CN101001946B - 用于在环境温度下进行低密度脂蛋白胆固醇的直接测试条测量的试剂组合及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用低密度脂蛋白和非低密度脂蛋白的不同的表面电荷密度来选择性地使得低密度脂蛋白胆固醇能够被测定的试剂，以测试条在室温下直接测量来自低密度脂蛋白的胆固醇(LDL-C)。

Description

用于在环境温度下进行低密度脂蛋白胆固醇的直接测试条测量的试剂组合及方法

发明背景

本发明主要涉及使用干燥的测试条(test strip)对血浆、血清或全血样品进行体外分析，更具体地，对样品中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)进行测定。

血液中的胆固醇水平已被接受作为冠心病风险的一个重要指示物。胆固醇存在于血液的脂蛋白中，并通过其进行转运。“总胆固醇”包括低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、中密度脂蛋白胆固醇(IDL-C)、乳糜微粒胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。从流行病学和临床研究中已知，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，以及在较低程度上Lp(a)-C，与冠心病之间呈正相关。传统意义上，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)一直被视为“坏”胆固醇。另一方面，临床研究发现高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)(“好”胆固醇)水平和冠心病之间呈负相关。单独来说，血液中的总胆固醇水平，即高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、中密度脂蛋白胆固醇(IDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)和乳糜微粒胆固醇的总和，通常不被视为足够证明冠心病风险的指示物，因为总胆固醇的整体水平不能揭示这些不同来源胆固醇的相对比例。为更好地评估心脏疾病的风险，最好是除测定血样中的总胆固醇水平外，也对血样中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量进行测定。

临床实验室测定低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量最常用的方法是Friedewald计算法。它通过测定总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和甘油三酯的含量来估计低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含 量。尽管Friedewald计算法很方便，但其存在一些明确的缺点。Nauck etal.＂Methods for Measurement of LDL-Cholesterol：A Critical Assessment ofDirect Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation＂Clin.Chem.48.2(2002)。例如，由于Firedewald计算法涉及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)以外的物质的测定，会受到由于测定公式中其他脂类的潜在复合不准确性的影响。而且，它的应用只限于甘油三酯水平低于400mg/dL的生物学液体，据报道当甘油三酯水平超过200mg/dL后，其准确性下降。

超速离心法是一项已知的分离和量化血清或血浆样品中各种脂蛋白成分的技术。但是，超速离心法冗长、耗时，并且超速离心过程中的高盐浓度和离心力会明显改变高度不稳定的脂蛋白。“另外，由于使用了多种不同类型的设备和试管，使得一个实验室与另一实验室的重复非常困难，而且持续分离需高度依赖于技术员的技能和细致。”(Id.At238)。

另一项测定低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的技术是电泳法。这种技术也存在某些缺点。电泳凝胶测定不易自动操作，而且其准确性和可重复性也至少部分依赖于进行测试的技术人员的技术。

其他涉及非低密度脂蛋白的沉淀、加热和其它步骤，被称为匀相测定的方法近来也已投入使用。美国专利5,888,827(Kayahara，Sugiuchi，etal.；转让给Kyowa Medex Co.，Japan)中公开了一种测定低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的匀相测定法。’827专利描述了一种量化液体样品中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度的两段液相反应。在第一步中，将含有低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的样品放入第一种试剂中，该试剂含有三甲基β环糊精(作为糖化合物)、聚氧乙烯单油酸酯(作为蛋白增溶剂)、EMSE(N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰基乙二胺(N-ethyl-N-(3-methylphenyl)-N’，succinylethylenediamene))和Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)。然后将反应混合物加热至37℃，5分钟后读取吸收率。加入第二种试剂，其中含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧 化物酶、4-氨酰安替比林和Tris缓冲液，过5分钟后再次测量同波长下的吸收率。分别将标准胆固醇溶液按同样步骤进行操作，比较各自的吸收率值，来计算低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量。在许多应用中，本方法中操作，如加热、多种试剂和多重读数被视为缺点。由于这种方法即使是在实验室中进行也很复杂、冗长，因而不适用于现场医护(POC)环境。

美国专利6,194,164(Matsui et al.；转让给Denke Seiken，Ltd.Japan)中公开了另一种两段匀相测定法。第一步，除去测试样品中的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)和乳糜微粒胆固醇，第二步，将测试样品中剩余的胆固醇(也即LDL)定量。在第一步中，胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶在存在与非低密度脂蛋白反应的表面活性剂时与测试样品起反应。生成的过氧化氢通过过氧化氢酶分解成水和氧气。或者，酚基或苯胺基氢供体与过氧化氢起反应生成无色化合物。优选的与非低密度脂蛋白反应的表面活性剂包括聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯高级醇醚等等。在’164专利所揭示的第二步反应中，测试样品中剩余的胆固醇(理论上应该只有低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C))，得到了量化。第二步可通过加入至少会与低密度脂蛋白起反应的表面活性剂、定量第一步中加入胆固醇酯酶与胆固醇过氧化酶后反应所生成的过氧化氢来实现。

与’827专利中公开的方法一样，’164专利中的方法的一个缺点是它需要将反应混合物加热至37℃，而且实验数据表明低温会影响测试的准确性。另外，如’827专利中所教那样，164’专利中的方法也需要在不同时刻加入多种试剂，使得其无法被用于现场医护(POC)测试或非处方(OTC)应用中。

