CN103562726B - 用于非空腹的ldl胆固醇检测的体系和方法 - Google Patents

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Abstract

在一个实施方案中，用于测试全血中胆固醇‑相关的血液分析物的测试条包括红细胞分离层，其中当施加至所述测试条的血样向下流经所述红细胞分离层时，所述红细胞分离层从所述血样分离红细胞。测试条还包括从红细胞分离层接收血样的反应层，反应层包括POE‑POP‑POE嵌段共聚物、表面活性剂和反射率变化反应物，POE‑POP‑POE嵌段共聚物基本上仅溶解非‑LDL胆固醇分析物，非‑LDL胆固醇分析物与反射率变化反应物反应以改变血样的反射率。

Description

用于非空腹的LDL胆固醇检测的体系和方法
背景技术
低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的检测在健康，特别是心血管健康中是重要的健康度量。希望具有用于LDL的快速的现场检测体系，其不需要实验室或其他设施。以该方式，健康专业人员可在取样之后立即告知病患，而不必为了从实验室返回的测试结果等待数日。以该方式，病患的病历和状况将被即刻记忆在其脑海中，并因此对病患的健康产生更好的结果和分析。
目前有5种已知的方法在临床化学分析仪上以湿法化学用于定量低密度脂蛋白(LDL)胆固醇。所述方法中的4种是两步反应，其中第一反应物与所有的非-LDL(HDL和VLDL)反应而产生无色的产物。一旦第一步反应完成，利用在预设时间下加入另一试剂来定量剩余的LDL。这些方法与测试条技术不相容，这是因为不能在所需的关键时刻可靠地引入多种试剂。由Kyowa-Medex制造的最后一种方法据称具有这样的方法，其中通过糖化合物(环糊精)掩蔽HDL和VLDL，而LDL选择性地与特定的表面活性剂和酶胶体化。最重要地，该方法据称在一个反应中进行，这与测试条化学互补。
发明内容
在一个实施方案中，用于测量全血中胆固醇-相关的血液分析物的测试条包括红细胞分离层，其中当施加至所述测试条的血样向下流经所述红细胞分离层时，所述红细胞分离层从所述血样分离红细胞。测试条还包括从红细胞分离层接收血样的反应层，反应层包括POE-POP-POE嵌段共聚物、表面活性剂和反射率变化反应物，POE-POP-POE嵌段共聚物基本上仅溶解非-LDL胆固醇分析物，非-LDL胆固醇分析物与反射率变化反应物反应以改变血样的反射率。可选地，测试条包括铺展层，其定位于红细胞分离层的顶部。在一个可选方案中，POE-POP-POE嵌段共聚物选自以下组中：Pluronics L101:MW3800，POE7-POP54-POE7；Pluronics L121:MW4400，POE5-POP68-POE5；Pluronics P123:MW5750，POE20-POP70-POE20；和Pluronics F127:MW12600；POE106-POP70-POE106。可选地，表面活性剂是Triton-X。测试条还可包括与红细胞分离层相邻的第二血液分离层，第二血液分离层从血样分离另外的红细胞。任选地，第二血液分离层还包含硫酸葡聚糖。可选地，硫酸葡聚糖的分子量为10K-1000K之间。可选地，可以相似的量使用氯化镁(或镁离子)。在另一可选方案中，硫酸葡聚糖的分子量为50K-750K之间之间。任选地，硫酸葡聚糖的分子量为500K。可选地，POE-POP-POE嵌段共聚物是Pluronics P123:MW5750，POE20-POP70-POE20。任选地，POE20-POP70-POE20嵌段共聚物与Triton-X之比为10份POE20-POP70-POE20嵌段共聚物比1份Triton-X。在一个可选方案中，Triton-X的浓度为至少0.01%。在另一个可选方案中，Triton-X为至少0.1%。在又一个可选方案中，POE-POP-POE嵌段共聚物的浓度为至少1%。任选地，POE-POP-POE嵌段共聚物的浓度为至少2%。可选地，POE-POP-POE嵌段共聚物的浓度为至少3%。任选地，反应层的pH为至少5.4。可选地，反应层的pH为至少6.8。在另一个可选方案中，反应层的pH为至少7.4。任选地，反应层的pH为6.8。可选地，血液分离层包括浸渍有菜豆(Phaselous vulgaris)(PHA-P)凝集素的D-23硼硅酸盐玻璃纤维。
在一个实施方案中，使用干相测试条测定全血样品中非-LDL胆固醇的浓度的方法包括使全血样品接触测试条的血液分离层。所述方法还包括从全血样品分离血细胞，产生血浆，并使血浆流经血液分离层至测试层。所述方法还包括使非-LDL部分优先于LDL部分反应，并在测试层中产生基本上正比于样品中非-LDL部分的浓度的颜色。所述方法还包括测试所产生的颜色。
在另一个实施方案中，用于测定全血样品中LDL胆固醇的浓度的测试条包括具有至少两个堆叠物的测试基体(条)，至少两个堆叠物的第一堆叠物用于总胆固醇，并且至少两个堆叠物的第二堆叠物用于非-LDL。第一堆叠物中包含有产生正比于样品中的总胆固醇量的比色响应的试剂。第二堆叠物中包含有产生正比于样品中的非-LDL胆固醇的量的比色响应的试剂。测试条构造为可通过测试计读取，测试计从第二堆叠物得到非-LDL胆固醇值，并从第一堆叠物得到的总胆固醇值减去非-LDL胆固醇值以得到样品中的LDL胆固醇值。
