小片を開口のある容器内に収めて用い、又は小片を開口カードに貼付または収めて用いることもでき、さらには裁断した小片をそのまま用いることもできる。

乾式分析素子を用いる場合、例えば約2μL〜約30μL、好ましくは4μL〜15μLの範囲の水性液体試料液（例えば血液や尿などの体液試料など）を多孔性液体試料展開層に点着することができ、点着した乾式分析素子を約20℃〜約45℃の範囲の一定温度で、好ましくは約30℃〜約40℃の範囲内の一定温度で1〜10分間インキュベーションすることができる。乾式分析素子内の発色又は変色を光透過性支持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により検体中の被験物質の量を求めることができる。

測定操作は、例えば特開昭60-125543号公報、特開昭60-220862号公報、特開昭61-294367号公報、特開昭58-161867号公報などに記載の化学分析装置により極めて容易に行なうことができ、これにより高精度の定量分析を行なうことができる。目的や必要精度によっては目視により発色の度合いを判定して半定量的な測定を行ってもよい。

乾式分析素子は、分析を行なうまでは乾燥状態で貯蔵・保管することができ、試薬を用時調製する必要がなく、また一般に乾燥状態の方が試薬の安定性が高いことから、試薬溶液を用時調製しなければならないいわゆる溶液法より簡便性及び迅速性に優れている。また、微量の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行なうことができる検査方法としても優れている。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例1：低密度リポ蛋白（LDL）選択性の評価
本発明と比較例の試料101〜106の作成
試薬１
MOPS (pH緩衝剤、pH 7.0) 50 mM
DAOS（同仁研究所社製） 1 mM
（DAOSは色原体である）

試薬2
MOPS (pH 7.0) 50 mM
4-アミノアンチピリン 2.5 mM
Pluronic L121 2.65%
ポリグリセリルドデシルエーテル(界面活性剤2) 0.21%
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製） 20 U/ml
コレステロールエステラーゼ、（リポプロテインリパーゼ、東洋紡） 1 U/ml
コレステロールオキシダーゼ、（recombinant E.Coli, キッコマン） 3 U/ml

検体として80 mg/dL HDL-C、250 mg/dL LDL-Cを用いた。480 μLの試薬１を160μＬの試薬2と混合させ、37℃にて5分間インキュベートした。５分後、13μＬの検体を添加し、37℃で5分間反応させて試料101を作成した。

さらに試料101において、試薬２のPluronic L121の量及び、界面活性剤2の種類と量を表1のように置き換えた以外は同様の操作により試料102〜106を作成した。

それぞれの試料について、分光光度計を用いて5分後の600nmの吸光度を測定し、表２にまとめた。ここでA_HDL80/A_LDL250はLDLの選択性に対する指標を表し、値が小さいほどLDLの選択性が良いことを示しており、本発明の構成はすべてLDLの選択性が高いことが分かる。

実施例2：混合リポタンパク質での低密度リポ蛋白（LDL）選択性の評価
試料101と103の比較
試薬１
MOPS (pH緩衝剤、pH 7.0) 50 mM
DAOS（同仁研究所社製） 1 mM
（DAOSは色原体である）

試薬2
MOPS (pH 7.0) 50 mM
4-アミノアンチピリン 2.5 mM
Pluronic L121 2.65%
ポリグリセリルドデシルエーテル(101)または
ポリグリセリルトリスチルフェニルエーテル(103)(界面活性剤2) 0.21%
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製） 20 U/ml
コレステロールエステラーゼ、（リポプロテインリパーゼ、東洋紡） 1 U/ml
コレステロールオキシダーゼ、（recombinant E.Coli, キッコマン） 3 U/ml

検体としてHDL-C最終濃度が80 mg/dL、LDL-C 最終濃度が150 mg/dLになるようにHDLとLDLを混合した検体または150mg/dl LDL-Cの検体。480 μLの試薬１を160μＬの試薬2と混合させ、37℃にて5分間インキュベートした。5分後、13μＬの検体を添加し、37℃で5分間反応させた。

それぞれの試料について、分光光度計を用いて5分後の600nmの吸光度を測定し、表３にまとめた。ここで（A_LDL150+HDL80 - A_LDL150）/A_LDL150はLDLの選択性に対する指標を表し、値が小さいほどLDLの選択性が良いことを示している。混合リポタンパク質においてポリグリセリルトリスチルフェニルエーテル(103)を界面活性剤2として用いた方がLDLの選択性が良い。