H.Sugiuchi et al.，Clinical Chemistry44：3522-531(1998)公开了一种测定血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的匀相测定法。该方法说明了当低密度脂蛋白(LDL)和非低密度脂蛋白与液体测定系统中的三嵌段 共聚物和α-环糊精硫酸盐这一组合相接触时，该组合的使用与低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的选择性酶促反应之间的关系。Sugiuchi et al.的方法中的优选聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物在液体测定反应环境中表现出了有限的溶解性，使其无法采用干测试条测试。

同时另案待审和共同转让的美国专利申请10/663,555(申请日期：2003年9月16日)公开了一种在室温下，使用干化学分析法，对全血样中的低密度脂蛋白胆固醇进行一步分析的方法，通过直接测定总胆固醇和非低密度脂蛋白胆固醇的量来计算全血样中低密度脂蛋白胆固醇的量。尽管这种测定方法克服了现有技术中多步骤、湿化学低密度脂蛋白胆固醇测定方法的大部分问题，但仍优选直接测试。因此，还需要一种方便的、便于使用的、在室温下干燥体系中一步对低密度脂蛋白胆固醇进行直接测定的诊断方法。

发明内容

本发明克服了上述和其他现有技术的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定中存在的问题。一方面，本发明是一种直接的、在室温下对血浆、血清或全血样中低密度脂蛋白中的胆固醇进行检测和测量的方法。该方法包括，对含有低密度脂蛋白和非低密度脂蛋白的血样进行处理，促进低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的酶促转化，而抑制非低密度脂蛋白胆固醇的酶促转化。将血样与组合试剂相接触，这些试剂由于低密度脂蛋白和非低密度脂蛋白的不同的表面电荷密度而与低密度脂蛋白和非低密度脂蛋白起不同反应。任何与样品中的各种脂蛋白相应的、根据脂蛋白的表面电荷密度的的不同而选择性地促进低密度脂蛋白所携带的胆固醇酶化并且抑制或阻止其他类型脂蛋白中的胆固醇酶化的试剂都可以使用。

本发明部分基于可对血样中的低密度脂蛋白和非低密度脂蛋白不同的表面电荷密度进行利用这一发现。乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)和中密度脂蛋白(IDL)在生理pH环境或接近生理pH环境中的表面弱负 电荷特征使他们与某些阴离子聚合物(尤其是硫酸盐)相结合。尽管与—系列硫酸葡聚糖(一种分子量为约5000至约50000的聚阴离子)反应观察到的结果良好，迄今为止，最好的结果是当这些聚阴离子与α-环糊精硫酸盐或其他环糊精衍生物反应时得到的。

高密度脂蛋白(HDL)通常被发现带强负电荷，并且当与特定的硫酸盐和共聚物表面活性剂(copolymeric surfactant)结合时不能生成胆固醇，或暂时受到保护，不受胆固醇—生成酶作用的影响。尽管简单的聚丙二醇和/或聚乙二醇分子也被发现对高密度脂蛋白胆固醇的酶促转化具有抑制作用，优选共聚物表面活性剂为分子量为约2,100至约6,000，聚氧丙烯占优势的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯杂化物(hybrid)。优选聚氧丙烯含量为80—95％的共聚物表面活性剂。

本发明的另一方面部分基于某些低分子量表面活性剂可被用于增加高分子量环聚表面活性剂的溶解性，使其能被用于直接用测试条测定低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)这一发现。在本发明中，这些优选化合物的有限溶解性通过能部分地在三个不同水平起作用的表面活性剂系统得到解决。在第一个水平上，本发明中的表面活性剂将帮助溶解聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯杂化物，而不削弱样品中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)对于非低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的酶促转化反应的选择性。在第二个水平上，表面活性剂部分形成混合的微囊，在多个膜或多层测试条上，其能够转运三嵌段共聚物，并在从试剂膜到胆固醇反应膜转运时释放出低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。在第三个水平上，实际中表面活性剂通常直接靠近或浸润于测试条的胆固醇反应膜，有助于将释放的胆固醇从含有三嵌段共聚物及其他表面活性剂的混合微囊中溶解或乳化出来，已使胆固醇可胆固醇反应膜上的酶系统作用下发生反应。

使用这类试剂对样品中的非低密度脂蛋白的选择性处理通过使用与非低密度脂蛋白选择性相连的阳离子物质得以实现。在本发明的一方面，这种阳离子为二价金属桥。二价金属桥被发现能将试剂与非低密度脂蛋 白表面相连，后者具有足够的负表面电荷密度，而同一样品中的低密度脂蛋白的表面电荷相对为弱阳性。尽管使用镁得到的结果良好，其他二价金属，如钙、锰等也可以使用。另外，任何能通过静电与脂蛋白的负电荷表面和/或聚阴离子连接的物质都能表现出类似的酶选择性。举例来说，使用三乙醇胺硫酸盐作为阳离子进行连接就得到了良好的结果。

仔细选择有助于防止自HDL产生胆固醇的共聚物表面活性剂和其它聚阴离子，以另外启动自未被阻断的LDL产生胆固醇。

测定血样中低密度脂蛋白生成的胆固醇浓度可通过使用已熟知的方法和材料来进行。这些方法和材料的典型代表为在酶促反应中使用能引起颜色改变的Trinder试剂(如共同待审和共同转让的美国专利10/663,555中所描述的那样，该专利基于2002年9月16日提交的临时申请60/411,209)。