在另一个实施方案中，用于测定全血样品中的LDL胆固醇浓度的测试条和测试计的组合包括测试条。测试条包括测试基体(条)，其具有至少两个堆叠物，至少两个堆叠物的第一堆叠物用于总胆固醇，并且至少两个堆叠物的第二堆叠物用于非-LDL。第一堆叠物中包含有产生正比于样品中的总胆固醇量的比色响应的试剂。第二堆叠物中包含有试剂以产生正比于样品中的非-LDL胆固醇的量的比色响应的试剂。该组合包括测试计，其构造为读取测试条。测试计构造为从第二堆叠物得到非-LDL胆固醇值，并从第一堆叠物得到的总胆固醇值减去非-LDL胆固醇值而得到样品中的LDL胆固醇值。
在另一个实施方案中，从提供血样的人对象测试LDL胆固醇的方法包括提供干测试条和在干测试条处接收血样。所述方法包括在干测试条的第一层中从血样分离红细胞，以及在反应层中使血样中的非-LDL胆固醇反应。所述方法包括产生正比于非-LDL胆固醇的颜色变化，以及测试该颜色变化以测定血样中的非-LDL胆固醇量。所述方法包括从血样中的总胆固醇量减去非-LDL胆固醇量而得到此血样的LDL胆固醇量。任选地，血样来自于未经禁食的个体，并且所得的LDL胆固醇量比Friedwald公式更精确。可选地，用以确定非-LDL胆固醇的曲线斜率在0.90-1.10之间。任选地，VLDL胆固醇不作为LDL胆固醇测定。可选地，反应层包括POE-POP-POE嵌段共聚物、表面活性剂和反射率变化反应物，其中反应包括基本上仅溶解非-LDL胆固醇分析物，非-LDL胆固醇分析物与反射率变化反应物反应以改变血样的反射率。可选地，POE-POP-POE嵌段共聚物选自以下组中：Pluronics L101:MW3800，POE7-POP54-POE7；Pluronics L121:MW4400，POE5-POP68-POE5；Pluronics P123:MW5750，POE20-POP70-POE20；和Pluronics F127:MW12600；POE106-POP70-POE106。在一个可选方案中，表面活性剂是Triton-X。任选地，所述方法包括将血样用铺展层铺展，所述铺展层定位于为第一层的顶部。在一个可选方案中，所述方法还包括在总胆固醇反应层使血样反应，所述总胆固醇反应层被定位以接收来自铺展层的部分血样；产生正比于总胆固醇的颜色变化；和测试颜色变化以确定血样中的总胆固醇量。任选地，测试条包括与红细胞分离层相邻的第二血液分离层，第二血液分离层从血样分离另外的红细胞，其中第二血液分离层还包含硫酸葡聚糖。可选地，第一层包含浸渍有菜豆(PHA-P)凝集素的D-23硼硅酸盐玻璃纤维。
附图说明
图1a和1b显示了在临床化学分析仪(例如Roche Cobas Integra400+)上对于利用Pluronics L121和Triton X-100的两个试剂体系收集的反应动力学数据以验证对于非-LDL胆固醇的选择性；
图2a和2b显示了在具有和不具有Triton X和Pluronics P123的基于试剂的体系中反应的HDL和LDL部分(动力学)的对比；
图3a显示对于反射率%(%R)和试验测试(P123和Triton-X)而言的反应动力学；
图3b显示使用图3a的Kubelka-Munk公式的%R图的线性；
图4a-4b显示对于使用两个不同血液供体测试的条的K/S而言的动力学图，条件1是使用Triton X-100的对照，而条件2是包含P123和Trition X-100的试验测试条；
图5a-5h显示了使用P123和Triton X-100的测试图，其仅显示出与多种分析物的相关性；
图6显示P123和Triton X-100的混合物的非溶血性质；
图7显示目前的Polymer Technology Systems，Inc.(PTS)的对照测试，其反应层包含2%的P123和0.1%的Triton X-100；和
图8a-8d显示对于多种的硫酸葡聚糖组合的浓度测试。
具体实施方式
特定术语在本文中仅出于便利使用，并且不作为对于非-空腹的LDL测试条的实施方案的限制。在附图中，相同的附图标记用于指示多个附图中的相同要素。
词语“右”、“左”、“前”和“后”指示附图中标记的方向。词语“向内”和“向外”分别是朝向和远离非空腹的LDL测试条及其指示部分的几何中心的方向。术语包括以上特别述及的词语、其衍生词和相似意义的词语。附图是按比例的。
在不同的视角下并特别参照如下描绘的各附图，相似的附图标记指示相似或相应的部分。
简言之，已产生非空腹的LDL测试，其中使所有的非-LDL反应并测试，然后将其从总胆固醇量中减去，以确定LDL浓度。该测试基于提供溶解所有的胆固醇而非-LDL的化学品以用于测试。在一些实施方案中，该化学品包括Triton X-100和Pluronics P123。在一些实施方案中，包括初始不完全的沉淀步骤以改进所得LDL的去除。在一些实施方案中，提供此初始的不完全沉淀，并为了增强Triton X-100和Pluronics P123的选择性，此初始的不完全沉淀包括另外加入硫酸葡聚糖/Mg+2，其带来10%以内的测试偏差。测试是指非空腹的，因为该测试足够特异而使其精确性不会受到乳糜微粒存在的不利影响。在该实施方案中，在不使用标准超速离心下测试分离脂蛋白密度类别的能力是独特的，这是由于除了LDL之外的密度不同的脂蛋白颗粒的选择性溶解。