実施例3：多検体相関の評価
試薬１
MOPS (pH 7.0) 50 mM
DAOS（同仁研究所社製） 1 mM

試薬2
MOPS (pH 7.0) 50 mM
4-アミノアンチピリン 2.5 mM
Pluronic L121 4.0%
ポリグリセリルトリスチルフェニルエーテル 0.21%
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製） 20 U/ml
コレステロールエステラーゼ、（リポプロテインリパーゼ、東洋紡） 4 U/ml
コレステロールオキシダーゼ、（recombinant E.Coli, キッコマン） 1 U/ml

検体として12検体の人血清を用いた。480 μLの試薬1を160μＬの試薬2と混合させ、37℃にて5分間インキュベートした。次に、13μＬの検体を添加し、37℃で5分間反応させた。分光光度計を用いて5分後の600nmの吸光度を測定した。検体LDLコレステロール濃度（市販品キットを用いて、全コレステロール、HDL-C、TGを測定し、Friedewald式で算出したLDL-C値）と600 nmにおける吸光度の間の関係を示す検量線を作成した。その検量を用いてそれぞれの検体のLDL-Cを求め、Friedewald式より算出したＬＤＬ値との相関を求めた。結果は図1に示し、相関係数はR=0.9525である。

比較例２：多検体相関
実施例２において、ポリグリセリルトリスチルフェニルエーテルをポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（HS210）に置き換えた以外は同様に試料の作成評価を行い、ＬＤＬ値との相関を求めた。結果は図２に示し、相関係数はR=0.8778である。
実施例２、比較例２の結果から、本発明の構成は、優れた多検体相関性を示すことがわかる。

実施例4：LDL-C測定用乾式分析素子
ゼラチン下塗りされている180μmのポリエチレンテレフタレート無色透明平滑フィルムにゼラチン水溶液を乾燥後の厚さが14μmになるように塗布し、乾燥した。次に、下記組成の水溶液を塗布乾燥した。
4-アミノアンチピリン 0.32 g/m2
TOOS (同仁研究所社製) 0.62g/m2
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製） 12.75kU/m2
次に上記フィルム上に約30g/ｍ²の供給量で水を全面に供給して湿潤させた後、50デニール相当のポリエステル紡績糸を36ゲージ編みしたトリコット編み物布地を軽く圧力をかけて積層し、乾燥させた。次に、上記の布地上に下記組成の水溶液を塗布乾燥した。
MOPS (pH 7.0) 1.67 g/m2
ポリグリセリルトリスチルフェニルエーテル 5.02g/m2
Pluronic L121 39.75g/m2
コレステロールエステラーゼ、（リポプロテインリパーゼ、東洋紡） 0.65kU/m2
コレステロールオキシダーゼ、（recombinant E.Coli, キッコマン） 0.13 kU/m2

健常人25人について、本発明の方法と直接測定法(液体)について、多検体相関を調べた結果を図３に示す。図３に示す通り、液体直接測定方法と良好な相関を得ることができた。

Claims

体液中の低密度リポ蛋白コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の測定方法であって、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマーおよびポリグリセリルエーテルの存在下において、（ａ）コレステロールエステラーゼ及び（ｂ）コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼを用いて低密度リポ蛋白コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）を測定する方法であって、ポリグリセリルエーテルが、下記式で表される化合物の少なくとも１種である、低密度リポ蛋白コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）を測定する方法。
コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼにより低密度リポ蛋白コレステロールから生成した過酸化水素にペルオキシダーゼと色原体とを作用させて発色反応を行うことにより低密度リポ蛋白コレステロールを測定する、請求項１に記載の方法。
（ａ）コレステロールエステラーゼ、（ｂ）コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ、（ｃ）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、および（ｄ）ポリグリセリルエーテルを含有する、低密度リポ蛋白コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）を測定するための試薬であって、（ｄ）ポリグリセリルエーテルが、下記式で表される化合物の少なくとも１種である、低密度リポ蛋白コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）を測定するための試薬。
（ａ）コレステロールエステラーゼ、（ｂ）コレステロールオキシダーゼ、（ｃ）ペルオキシダーゼ、（ｄ）色原体、（ｅ）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、および（ｆ）ポリグリセリルエーテルを含む、低密度リポ蛋白コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）測定用キットであって、（ｆ）ポリグリセリルエーテルが、下記式で表される化合物の少なくとも１種である、低密度リポ蛋白コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）測定用キット。
（ａ）コレステロールエステラーゼ、（ｂ）コレステロールオキシダーゼ、（ｃ）ペルオキシダーゼ、（ｄ）色原体、（ｅ）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、および（ｆ）ポリグリセリルエーテルを含む、低密度リポ蛋白コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）測定用乾式分析要素であって、（ｆ）ポリグリセリルエーテルが、下記式で表される化合物の少なくとも１種である、低密度リポ蛋白コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）測定用乾式分析要素。