另一方面，本发明包括一种用于直接检测血清、血浆或全血样中低密度脂蛋白所生成的胆固醇的垂直流动测试条。这种测试条包括一种阻止或抑制血样中红细胞垂直流动的装置。尽管任何有用的装置都可以使用，迄今为止最好的结果是在使用含有非编织玻璃纤维的材料层时得到的。可选择在这种玻璃纤维层上覆盖上扩散层，促进血液在应用点周围区域的扩散。阻止或至少是抑制红细胞向反应膜表面流动的目的是为了防止对检测结束时化学试剂的颜色变化造成干扰。

测试条还包括置于血样垂直流动路径的物质源，包括能溶于血样并且能在促进低密度脂蛋白生成胆固醇的同时，阻止或抑制非低密度脂蛋白胆固醇生成的物质。这种物质通常被置于血样垂直流动路径的一层或多层，使其能在红细胞从血样中分离后被带入溶液中。但这些物质也可以置于红细胞分离装置之前。

选择能与阻止生成胆固醇的非低密度脂蛋白成分的电特性发生反应的物质。通常，这些物质包括能在上述负电荷成分间形成桥，同时由于低密度脂蛋白的表面弱负电荷特征，又可以避免在血样低密度脂蛋白和保护性成分之间形成桥的二价金属离子源。

测试条还包括置于血样流动路径和远离应用点的，用于引起生成的 胆固醇发生酶化后的颜色变化的物质源。

本发明的一个总的目标是为测定体液中的分析物浓度提供一种干燥的化学测试条。更具体的一个目的是提供一种能直接对全血或血浆中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度的进行测定的干燥测试条。

本发明的一个重要优点在于低密度脂蛋白胆固醇浓度可以直接通过一步分析确定。另一个优点在于诊断测试可以在室温下进行。本发明的其他优点和目标将在本发明的下列描述中进行揭示。

图表简述

图1显示了本发明的测试条。

图2显示了凝胶电泳法测定的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)与通过本发明实施例1中的干燥测试条所测得的％R之间的关系。

图3—9显示了凝胶电泳法测定的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)与通过本发明实施例9—15中的干燥测试条所测得的％R之间的关系。

优选实施方式描述

为增进对本发明原则的了解，可参照附图和下列书面说明中所描述的实施方式。本发明的范围不受此限制。本发明还包括对所述实施方式进行的任何改动和修改，以及技术人员对本发明原则的进一步应用。

图1显示了本发明的一个有用的实施方式。在加样口1和读取口4之间为M-1、M-2、M-3、M-4和M-5层，确定了血清、血浆或全血样品在滴到加样口1后的垂直流动路径。

在本实施方式中，样品首先可能遇到扩散层(选用，图1中未显示，如用的话将直接位于M-1层之上)。扩散层的目的是为了将血样相对均匀地覆盖于大于施加点的口1上。另外，扩散层可使用上述试剂浸渍。扩散层试剂的一个目的是为了增加应用样品和试剂间的接触时间。

血液分离层M-1在本实施方式中，至少部分是阻止或抑制血红细胞 流装置。在一特定例子中，M-1层是一非编织的玻璃纤维层，来自Ahlstrom公司，商品名为“TuffGlass144”。M-1层可含有硫酸葡聚糖、二价金属或等价物、环糊精分子、缓冲剂、增溶剂(如山梨醇或蔗糖)和表面活性剂，包括但不局限于表现出低密度脂蛋白(LDL)或非低密度脂蛋白选择性的共聚物或三环聚合体表面活性剂。

与M-1层一样，M-2层也可以起到限制或抑制红细胞在测试条和相应的膜之间的流动。典型的M-2是一层具有高度不对称性的不对称聚砜膜。在本发明的优选是实力中，该膜为Pall Life Science的BTS SP-300。这层膜也可以含有M-1中所描述的各种成分，但增加了浓度与M-1层显著不同的试剂。另外，可使用表面活性剂来增加脂蛋白释放的胆固醇的流动性。具体来说，M-2可含有全部或部分聚阴离子(如硫酸葡聚糖)、二价或阻止非低密度脂蛋白的其他阳离子，全部或部分环糊精分子、表面活性剂(尤其是全部或部分用于阻止高密度脂蛋白胆固醇和/或获取低密度脂蛋白胆固醇的共聚物或三环聚合物)。与M-1层一样，M-2层也可以包含增溶剂，如山梨醇和蔗糖。

二价金属或其他阳离子的供给可以来源于M-1、M-2或扩散层，但优选M-2或额外的M-4层。二价金属可以是钙、镁或锰。最优选阳离子为镁，因为其价廉、易于获取并确易于操作。阳离子还可以是有效结合脂蛋白的带正电荷的胺类。一种优选的胺为叔胺，如三乙醇胺。

在图1所示的实施方式中，M-2层也是一层血液分离层。它是一种不对称材料，样品接收面的孔径为300微米，检测面的孔径为约3微米。除了帮助阻止或抑制血红细胞流动外，它还降低了整个血样沿垂直路径的流动，以增加样品与试剂的接触时间。