如上所述，希望有直接的LDL测试技术，其不依赖于从总胆固醇的预测性计算。由于希望有这样的测试，申请人分析了Kyowa-Medex的专利。Kyowa-Medex专利(US6,794,157B1)的作者Hirochi Sugiuchi描述了聚氧乙烯-聚氧丙烯(POE-POP)三嵌段共聚物—Pluronics L121作为关键组分用于在基于两个试剂的水性体系(“湿法化学”)直接测试LDL，其适用于Roche的临床化学分析仪，例如Integra917，Modula P和Cobas Integra400+。湿法化学体系根据干测试条体系而显著变化，因为在湿法化学体系中，反应物可在特定时间下加入，并因此可精细地控制时机。此外，在湿法化学体系中，相对于干测试条，所有反应物倾向于移动并具有活性，由于降解和其他移动问题，这要求更高浓度的反应物。对该组分的研究证实对于它对LDL本身不具有选择性。该专利简单地提及使用多种助表面活性剂(其一个实例是使用Emulgen L40)、α-磺化环糊精和酶，这使得初步认为它们在反应中起相对次要的作用。但是，对于在如Sugiuchi的两个试剂形式中的LDL选择性，在未成功筛选Pluronics L121后，开始明白这些添加剂比之前想象的更关键。此外，发现Emulgen L40(由Kao Corporation生产)不是市售可得的；并且我们相信Kyowa-Medex对于该助表面活性剂具有专有权。本申请人已重复且彻底测试美国专利6,794,157B1中概述的方法；但是，相信专有的方法和反应物未公开或不是公众可得的。
在如上所述地对所涵盖的许多表面活性剂、酶和糖化合物进行深入研究和筛选尝试之后，开始明白Kyowa-Medex专利是不易于重现的。一些专有方法是例外性的，其阻碍了产生另一成功的单步骤的LDL测试。但是，在临床化学分析仪上观察基于两种试剂的体系中，已知不区别测试条脂蛋白的一些Pluronics L121和Triton X-100的组合产生有趣的结果。
在尝试鉴定对LDL的选择测试中(其导致干测试条)，进行更基础的方法以完全理解L121和Triton X-100的作用。初始采用相似的基于两个试剂(“湿法化学”)方法。如从以下的反应动力学可见(图1a和1b；在临床化学分析仪上收集数据)，HDL(趋势线100)以比LDL部分(趋势线110)以更快的速率反应。在这些图中，在点120添加样品。该结果是非常不可预期的，因为Triton X-100传统上被用作常规表面活性剂以溶解所有的脂蛋白，并主要用作总胆固醇测试中所选择的表面活性剂。因此，已知溶解所有脂蛋白的化合物与被认为仅溶解LDL的化合物的组合实际上产生溶解所有非-LDL的结果。图1a(HDL)和图1b(LDL)显示与酶/MAOS N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺/4AAP(pH6.8)的钠盐溶液组合而得到最终的表面活性剂溶液0.25%TX100/0.5%L121的TX100/L121溶液的吸光率对时间的图。然后该试剂在标记120处与样品组合，并在设定的时间间隔下进行测试，直至反应结束。应注意，所使用的Triton-X的量比常规用以溶解所有脂蛋白的量少得多。简言之，在按照美国专利6,794,157B1重复LDL测试，并实现直接的LDL测试的尝试中，得到非常不同的结果。按照表1中列出的专利实施例，作者采用0.2%Pluronic L121和0.1%Emulgen911以实现高的LDL对HDL的选择性。但是，在我们的实验室中重复相同的浓度时，我们发现高的HDL对LDL的选择性，这与美国专利6,794,157B1的主张相反。滴定不同的Emulgen911和L121的组合仅给出相同的选择性(高HDL:LDL)，并且有时相反无选择性。该选择性的逆转促进了使用TX-100和其他的辛基酚和壬基酚的测试。
初始时认为这将导致可仅反应LDL的测试。但相反地，测试结果显示反应所有组分而非-LDL的测试的可能性。虽然这与初始希望的反应相反，但是已确定使所有的非-LDL反应，并从已知的总胆固醇值减去该值的测试。虽然不是直接的，但是该方法仍然比Friedwald公式具有多个益处。Friedwald公式最大的不足在于VLDL预计假定为三甘油酯浓度的1/5。对于许多人来说并不如此，并且Friedwald公式通常低估对于未经禁食的个体的LDL。这些问题将通过测试非-LDL(HDL+VLDL+CM)解决，其给出与直接LDL测试相同的LDL值。
当用Triton X-100溶解时，Pluronics L121证实了出人意料的HDL选择性。因此，总结出Triton X-100和POEX-POPY-POEX的组合可得到对于HDL和对所有的非-LDL的高特异性。尝试不同的Pluronics系列以尝试提高该选择性被认为是值得的试验。在一些实施方案中，任选使用不同的Pluronics，其包括但不限于：
·Pluronics L101:MW3800，POE7-POP54-POE7；
·Pluronics L121:MW4400，POE5-POP68-POE5；
·Pluronics P123:MW5750，POE20-POP70-POE20；
·Pluronics F127:MW12600，POE106-POP70-POE106。
