DE2212285A1 - Verfahren zur Bestimmung der carcinogenen Aktivitaet von Substanzen sowie Untersuchungs-Ausstattung zur Durchfuehrung der Bestimmungsmethode - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung der carcinogenen Aktivitaet von Substanzen sowie Untersuchungs-Ausstattung zur Durchfuehrung der BestimmungsmethodeInfo
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Description
Brian Robert .RABIET, London, England und
David John WILLIAMS, London„
" Verfahren sur Bestimmung der careinogenen Aktivität Von
Substanzen sowie Untersuchungs-Ausstattung sur Durchführung der Bestimmungsmethode SB
Priorität: 16» März I97I,GrosBbritannien,"Hr. 6963/71
Die Erfindung betrifft eine neue Methode sur Bestimmung der careinogenen Aktivität von Substanzen, wobei unter den Begriff
"carcinogene Aktivität" auch hepatotoxische Eigenschaften fallen« Die erfindungsgemässe neue Bestimmungsmethode ermöglichtes,
insbesondere festzustellen, ob bestimmte Substanzen eine carcinogene Aktivität aufweisen. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Untersuchungs-Ausstattung zur Durchführung der neuen
Bestimmungsmethode.
Es ist von grösster Bedeutung, festzustellen, ob von Mensch .und Tier aufgenommene Drogen oder andere Substanzen carcinogene
Aktivität bzw. hepatotoxische Eigenschaften aufweisen.
. ■ ". i 2098U/1221
Die derzeit zugänglichen Testverfahren zur Bestimmung der carcinogenen
Eigenschaften sind ausserordentlich zeitraubende Beispielsweise müssen die zu untersuchenden Substanzen eine
Dsörächtliohe Zeit lang im lebenden Organismus zur Einwirkung
ton-menj und die entsprechenden Auswirkungen müssen über einen
längeren Eeiträum beobachtet- werden, um auf diese Weise feststellen
27. können5 ofc elr. Gewebe krebsartig wird oder nicht«
YiriäoJatiii Siibstansen "^srden äe'ü verschiedensten Laborunter-
:-.-":.ι^λ\ιζ^,. i:.its:::;;orfs;i_ 1ε, 'Άζ'-'-ϊ;:? ":iii,- schnell, durchführbarer
■. :. -."i::li3£J.i;'.:.3j; ±'i "'1"JL=C■--■^\'^:r:::;,Jv.".:.zstest .bekannt ist, der
ι? - :..':r.*:*gl Lo.:.~::- · 3"-':l":0::.::.. r/il.J/^i"·' .;. .-:·:".:"._ ?s en S^ostan^ön mtic! anclo-
:?ΐ-ν. 5ui?ϊ"ti"Γ= 5" si", ^rν5:;:5"1.3LiI3:ι= ..^1;:ιβ dami v/sitcr im lebenden
Im Gewebe kommt im allgemeinen ein Enzym vor, welches die Umlagerung
von Bisulfidbindungen in Proteinen katalysiert und
nachstehend ale Rearrangase bezeichnet wird. Dieses Enzym ist
fest mit der Zellmembran verbunden und in Rattengeweben wird das betreffende Enzym beispielsweise sowohl in den rauhen als
auch in den glatten Bestandteilen des endoplasmischeji Reticulums
gefunden. In dem rauhen Reticulum ist jedoch die Aktivität des Enzyms im allgemeinen durch an die Zellmembran gebundene
Ribosomen maskiert, so dass die enzymatische Aktivität
latent bleibt, bis diese Ribosomen von der Zellmembran abgelöst werden.
Die Membranen des Reticulums können, in zwei Fraktionen aufgetrennt
werden, wobei die glatten Membranen keine daran gebun-
209844/1221 .
denen Ribosomen enthalten, während an die rauhen Membranen derartige
Ribosome gebunden sind ο
Me glatten Membranen zeigen die volle Rearrangase-Aktivität,
welche jedoch dadurch maskiert werden "kann, dass Ribosome an diese glatten Membranen angelagert werden» Im reinen Zustand
enthalten dagegen die rauhen Membranen das Rearrangese-Enzym
im vollständig maskierten Zustand, doch kann die Enzymaktivität durch Entfernung der Ribosome reaktiviert werdenβ
Es wurde nun gefunden, dass eine Reihe von co.rjinogenen Sub- .