与M-2类似，图1中标为M-3的是一层降低应用样品在垂直路径中的流动速度，以增加样品与试剂膜接触时间的膜。尽管这层膜很少接触到传递脂蛋白选择性的试剂。M-3的设计目标是控制的亲水性和孔径以稀释通过测试条的样品。很多不同的膜都可使用，但此处所选的是Pall Life Sciences的商品名为Supor1200的亲水聚砜膜。同样特别有效的用于M-3层的膜为轨蚀聚碳酸酯膜，如Osmonics公司的0.4微米的Poretics。大多数情况下，这种膜未经过除表面活性剂或其他可促进样品在膜表面扩散的湿润剂的处理。

图1中标为M-4的部分也是一种试剂膜层，可选择含有与M-2中种类相同但比例不同的试剂。与M-2类似，优选的膜为不对称聚砜膜，如Pall Life Sciences的BTS SP-300。在本发明的一些实施方式中，根据M-1、M-2、M-3和图1中未显示的选用扩散层的组成和试剂，M-4层可为选用。

图1标为M-5的是胆固醇检测膜，可以是另案待审和共同受让的美国专利申请10/663,555(申请日期：2003年9月16日)中所描述的膜。

实施例1

根据图1的相关结构和下列膜制成干燥测试条：

M-1层：按“A部分”的描述浸渍的Tuffglass。

M-2层：按“B部分”的描述浸渍的BTS-300。

M-3层：Supper1200，未处理。

M-4层：按“B部分”的描述浸渍的BTS-300。

M-5层：Biodyne A，如另案待审和共同受让的美国专利申请10/663,555(申请日期：2003年9月16日)。

将M-1，Tuffglass在“A部分”溶液中浸泡，并在38±2.5C°下的流动空气中干燥。

A部分

往300ml实验室D.I.水中加入以下物质：3.5克MES缓冲剂、9.0克山梨醇、9.0克蔗糖、7.0克聚乙二醇200、10.03克硫酸葡聚糖10K、2.01克NaCl，使用5N NaOH将溶液pH值调至5.90+/-0.1。加入总量为2.8ml的5N NaOH将最终pH值调为5.85。

从该原液中取出169.89克液体，放入250mL的烧杯中。往烧杯中加入2.0克硫酸葡聚糖10K。加入760u，L5N NaOH将最终pH值调为5.95。将Tuffglass浸泡在该溶液中，然后垂直悬挂使多余的溶液从膜上滴去。再将膜放在夹板上，按标准加热条件在干燥通道中水平干燥。

B部分

往200.15克实验室D.I.水中加入以下物质：2.0克MES缓冲剂、9.06克山梨醇、7.04克MgCl₂ 6H₂O。加入1.025ml5N NaOH将溶液pH值调为6.03。将溶液冷却至5C，加入以下物质：1.38克α-环糊精、0.73克Silwet L-77、1.66克Pluronic L121、0.45克Pluronic L43。所有添加过程中溶液均为冷却。在加入浸渍试剂组合源之前，先将浸渍膜所用的派雷克斯玻璃碟在冷冻柜中冷却。将约70mL“B部分”溶液加入冷却的玻璃容器中。将膜浸渍后垂直悬挂干燥，滴去多余的试剂。不需加热或使用流动的空气，使膜自然干燥。

图2说明了使用图1中的测试条对12种不同的血样进行测定得到的数据，每种血样的结果都是六个测试条检测值的平均值。使用凝胶电泳法对同一样品的对照部分的低密度脂蛋白胆固醇进行了测定。证明这些对照部分和根据本发明中方法和仪器进行的测定之间的关系良好，如图2所示。

实施例2

按照图1的相关结构和以下膜制成干燥测试条：

M-1层：按“C部分”的描述浸渍的Tuff Glass。

M-2层：无

M-3层：Supor1200，未处理。

M-4层：按“D部分”的描述浸渍的BTS SP300。

M-5层：Biodyne A。

C部分

将以下溶液倒入深度滤膜中，滤膜含有无定形的纤维或玻璃、聚合物或任意复合物基质的复合材质。可使用任何已知的方法(如浸渍、喷雾或冷冻干燥)来浸渍，形成干燥测试条的顶层试剂层。

往50ml D.I.水中加入以下物质：1.23克MOPS缓冲剂、1.5克平均分子量为10,000的硫酸葡聚糖、0.5克a—环糊精硫酸盐、2.99克山梨醇、3.0克蔗糖、0.6克氯化镁，均溶于50ml D.I.水中。加入1ml5N NaOH将pH值调为7.17。

D部分

使用以下溶液对膜进行浸透，这种膜也可部分起到从全血样品中分离红细胞，生成流向M-5层的血浆或血清，以及控制当前处理的膜或随后的试剂处理的膜或其他基材上试剂重建的作用。

往300mL D.I.水中加入以下物质：6.01克Pluronic L121、4.32克氯化镁、3.0克MOPS缓冲剂、4.13克α-环糊精硫酸盐、0.63克MPOS缓冲剂、1.08克山梨醇、1.11克蔗糖、0.47毫克Silwet L-77。溶液的pH值为6.95未改变。溶液浊点为20C。滤层经过60.09克溶液处理。

实施例3

根据图1的相关结构和以下膜制成干燥测试条：

M-1层：按“E部分”的描述浸渍的Tuff Glass。

M-2层：按“F部分”浸渍的BTS SP300。

M-3层：Supor1200，未处理。

M-4层：无。

M-5层：Biodyne A。

E部分

往50ml D.I.水中加入以下物质：1.2克MOPS缓冲剂、2.5克葡聚硫酸盐10K、0.5克a—环糊精硫酸盐、2.01克山梨醇、2.0克蔗糖、0.6克氯化镁。使用1ml5N NaOH将pH值调至7.16。