通过组合在MOPS缓冲剂中的0.7ku的胆固醇酯酶、0.5ku的胆固醇氧化酶、12ku的辣根过氧化物酶与0.58mM4-氨基安替比林和2.9mM MAOS、其后是以下浓度的Pluronics(P123)和Triton X-100混合物来制备试剂。该试剂在自动化的临床化学分析仪(即Roche的Cobas Integra400+)上测试以确定选择性。下表显示其选择性。在P123:Triton X-100为10:1时观察到～15:1HDL:LDL的最高选择性。图2a和2b中所示的是在与图1a和1b条件相似且终表面活性剂浓缩物由0.01%P123/0.0005%TX100组成下反应的HDL和LDL部分的对比。第28次循环，标记22表示在加入样品后约2分钟的反应，其表示对于测试条读数器如Cardiochek测试可能的时间限制。图2a显示P123与Triton X-100的组合，其显示HDL趋势线205、LDL趋势线215和VLDL趋势线210。图2b显示仅有P123而无Triton X-100的条件，其显示HDL趋势线240、LDL趋势线250和VLDL趋势线245。这清楚地表明对HDL的选择性超过LDL。
表1：P123和Triton X-100的选择性和浓度
P123:Triton X-100比值和浓度 HDL:LDL选择性
1:1
1%:1% 1.17
0.1%:0.1% 2.32
0.01%:0.01% 2.57
3:1
1%:0.33% 1.84
0.1%:0.033% 3.86
0.01%:0.0033% 5.40
6:1
1%:0.165% 6.28
0.1%:0.0165% 9.65
0.01%:0.00165% 5.29
10:1
1:0.1% 10.71
0.1%:0.01% 14.82
0.01%:0.001% 5.22
20:1
0.1%:0.005% 9.56
0.01%:0.0005% 8.72
根据表1，对于“湿法化学”的最佳浓度出现在约10:1。
P123是较大的、更亲水的POE-POP共聚物，并且发现比L121更以溶解，使得可以测试更大的浓度和比值。HDL对LDL的选择性是在第28次循环处是非常高的(10:1)，使得将P123用作最优选的表面活性剂以与Triton X-100一起使用以选择性地溶解非-LDL。
因此，非-LDL胆固醇的选择性试剂组合的实施方案包括Triton X-100和POEX-POPY-POEX。任选地，这些组合包括分子量为2,500-15,000的POEX-POPY-POEX。任选地，其分子量为4,000-10,000。任选地，其分子量为5,000-7,000。任选地，POEX-POPY-POEX的分子量为5,750。
用于确定这些表面活性剂性质的“湿法化学”方法需要筛选许多测试的表面活性剂/成分。但是，转入干测试条很大程度上需要重新优化浓度和比值。基于两个试剂的“湿法化学”方法不再用于临床分析仪上其他目的。初始时两个试剂的体系是感兴趣的，因为在干测试条中，在不同时间不可加入多个试剂以进行反应的不同部分。当施加样品时，所有的试剂必须存在于测试条中。在湿法化学测试中需要的试剂越多，试剂将相互作用的机会越大，当它们都置于干测试条中并同时润湿时影响测试效率。此外，在转至干测试条时，通常需要浓度高得多的试剂。
为了开发工作测试条体系，在一个实施方案中，如下配置测试条。在基于两个试剂的体系中，10份P123对1份Triton X-100的比值提供最佳效果，Triton X-100的浓度为0.01%。在以前的Polymer Technology Systems，Inc.(PTS)的总胆固醇测试中，Triton X-100的浓度为0.1%。用于干测试条的试剂制备如下：通过使用含5mM4-氨基安替比林的MOPS缓冲剂中的241ku/L胆固醇酯酶、74ku/L胆固醇氧化酶、232ku/L过氧化物酶，和40mM MAOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺的钠盐)，然后是以下浓度P123:TritonX-100体系的溶液浸渍来自Pall的Biodyne A。在制备干测试条之前在恒温干燥通道中干燥该板。在测试条中需要更高浓度的组分以得到与在湿法化学环境中相似的结果。作为对于非-LDL测试的起点，TX-100浓度保持在0.1%，用于与总胆固醇条的直接比较。酶浓度也保持与PTS总胆固醇反应膜的浓度相同。为了维持10:1的比值，将P123的浓度提高至1%，并且pH提高至6.8。然后将试剂涂布在0.45μBiodyne A膜上，并在室温下干燥。
将非-LDL Biodyne塑造成使用以下模式的单一分析物测试条：
血液分离层 Petex
血液分离层 Alhstrom144
第二血液分离层 Cytosep1660
反应膜 非-LDL反应膜
表2：显示根据当前描述的方法的非-LDL的实例。
然后将测试条使用HDL部分(178mg/dL)、LDL部分(188mg/dL)和混合物部分(368mg/dL)在记录反射率百分比(%R)的测试仪上，如在测试仪上测试，直至反应完全。图3a和3b分别显示出对于显示出HDL为325、360，LDL为320、365，(HDL:LDL)的混合物为330、350的样品的试验测试(P123和Triton-X)的%R和K/S。使用Kubelka-Munk公式将反射率转换为K/S单位以形成对于浓度(与吸光率相似)的线性关系，其中浓度的降低直接正比于K/S的降低。
包含P123的试验条的结果是令人鼓舞的。LDL和HDL部份的浓度几乎相当(通过另一测试方法(Integra)确认)，并且混合物的约为单个部分两者的反应的两倍。P123:TritonX-100混合物的加入大幅降低了LDL部分和混合物的动力学轨迹，同时仅略微抑制HDL部分。这暗示了对于P123条观察到的混合物反应的主体由HDL组成。对于浓度降低的脂蛋白部分观察到相似的结果。如结果显示的，相对于由大致相当浓度的HDL部分产生的反射率，由LDL部分产生的反射率降低。反射率与样品中反应的部分的量相关。反射率越高，反应可用的分析物越少。因此，如所示的LDL部分的高反射率体现出可用于检测的LDL胆固醇的量低。由于反应率不与分析物的浓度线性相关，产生K/S图，其提供与分析物浓度的线性关系。出于定量和确定可观察的降低的LDL反应性的目的，以下将仅适用K/S图。