F部分

往300mL D.I.水中加入以下物质：6.19克Pluronic L121，3.22克氯化镁、3.0克MOPS缓冲剂、4.0克α-环糊精硫酸盐、0.55克MPOS缓冲剂、1.1克山梨醇、1.12克蔗糖、1.88mgSilwet L-77，1.05g Pluronic L121。未改变的溶液的最终pH值为7.0。滤层经过60.09克溶液处理。

实施例4

构成本本实施例中的干燥测试条的膜与实施例3中的一样，有TuffGlass(M-1)、BTS SP300(M-2)、Supor1200(M-3)和胆固醇反应膜(M-5)。

使用4.32克MOPS缓冲剂、8.87克硫酸葡聚糖10k、0.5克α-环糊精硫酸盐、9.9克山梨醇、11.25克蔗糖、2.28克氯化镁、7.4克聚乙二醇，溶于168.33克去离子水中制成的溶液处理TuffGlass层(M-1)。使用0.4ml5N NaOH将pH值调为7.11。

使用30.02克以下溶液处理BTS SP300层(M-2)：5.42克PluronicL121，7.05克氯化镁、2.0克MOPS缓冲剂、4.592克α-环糊精硫酸盐、9.01克蔗糖、0.75克羟丙纤维素、1.38克硫酸葡聚糖10K、2.47克SilwetL-77、以及100ml加入了0.33克MPOS缓冲剂、0.65克山梨醇、0.67克蔗糖、～29毫克Silwet L-77、0.09克Tetronicl107。使用0.1ml5N NaOH将溶液的最终pH值调为7.27。Supor1200未经过处理。

实施例5

使用与实施例3中一样的膜(即TuffGlass(M-1)、BTS SP300(M-2)、 Supor1200(M-3)和胆固醇反应膜(M-5))制成本实施例中的干燥测试条。

使用0.35克Pluronic L121、0.06克Tetronic304、1.56克MES缓冲剂、3.11克硫酸葡聚糖10k、0.7687克α-环糊精硫酸盐、2.51克山梨醇、1.17克蔗糖、1.1克氯化镁、0.1克Silwet L-77、溶于75.0克去离子水中处理TuffGlass层(M-1)。使用0.4ml5N NaOH将pH值调为6.14。

使用1.80克Pluronic L121，0.91克硫酸葡聚糖10K、0.7477克α-环糊精硫酸盐、0.8克MOPS缓冲剂、2.0克山梨醇、0.61克蔗糖、0.9克氯化镁、0.29克Tetronicl107，溶于75克去离子水中处理BTS SP300层(M-2)。使用0.15moi5N NaOH将溶液的最终pH值调为7.17。Supor1200未经过处理。

实施例6

根据图1的相关结构和以下膜制成干燥测试条：

M-1层：先按“G部分”、然后按“H部分”，最后按“I部分”的描述浸渍和处理的Tuff Glass。

M-2层：先按“J部分”，然后按“K部分”，最后按“I部分”的描述浸渍的BTS SP300。

M-3层：Supor1200，未处理。

M-4层：无。

M-5层：Biodyne A。

G部分

往1875.0克D.I.水中加入以下物质：8.95克Pluronic L121，17.85Tetronic304、39.1MES缓冲剂、77.64克硫酸葡聚糖10K、19.2克α-环糊精硫酸盐、62.5克山梨醇、29.11克蔗糖、27.35克氯化镁、2.5克SilwetL-77。使用0.4ml5N NaOH将溶液的最终pH值调为6.14。

H部分

使用以下溶液处理G部分浸渍过的膜。往199.6克D.I.水中加入以下物质：8.16克硫酸葡聚糖10K、1.41克α-环糊精硫酸盐、1.85克氯化镁、3.45克MES缓冲剂、3.14克山梨醇。使用1.4ml5N NaOH将溶液pH值调为6.24。

I部分

然后用2.0％的聚乙烯醇溶液处理M-1和M-2层。

J部分

往749.8克D.I.水中加入以下化学物质：16.1克Pluronic L121、9.0克硫酸葡聚糖10K、5.0克α-环糊精硫酸盐、7.9克MOPS缓冲剂、12.8克山梨醇、4.7克蔗糖、7.0克氯化镁、3.42克Tetronicl107、2.2克SilwetL-77。使用3.0ml5N NaOH将溶液的最终pH值调为7.22。

K部分

往100克D.I.水中加入以下化学物质：1.5Silwet L-77、1.05PluronicL121。

实施例7

使用与实施例3中一样的膜(包括Tuff Glass(M-1)、BTS SP300(M-2)、Supor1200(M-3)和胆固醇反应膜(M-5))制成干燥测试条。使用64.6克Pluronic L121、5.79克Tetronic304、12.58克MES缓冲剂、24.97克硫酸葡聚糖10K、6.16克α-环糊精硫酸盐、20.0克S山梨醇、9.3克蔗糖和8.77克氯化镁、0.79克Silwet L-77，溶于599.63克去离子水中处理TuffGlass层(M-1)。使用5.5ml5N NaOH将溶液pH值调为6.21。

使用以下物质处理本实施例中的BTS SP300(M-2)层：3.6克PluronicL121、2.02克硫酸葡聚糖、10K、1.53克α-环糊精硫酸盐、1.78克MOPS缓冲剂、1.21克山梨醇、1.29克蔗糖、1.81克氯化镁、0.62克Tetronicl107、1.03克利泻剂210P、1.51克羟丙基-环糊精、201.5克去离子水。这些膜(M-1和M-2)都要通过干燥通道。Supor1200未经过处理。

实施例8

使用与实施例3中一样的膜(即，TuffGlass(M-1)、BTS SP300(M-2)、Supor1200(M-3)和胆固醇反应膜(M-5))制成干燥测试条。使用0.35克Pluronic L121、0.06克Tetronic304、1.56克MES缓冲剂、3.11克硫酸葡聚糖10K、0.7687克α-环糊精硫酸盐、2.51克山梨醇、1.17克蔗糖和1.1克氯化镁、0.1ml Silwet L-77，溶于75.0克去离子水中处理Tuff Glass层(M-1)。使用0.4ml5N NaOH将溶液pH值调为6.14。

使用1.80克Pluronic L121、0.91克硫酸葡聚糖10K、0.7477克α-环糊精硫酸盐、0.8克MOPS缓冲剂、2.0克山梨醇、0.61克蔗糖、0.9克氯化镁、0.29克Tetronicl107，溶于75克去离子水中处理BTS SP300(M-2)层。使用0.15ml5N NaOH将溶液的最终pH值调为7.17。Supor1200未经过处理。

实施例9

本实施例中的干燥测试条由非玻璃纤维顶层(M-1)Accuwick Ultra、BTS SP300层(M-2)、BTS SP300层(M-4)、和胆固醇检测膜(M-5)构成。将下列化学物质溶解于375克去离子水中，对Accuwick Ultra层进行处理：7.80克MES缓冲剂、15.57克分子量为10.000的硫酸葡聚糖、3.85克α-环糊精硫酸盐、12.5克D-山梨醇、5.82克蔗糖、5.47克氯化镁、1.79克Pluronic L121、3.59克Tetronic304和0.5克Silwet L-77。使用2ml5NNaOH将溶液pH值调为6.16。

使用以下溶液浸泡第一层BTS SP300层(M-2)，除去多余的溶液：往187.5克去离子水中加入以下化学物质：2.18克PVA30-70K mwt、1.75克Tetronic304、4.02克MES缓冲剂、7.77克Dextralip15、1.96克α-环糊精硫酸盐、7.31克D-山梨醇、1.40克蔗糖、3.52克MgS04、2.5克分子量为6,000的聚乙二醇、57毫克消泡剂。使用1.5ml5N NaOH将上述溶液的pH值调为6.27。

使用由以下化学物质在两种溶液中溶解制成的溶液来处理第二层BTS SP300层。第一种溶液含有20.35克4％的PVA30-70K mwt溶液和30.55g由以下化学物质溶于50.01克去离子水中制成的溶液：2.048克PVA30-70K mwt、2.31克Pluronic L121、1.20克分子量为10,000的硫酸葡聚糖、1.25克氯化镁、1.31克Bis Tris缓冲剂、1.04克gα-环糊精硫酸盐、3.75克D-山梨醇、0.0256克Silwet L-77以及0.03克Tetronic30、0.47克CHAPS。加入约2.5ml3.25N HCL将溶液的pH值调为6.48。

对照部分和16例使用实施例9中的测试条进行的分析之间具有很好的相关性，如图3所示。

实施例10

本实施例中的干燥测试条由Tuff Glass(M-1)、BTS SP300(M-2)、Supor1200(M-3)和胆固醇检测膜(M-5)构成。使用由以下物质溶于300克去离子水中制成的溶液处理TuffGlass层：6.27克MES缓冲剂、12.41克硫酸葡聚糖10K、3.06克α-环糊精硫酸盐、10.01克D-山梨醇、4.65克蔗糖、4.37克硫酸镁、1.43克Pluronic L121、2.90克Tetronic304和0.4gSilwet L-77。使用1.8ml5N NaOH将溶液pH值调为6.15。将下列化学物质溶于296.5克去离子水中，对BTS SP300进行处理：7.20克PluronicL121、3.6克硫酸葡聚糖10K、3.58克硫酸镁、3.15克MOPS缓冲剂、3.20克α-环糊精硫酸盐、8.13克D-山梨醇、2.38克蔗糖以及1.2克Tetronic304。加入1ml5N NaOH将溶液pH值调为7.12。Supor1200未经过处理。

对照部分和14例使用实施例10中的测试条进行的分析之间具有很好的相关性，如图4所示。

实施例11

本实施例中的干燥测试条由Tuff Glass(M-1)、BTS SP300(M-2)、Supor1200(M-3)和胆固醇检测膜(M-5)构成。将下列化学物质溶解于300克去离子水中，对Tuff Glass层(M-1)进行处理：6.67克MES缓冲剂、12.57克硫酸葡聚糖10K、3.07克α-环糊精硫酸盐、10.08克D-山梨醇、5.33克蔗糖、4.41克硫酸镁、2.86克Tetronic304和0.710克叠氮化钠。使用2.25ml5N NaOH将溶液pH值调为6.22。将膜浸泡在溶液中，除去膜上多余的溶液，然后将膜在纤维基材上晾干。