用以确定这些表面活性剂性质的“湿法化学”方法需要筛选许多测试的表面活性剂/成分。但是，转入干测试条需要很大程度上再优化浓度和比值。基于两个试剂的“湿法化学”方法在临床分析仪上不再起其他目的。在湿法化学方法中，在合适的时机加入反应物。相反地，该时机机理通常在干测试条是不可能的，因为试剂必须在干测试条预浸渍。此外，测试条所需的试剂浓度通常大得多，因为试剂在干燥过程中可能失活。
最后，测试全血以确定是否血液基质将干扰P123和TX100的功能。减少颜色，并且在两个血样之间的P123条的K/S值正比于本地血样中的非-LDL的量。图4a-4b显示使用两个不同的血液供体，样品#254和供体ID#66测试的条的动力学图。条件1、415、435表示对照物，而条件2、420、440表示含P123的条。为了该测试，将测试仪的端值增至每两秒0.01R%变化，以观察完全的动力学反应。红色的数据值表示在反应进展时使用<0.2%的反射率变化作为常规测试仪端值。
从全血测试的数据显示在干测试条模式中将非-LDL与LDL区分的可重现的方法是可能的。为了该测试，将测试仪的端值增至每两秒0.01R%变化，以观察完全的动力学反应。红色的数据值表示在反应时使用<0.2%的反射率变化作为常规测试仪端值。这样做以确认非-LDL的动力学曲线移动至完成。
干测试条的成功关键在于优先对于HDL的最高水平的配制选择性，例如5:1(HDL:LDL)比值表示高水平的HDL选择性。由此，如下表中所示，比值为20:1的P123:Trition X-100给出理想的选择性。
表3：选择P123对Triton X-100的比值
P123:Triton X-100比值和浓度 HDL:LDL选择性
10:1
0.5%:0.05% 2.29
1%:0.1% 3.62
2%:0.2% 3.72
15:1
0.75%:0.05% 4.95
1.5%:0.1% 3.69
3%:0.2% 3.50
20:1
1%:0.05% 3.56
2%:0.1% 5.11
4%:0.2% 4.00
图7显示包括目前的Polymer Technology Systems，Inc.(PTS)，包含2%P123和0.1%Triton X-100的反应层的试验测试条，趋势线810表示LDL和HDL混合物，线815表示HDL和线820表示LDL。在5:1HDL:LDL的选择性下观察到LDL的良好抑制，混合物由相等浓度的LDL和HDL部分组成，其给出与总HDL部分相似的值。
之前的研究已描述了干测试条技术的第一尝试，发现定量反应动力学的方法，并验证化学可能性。
干测试条化学的前景似乎是非常有前途的，但结果不再能够使用脂蛋白部分和反应动力学定量。使用新鲜的血清样品，包含P123/Triton X-100的测试条与临床化学分析仪上得到的非-LDL相关，得到将各数据点设为非-LDL值的校正曲线。然后将各数据点从Integra测定的总胆固醇中减去，而得到“测得的LDL”值。将测得的LDL值与Integra的直接LDL值相关联给出在非-LDL测试中任何偏差的指示。
表4：在三个不同的pH水平下，来自三个不同的P123浓度的相关性结果的列表
条件 非-LDL R2 非-LDL v K/S公式 LDL公式 LDL R2
pH5.4;1%P123 0.6212 y=0.0183x+0.119 y=0.7731x+30.224 0.8729
pH5.4;2%P123 0.661 y=0.0159x+0.1843 y=0.7662x+31.028 0.9041
pH5.4;3%P123 0.6511 y=0.0165x-0.0285 y=0.7941x+27.424 0.8882
pH6.8;1%P123 0.8017 y=0.0163x-0.0632 y=0.8533x+19.451 0.9544
pH6.8;2%P123 0.8503 y=0.0126+0.025 y=0.86x+19 0.9736
pH6.8;3%P123 0.8253 y=0.0108x-0.0231 y=0.8612x+18.517 0.9625
pH7.4;1%P123 0.7916 y=0.0105x+0.0206 y=0.813x+24.918 0.9635
pH7.4;2%P123 0.7182 y=0.0099x+0.0193 y=0.7707x+30.691 0.9418
pH7.4;3%P123 0.8278 y=0.0098x-0.0368 y=0.8553x+19.841 0.9661
使用血清测试pH研究外加在10:1的恒定P123:Triton X-100比值下改变P123浓度，以检测任何依赖性。使用12个不同的血清样品在同一天测试所有9个条件，一次通过5个测试仪。
根据以上数据，很清楚P123对于非-LDL提供一些选择性。pH为5.4似乎是较不理想的，因为非-LDL曲线看上去于总胆固醇测试条非常相似；并且pH为7.4也似乎比pH6.8的条的线性更差。在pH6.8的条中，1%P123就精确性和LDL偏差而言排在最后。2%P123比3%P123具有更好的R2，但含3%P123的条具有略微更低的LDL偏差。表示测试中的偏差水平的最终的LDL公式的斜率暗示了一些LDL仍与非-LDL条相互作用。