将以下化学物质溶于500克去离子水中，对BTS SP300(M-2)进行处理：12克Pluronic L121、5.99克硫酸镁、5.18克MOPS缓冲剂、5.19克α-环糊精硫酸盐、4.01克D-山梨醇、4.01克蔗糖和1.9克Tetronic304。加入1.5ml5N NaOH后溶液的pH值为7.19。最后，用由4.03克硫酸葡聚糖10K、0.6克α-环糊精硫酸盐、0.57克硫酸镁、1.75克MES缓冲剂和2.0克D-山梨醇溶于100.1克去离子水中配成的溶液喷洒BTS SP300。溶液在加入1.5ml5N NaOH后的pH值为6.31。未对Supor1200进行处理。

对照部分和21例使用实施例11中的测试条进行的分析之间具有很好的相关性，如图5所示。

实施例12

本实施例中的干燥测试条由Tuff Glass(M-1)、BTS SP300(M-2)、Supor1200(M-3)和胆固醇检测膜(M-5)构成。将下列化学试剂溶解于300ml去离子水中，对Tuff Glass层(M-1)进行处理：6.67克MES缓冲剂、12.57克硫酸葡聚糖10K、3.07克α-环糊精硫酸盐、10.08克D-山梨 醇、5.33克蔗糖、4.41克硫酸镁、2.86克Tetronic304和0.710克叠氮化钠。使用2.25ml5N NaOH将溶液pH值调为6.22。

将以下化学物质溶于500克去离子水中，对BTS SP300(M-2)进行处理：12克Pluronic L121、5.99克硫酸镁、5.18克MOPS缓冲剂、5.19克α-环糊精硫酸盐、4.01克D-山梨醇、4.01克蔗糖、5.99克了硫酸葡聚糖10K和1.9克Tetronic304。加入1.5ml5N NaOH后溶液的pH值为7.19。另外，在浸渍BTS SP300之前，加入0.50克含有以下成分的溶液：9.99克Pluronic L123、10.01克Pluronic L101、5.05克Pluronic L103、9.99克Pluronic L61、10.02克Pluronic L64、和2.75克Silwet L-77。当膜干燥以后，使用由以下物质溶于100克D.I.水中配成的溶液喷涂：4.03克硫酸葡聚糖10K mwt、0.6克α-环糊精硫酸盐、0.57克硫酸镁、1.75克MES缓冲剂和2.0克D-山梨醇。加入1.5ml5N NaOH将溶液的pH值调为6.31。最后，用由4.03克硫酸葡聚糖10K、0.6克α-环糊精硫酸盐、0.57克硫酸镁、1.75克MES缓冲剂和2.0克D-山梨醇制成的溶液喷涂BTS SP300。加入1.5ml5N NaOH将溶液的pH值调为7.19。Supor1200未经过处理。

对照部分和21例使用实施例12中的干燥测试条进行的分析之间具有很好的相关性，如图6所示。

实施例13

本实施例中的干燥测试条由Tuff Glass(M-1)、BTS SP300(M-2)、Supor1200(M-3)和胆固醇检测膜(M-5)构成。Tuff Glass层(M-1)经过由6.67克MES缓冲剂、12.57克硫酸葡聚糖10K、3.07克α-环糊精硫酸盐、10.08克山梨醇、5.33克蔗糖、4.41克硫酸镁、2.86克Tetronic304、和0.0710克叠氮化钠溶于300ml去离子水制成的溶液处理。使用2.25ml5N NaOH将溶液的pH值调为6.22。当膜干后，用由4.03克硫酸葡聚糖10K、0.6克α-环糊精硫酸盐、0.57克硫酸镁、1.75克MES缓冲剂和2.0克D-山梨醇溶于100克去离子水中制成的溶液喷涂Tuff Glass。加入1.5 ml5NNaOH将溶液的pH值调为6.31。

BTS SP300(M-2)经过由18.8克Pluronic L121，2.90克硫酸镁、7.37克MOPS缓冲剂、8.96克α-环糊精硫酸盐、7.38克山梨醇、6.00克蔗糖、10.11硫酸葡聚糖10K、7.12克Tetronic304、2.90克Silwet L-77和0.15克叠氮化钠溶于749.5克去离子水中配成的溶液处理。加入2.5ml5NNaOH后溶液的pH值为7.15。另外，在浸泡之前，加入了1.50克以下溶液：9.99克Pluronic L123、10.01克Pluronic L101、5.05克Pluronic L103、9.99克Pluronic L61、10.02克Pluronic L64、和2.75克Silwet L-77。当膜干燥以后，用由以下物质溶于100克D.I.水中制成的溶液喷涂：4.03克硫酸葡聚糖10K mwt、0.6克α-环糊精硫酸盐、0.57克硫酸镁、1.75克MES缓冲剂和2.0克山梨醇。Supor1200未经过处理。