因此，已确定用于测试条的Triton X-100和POEX-POPY-POEX的组合在pH为约5.4-约8下是可操作的。任选地，该pH为6-7.5。任选地，pH为6.8。因此，已确定用于测试条的Triton X-100和POEX-POPY-POEX的组合为0.1%Triton X-100与0.5%-5%的POEX-POPY-POEX的比值。任选地，该比值为0.1%Triton X-100比1%-3%POEX-POPY-POEX。任选地，该比值为0.1%Triton X-100比2%POEX-POPY-POEX。在一些实施方案中，选择P123用于各种pH和Triton X-100的组合。
值得注意，在科学研究过程中，确定来自IW Treamont的浸渍有菜豆凝集素PHA-P的新硼硅酸盐玻璃纤维膜D-23比来自Pall的无纺的Tuffglass(Alhstrom144)表现更佳。
以下的目的是提高一致性(斜率)，并使其相对于在Roche LDL C+上得到LDL值接近一致或在0.90-1.10的范围，并将截距优选降低至≤5mg/dL。
在一些可选方案中，曲线的斜率通过在非-LDL胆固醇的流动之前沉淀部分LDL而改进。这使得P123/TX100体系和LDL曲线的斜率超过0.9x，其对于成功的测试被认为是理想的。尽管许多化学品可用于LDL的预沉淀，但是在一些实施方案中选择硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，聚乙烯基硫酸盐可用以在上述的Triton X-100和POEX-POPY-POEX处理之前沉淀LDL。
Boehringer Mannheim(聚乙烯基硫酸盐)和Immuno AG(硫酸葡聚糖)的早期LDL测试使用聚阴离子沉淀以沉淀LDL，并测试沉淀之前和之后的总胆固醇的差异。Siekmeir，Rudiger，Clinical Chemistry，1990;36(12):2109-2113研究了这些测试的可靠性和相关性以更好地定量。经历在聚阴离子浓度下的一些VLDL共沉淀的两种测试需要沉淀样品中的所有LDL，而葡聚糖方法沉淀较少的VLDL。
虽然以上方法单独不足以精确地测试LDL，但是痕量的多阴离子被用以去除一些LDL，但以足够低的浓度使VLDL完好。其后的想法是可在LDL颗粒与非-LDL反应膜反应之前减少LDL颗粒，减少非-LDL膜已排除的LDL的量。过多的聚阴离子(例如硫酸葡聚糖)破坏LDL的选择性。
该方法的第一步骤需要试验验证一些LDL可沉淀而不影响非-LDL。使用150mMMgCl2测试MW5K、10K、50K和500K的硫酸葡聚糖，而500K的硫酸葡聚糖被鉴别为最合适。
表5：使用1份DS试剂(对于对照物为盐水)与20份LDL部分组合的结果
在添加试剂之后立即离心样品，并在Integra上测试上清液的总胆固醇、HDL和LDL。
表5显示了LDL浓度降低而不影响VLDL或HDL的浓度。从筛选硫酸葡聚糖的结果使得相信约20%的LDL可在任何非-LDL沉淀之前从样品被去除。
具有MW5K；50K；500K；>500K的各种硫酸葡聚糖(DS)与宽范围的MgCl2浓度一起测试。测试大部分在Cobas Integra400+作为试剂进行以确定最优的浓度。测试含150mMMgCl2的0.15%w/v的分子量为500K的硫酸葡聚糖储备液以测定在哪一点仅沉淀LDL。
下表6显示20份的含盐水的固定含量的LDL部分与1份储备液混合产生优选的组合。当与使用盐水处理的作为对照物的等份相同样品(参见标记行)对比时，LDL的浓度降低～33mg/dL，同时保持VLDL的浓度在43.3mg/dL基本不变。这证实了在VLDL存在下至少一些LDL已沉淀而不影响VLDL的浓度。
表6：不同硫酸葡聚糖浓度的效果
由于硫酸葡聚糖/MgCl2与LDL的瞬时反应，为了LDL沉淀和去除而将其放置的最佳层是Cytosep。将浸渍有0.15%硫酸葡聚糖(MW500K)和150mM MgCl2的Cytosep1660放置在条中，其高于包含P123:Triton X-100的非-LDL反应膜。使用全血样品的测试给出极佳的对于LDL的最后相关性。这表明与以下标记的测试样品中观察到的相似的血浆与硫酸葡聚糖/MgCl2的相互作用比值被维持或存在于测试条中。
在已知的浓度下使用LDL部分进行滴定研究以确定在测试条中的硫酸葡聚糖/MgCl2浓度水平。测试三个浓度：i)0.007%DS/7.5mM MgCl2，图8a，趋势线910；ii)0.015%DS/15mM MgCl2，图8C，趋势线930；和iii)0.075%DS/75mM MgCl2，图8B，趋势线920；在包含非-LDL胆固醇膜以及并排对照物的测试条中。对照物条包含非-LDL反应膜，但在Cytosep1660中不具有硫酸葡聚糖/MgCl2，图8D，趋势线940。以下的相关性显示出仅0.075%DS/75mMMgCl2展示良好的相关性和与Integra LDL的一致性。但是，当使用全血测试时，该浓度需加倍。
硫酸葡聚糖/Mg+2的滴定显示出0.15%硫酸葡聚糖对于血清样品是理想的。Cytosep包含0.15%硫酸葡聚糖/150mM MgCl，并且位于P123/TX100反应膜顶端。
图5a-5h中的图显示了仅对于非-LDL的相关性。在图5a中，图显示了根据本文所述方法测试的非-LDL的量与根据工业接受的技术测定的Integra非-LDL量的对比。在该情况中，术语Integra用以表示使用Integra917，Modula P和Cobas Integra400+选择性的分析物测试。趋势线510显示对于接受标准的相关性是高的。图5B和趋势线520显示根据本文所述方法的非-LDL相对于Integra总胆固醇之间的关系。图5B应对比5C，显示出Integra非-LDL测试与Integra总胆固醇(趋势线530)的对比。在这两种情况中，相关性低且非常相似，显示出根据本文所述的Integra非-LDL和非-LDL两者是相似的，且与总胆固醇不相关。图5D显示趋势线520，530的组合图作为对比。图5E和趋势线550显示根据本文所述的方法的非-LDL与Integra LDL对比之间的关系。图5E应与5F对比，显示出Integra非-LDL测试与Integra LDL(趋势线560)的对比。在这两种情况中，相关性低且非常相似，显示出根据本文所述的Integra非-LDL和非-LDL两者是相似的，且与LDL不相关。图5G显示趋势线550，560的组合图作为对比。
图5h中的最后的LDL曲线似乎极佳，由于对于Integra没有LDL偏差(0.99的斜率)，并且相关性非常好(R2=0.9813)。这将根据本文所述的技术的LDL与Integra LDL测试对比。趋势线540显示非常高的相关性。作为对照物，当相同选择性的膜与总胆固醇反应膜一起放置(其仅由Triton X-100组成)时，未观察到非-LDL的相关性，表明P-123在非-LDL反应膜中起着非常重要的作用。
也就是说，趋势线520显示非-LDL对总胆固醇的相关性。趋势线520和550显示出实际上分别对于总胆固醇和LDL没有相关性。在图5h中，趋势线540显示出在从integra LDL测试中测得的LDL和从本文所述和前一段落中的测试中的实施方案中测得的LDL之间的相关性。清楚地是，存在非常高的相关性，几乎为1：1，其提示所得方法是高精确性的。
图5h中的最后的LDL曲线似乎极佳，由于对于Integra没有LDL偏差(0.99的斜率)，并且相关性非常好(R2=0.9813)。作为对照物，当相同选择性的膜与总胆固醇反应膜一起放置(其仅由Triton X-100组成)时，未观察到非-LDL的相关性，表明P-123在非-LDL反应膜中起着非常重要的作用。
在可开始全血测试之前，考虑表面活性剂对于溶血性的影响。已知Triton X-100是非常溶血的，其在一定程度上使得需要良好的血液分离膜。图6验证了P123是不溶血的，并且当与Triton X-100组合时，防止任何溶血性活动，管610表示盐水中全血的结果，管620表示在Triton X-100中全血的结果，管630表示在2%P123中全血的结果，管640表示在0.1%Triton X-100和2%P123中全血以及全血与盐水、TX100、P123及它们的混合物组合的结果。可清楚观察到P123是非溶血性的，并且当与Triton X-100组合时，防止任何溶血性活动。
溶血性数据是激动人心的，因为其表明当与P123组合时TX100性质的变化不明显。对于TX100缺少任何增大的溶血性使得可对全血测试，而无增大的溶血性误差的担忧。
在4种不同的情况下，在试验测试条上继续全血测试。下表汇总了LDL分析物的校正曲线和最后相关性的结果。
表7：4个不同系列的全血测试对比结果表
条目 非-LDL R2 非-LDL v K/S公式 LDL公式 LDL R2
1 0.8548 Y=0.01x-0.1826 Y=0.9629x+4.2732 0.9802
2 0.5979 Y=0.0102x-0.2011 Y=0.9313x+6.897 0.9529
3 0.9333 Y=0.0098x-0.1936 Y=0.973x+3.3117 0.9765
4 0.874 Y=0.0104x-0.2372 Y=0.9835x+0.9834 0.9203
所有的条由下述的模式组成。
对于全血的数据似乎在LDL偏差和相关性上极佳。本领域技术人员可从之前的数据中总结出以以下模式已产生从可靠的总胆固醇测试计算LDL的成功的非-LDL条：
血液分离层 Petex
血液分离层 含菜豆凝集素的D-23硼硅酸盐玻璃
第二血液分离层 Cytosep(0.15%硫酸葡聚糖/150mM MgCl)
反应膜 非-LDL反应膜(3%P123/0.2%TX100)
重要的是注意以单分析物的条的该构造处于概念验证阶段。在最后的研发阶段，非-LDL测试将位于至少具有胆固醇和以下显示的另一分析物的平板上。
还应注意，本报告中可见的各LDL曲线已通过将非-LDL值从Integra总干固醇测试中减去来计算。研发最佳的非-LDL测试需要完成大量的工作，例如确定制备方法、干扰物和稳定性。但是，已证明与非-LDL的初始化学反应在单分析物的条模式下工作。如果化学品在该模式下工作，则合理推断它可放置于使用Polymer Technology Systems，Inc.(PTS)，胆固醇测试的平板模式中，以得出简单的LDL测试与Integra直接LDL测试的相关性良好。
虽然在以上详述的说明书中说明详细描述和在附图中说明了具体实施方案，但是本领域技术人员将理解根据其公开和宽泛的发明概念可发展对于那些细节的各种变化和替换。因此，应理解本公开的范围不限于和本文公开的特定的实施例和实施，而意图覆盖其精神和范围内的修改，其是如随附的权利要求及其任何或全部等同所限定的。应注意，尽管显示了特定实施方案，但在实施方案之间可互换各从属的特征。

Claims (28)