对照部分和15例使用实施例13中的测试条进行的分析之间具有很好的相关性，如图7所示。

实施例14

本实施例中的干燥测试条由Tuff Glass(M-1)、BTS SP300(M-2)、Supor1200(M-3)和胆固醇检测膜(M-5)构成。Tuff Glass层(M-1)经过由6.6克MES缓冲剂、12.57克硫酸葡聚糖10K、3.07克α-环糊精硫酸盐、10.08克山梨醇、5.33克蔗糖、4.41克硫酸镁、2.86克Tetronic304和0.0710克叠氮化钠溶于300ml去离子水中制成的溶液处理。使用2.25ml5NNaOH将溶液的pH值调为6.22。当膜干后，用由4.03克硫酸葡聚糖10K、0.6克α-环糊精硫酸盐、0.57克硫酸镁、1.75克MES缓冲剂和2.0克山梨醇溶于100克去离子水中制成的溶液喷涂Tuff Glass。使用1.5ml5NNaOH将溶液的pH值调为6.31。然后用2％的PVA溶液喷涂Tuff Glass层。

BTS SP300(M-2)经过由18.8克Pluronic L121，2.90克硫酸镁、7.37克MOPS缓冲剂、8.96克α-环糊精硫酸盐、7.38克山梨醇、6.00克蔗糖、 10.11克硫酸葡聚糖10K、2.90克Silwet L-77、7.12克Tetronic和0.15克叠氮化钠溶于749.5克去离子水中配成的溶液处理。溶液的pH值通过加入2.5ml5N NaOH调为7.15。当膜干后，用由24.00克硫酸葡聚糖10K、3.57克α-环糊精硫酸盐、3.58克硫酸镁、10.78克MES缓冲剂和11.82克D-山梨醇溶于600克去离子水中制成的溶液喷涂BTS SP300。使用2.0ml5N NaOH将溶液的pH值调为6.20。最后，用0.15％的Silwet L-77和1.0％的Pluronic L121喷涂BTS SP300(M-2)。Supor1200未经过处理。

对照部分和14例使用实施例14中的测试条进行的分析之间具有很好的相关性，如图8所示。

实施例15

本实施例中的干燥测试条由非玻璃纤维层Accuwick Ultra(M-1)、BTS SP300(M-2)、Supor1200(M-3)和胆固醇检测膜(M-5)构成。Accuwick Ultra层(M-1)先经过由下列物质溶于300克去离子水中制成的溶液处理：6.30克MES缓冲剂、12.43克硫酸葡聚糖10K、3.08克α-环糊精硫酸盐、10.04克山梨醇、4.63克蔗糖、4.37克硫酸镁、2.86克Tetronic304、0.4克Silwet L-77和1.47克含有以下物质的溶液：1.03克β-环糊精聚合物、0.99克随机甲基化环糊精，然后再经过2.98克含有下列物质的溶液处理：2.99克利泻剂210P、9.00克Pluronic L121、1.98克分子量为3,500的聚丙二醇。使用1.75ml5N NaOH将溶液pH值调为6.22。Supor1200未经过处理。

BTS SP300经过由以下物质溶于300克去离子水中制成的溶液处理：5.43克Pluronic L121、2.75克硫酸镁、2.39克MOPS缓冲剂、2.39克α-环糊精硫酸盐、1.80克山梨醇、1.82克蔗糖、1.50克利泻剂210P、0.45克Tetronic304、0.47克Tetronic150R1、0.46克Tetronic901、2.33克羟丙基-环糊精。加入0.9ml5N NaOH将溶液pH值调为7.21。

对照部分和14例使用实施例15中的测试条进行的分析之间具有很 好的相关性，如图9所示。

尽管本发明已通过附图和上述描述进行了详细的说明，但同时应认识到这只是说明性而非限制性的。应当理解此处列出的只是优选实施方式，任何符合本发明宗旨的改动、修改和进一步应用都应受到保护。

Claims (11)

1.一种用于直接检测由全血、血浆或血清样品中的低密度脂蛋白产生的胆固醇的垂直流动测试条，该测试条包括：

a)阻止或减缓红细胞通过所述测试条的进程的红细胞阻止膜；

b)胆固醇检测层，所述胆固醇检测层包含在胆固醇存在的情况下提供颜色变化的试剂；和

c)位于所述红细胞阻止膜和所述胆固醇检测层之间的测试条中的试剂组合源，其可与非LDL脂蛋白结合以防止所述非LDL脂蛋白中的胆固醇在所述胆固醇检测层中被测量到，同时选择性地允许低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)被直接测量，其中所述试剂组合含有共聚物表面活性剂，所述共聚物表面活性剂是聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯杂化物，其分子量为约2,100至约6,000，其中聚氧丙烯占优势。

2.权利要求1的测试条，其中所述试剂选自阳离子、聚阴离子、环糊精衍生物、共聚物表面活性剂以及共聚物表面活性剂的表面活性剂。

3.权利要求2的测试条，其中所述阳离子包括二价金属。

4.权利要求3的测试条，其中所述二价金属为镁。

5.权利要求2的测试条，其中所述阳离子包括有效结合脂蛋白的带正电荷的胺。

6.权利要求5的测试条，其中所述胺为三乙醇胺盐酸盐。

7.权利要求2的测试条，其中所述聚阴离子为硫酸葡聚糖。

8.权利要求2的测试条，其中所述环糊精衍生物为α-环糊精硫酸盐。

9.权利要求1的测试条，其中所述试剂包括有效结合非低密度脂蛋白的高分子量嵌段共聚物表面活性剂和有效增加所述嵌段共聚物表面活性剂溶解度的低分子量表面活性剂。

10.权利要求1的测试条，其中所述红细胞阻止膜浸渍了至少部分所述试剂组合源。

11.权利要求1的测试条，还包括至少一种浸渍了至少部分所述试剂组合源的中间膜。