1.用于测试全血中的非-LDL胆固醇分析物的干测试条，所述干测试条包括：
红细胞分离层，其中当施加至所述干测试条的血样向下流经所述红细胞分离层时，所述红细胞分离层从所述血样分离红细胞；和
反应层，其中所述反应层从所述红细胞分离层接收所述血样，所述反应层包括POE-POP-POE嵌段共聚物、表面活性剂和反射率变化反应物，所述POE-POP-POE嵌段共聚物基本上仅溶解非-LDL胆固醇分析物，所述非-LDL胆固醇分析物与所述反射率变化反应物反应以改变所述血样的反射率；其中所述POE-POP-POE嵌段共聚物为Pluronics系列嵌段共聚物，且所述表面活性剂为Triton X-100。
2.权利要求1的干测试条，其还包括铺展层，所述铺展层定位于所述红细胞分离层的顶部。
3.权利要求1的干测试条，其中所述POE-POP-POE嵌段共聚物选自以下组中：PluronicsL101:MW 3800,POE7-POP54-POE7；Pluronics L121:MW 4400,POE5-POP68-POE5；PluronicsP123:MW 5750,POE20-POP70-POE20；和Pluronics F127:MW 12600,POE106-POP70-POE106。
4.权利要求1的干测试条，其还包括与所述红细胞分离层相邻的第二血液分离层，所述第二血液分离层从所述血样分离另外的红细胞。
5.权利要求4的干测试条，其中所述第二血液分离层包含硫酸葡聚糖。
6.权利要求5的干测试条，其中所述硫酸葡聚糖的分子量为10K-1000K。
7.权利要求5的干测试条，其中所述硫酸葡聚糖的分子量为50K-750K。
8.权利要求5的干测试条，其中所述硫酸葡聚糖的分子量为500K。
9.权利要求1的干测试条，其中所述POE-POP-POE嵌段共聚物是Pluronics P123:MW5750,POE20-POP70-POE20。
10.权利要求9的干测试条，其中POE20-POP70-POE20嵌段共聚物与Triton X-100之比为10份POE20-POP70-POE20嵌段共聚物比1份TritonX-100。
11.权利要求10的干测试条，其中所述Triton X-100的浓度为至少0.01％。
12.权利要求10的干测试条，其中所述Triton X-100为至少0.1％。
13.权利要求10的干测试条，其中所述POE-POP-POE嵌段共聚物的浓度为至少1％。
14.权利要求10的干测试条，其中所述POE-POP-POE嵌段共聚物的浓度为至少2％。
15.权利要求10的干测试条，其中所述POE-POP-POE嵌段共聚物的浓度为至少3％。
16.权利要求10的干测试条，其中所述反应层的pH为至少5.4。
17.权利要求10的干测试条，其中所述反应层的pH为至少6.8。
18.权利要求10的干测试条，其中所述反应层的pH为至少7.4。
19.权利要求10的干测试条，其中所述反应层的pH为6.8。
20.权利要求1的干测试条，其中所述血液分离层包括浸渍有菜豆凝集素(PHA-P)的D-23硼硅酸盐玻璃纤维。
21.从提供血样的人对象测量LDL胆固醇的非诊断方法，所述方法包括：
提供干测试条；
在所述干测试条处接收所述血样；
在所述干测试条的红细胞分离层中从所述血样分离红细胞；
在反应层中使所述血样中的非-LDL胆固醇反应；
产生正比于所述非-LDL胆固醇的颜色变化；
测量所述颜色变化以测定所述血样中的非-LDL胆固醇量；和
将所述非-LDL胆固醇量从所述血样中的总胆固醇量中减去，以得到所述血样中的LDL胆固醇量；
其中所述反应层包括POE-POP-POE嵌段共聚物、表面活性剂和反射率变化反应物，其中所述反应包括基本上仅溶解非-LDL胆固醇分析物，所述非-LDL胆固醇分析物与所述反射率变化反应物反应以改变所述血样的反射率；其中所述POE-POP-POE嵌段共聚物为Pluronics系列嵌段共聚物，且所述表面活性剂为Triton X-100。
22.权利要求21的非诊断方法，其中所述血样来自于未经禁食的个体，并且所得的LDL胆固醇量比Friedwald公式更精确。
23.权利要求22的非诊断方法，其中VLDL胆固醇不作为LDL胆固醇测定。
24.权利要求21的非诊断方法，其中所述POE-POP-POE嵌段共聚物选自以下组中：Pluronics L101:MW 3800,POE7-POP54-POE7；Pluronics L121:MW 4400,POE5-POP68-POE5；Pluronics P123:MW 5750,POE20-POP70-POE20；和Pluronics F127:MW 12600,POE106-POP70-POE106。
25.权利要求21的非诊断方法，其还包括：
将所述血样用铺展层铺展，所述铺展层定位于所述红细胞分离层的顶部。
26.权利要求25的非诊断方法，其还包括：
使所述血样在总胆固醇反应层中反应，所述总胆固醇反应层被定位以接收来自所述铺展层的部分血样；
产生正比于总胆固醇的颜色变化；和
测试颜色变化以确定所述血样中的总胆固醇量。
27.权利要求21的非诊断方法，其中所述干测试条包括与所述红细胞分离层相邻的第二血液分离层，所述第二血液分离层从所述血样分离另外的红细胞，其中所述第二血液分离层包含硫酸葡聚糖。
28.权利要求21的非诊断方法，其中所述红细胞分离层包含浸渍有菜豆凝集素(PHA-P)的D-23硼硅酸盐玻璃纤维。
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