stanzen eine Degranulierung der rauhen Mikrosomal-Membran hervorrufen
und dadurch eine Ablösung der Ribosome bewirken, wodurch das aktive Enzym freigesetzt wird» Der Anstieg der Enzymaktivität
kann bei Anwendung geeigneter Untersuchungsmethoden verfolgt werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Bestimmung der carcinogenen
Aktivität von Substanzen ist demgemäss dadurch gekennzeichnet, dass man die zu untersuchende Substanz mit isolierten Zellmembranen
kontaktiert, welche eine maskierte Rearrangase-Aktivität aufweisen, und dass man nach einem vorher bestimmten
Zeitraum die Rearrangase-Aktivität misste
Das für die Durchführung des erfindungsgemässen Bestimmungsverfahrens
anzuwendende Membranpräparat wird vorzugsweise aus dem endoplasmischen Reticulum von Rattenlebern gewonnen, obwohl
an sich auch aus anderen Körperteilen erhaltene Reticularmembranen
für diesen Zweck eingesetzt werden können. Vorzugs-
209844/12 2 1
weise werden dabei solche Reticularmembrane verwendet, bei denen
die enzymatische Aktivität der Rearrangase vollständig durch die Ribosomen maskiert ist und erst in dem Masse wieder zur.Wirkung
kommt, wie die Ribosome von der Membran abgelöst werden. Gemäss einer speziellen Ausführungsform der erfindungsgemässen
Bestimmungsmethode können jedoch auch Reticularmembrane einge-
setzt werden, welche von Haus aus keine angelagerten Ribosome enthalten» Diese Ausführungsform wird nachstehend noch im einzelnen
beschrieben werden«
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Bestimmungsverfahrens
beginnt man daher vorzugsweise mit einer Reticularmembran, welche von sich aus intakte Ribosomen enthält.
Die zu untersuchende Substanz wird sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat
(nachstehend abgekürzt als "NADPH") bebrütet.
Aufgabe der Substanz NADPH ist es, die in der Microsomal-Membran
vorhandene Hydroxylase zur Wirkung zu bringen. Es wird nämlich angenommen, dass dieses Enzym Hydroxylase eine Wirkung
auf Substanzen hat, welche eine latente carcinogene Aktivität zeigen und erst nach Umwandlung durch dieses Enzym die carcinogenen
Eigenschaften voll zur Auswirkung kommen lassen. Das erfindungsgemässe Bestimmungsverfahren iBt daher nicht nur auf
Substanzen anwendbar, die eine direkte carcinogene Aktivität zeigen, sondern es können damit auch Substanzen festgestellt
werden, welche als carcinogene Vorläufer bezeichnet werden können und bei denen die carcinogene Aktivität durch die
209844/1221
Hydroxylase zum Tragen gebracht wirdo
Das angewendete Zellmembran-Präparat kann auch Bestandteile
von glatten Membranen enthalten, um auf diese Weise microsomale
Hydroxylase zur Verfugung zu stellenο :
Das Bebrütungsmedium für die Reticularmembrän wird' mehrere
Stunden lang auf konstanter Temperatur und konstantem pH-Wert gehaltene Nach Beendigung dieser Bebrütungsbehandlung hat die
Anwesenheit von carcinogenen Substanzen zur Ablösung von Ribosomen
von der Ret ic 1J-I^ !membran geführt und dementsprechend i.sf
das Enzym Rearrangase freigesetzt worden und zeigt seine bisher maskierte Aktivität. Das Ausmass der !Enzymaktivität lässt sich
auf Grund ihrer Fähigkeit zur Umlagerung von Disulfid-Bindungen in einem Protein mit statistischer Anordnung für Disulfid-Bindungen
bestimmen» Als Substrat für die Messung der Rearrangase-Aktivität kann beispielsweise ungezielt oxydierte Ribonuclease'
verwendet werden, in welcher die Cystein-Schwefelatome
statistisch gepaart sind« Zu diesem Zweck "wird das Substrat zusammen mit einem Mercaptan; beispielsweise·Mercatoäthanol,
zu der Untersuchungsmischung zugesetzt, welche anschliessend ■
wiederum bebrütet wirdc Die in der ersten Verfahrensstufe freigesetzte
Rearrangase überführt die inaktive ungezielt oxydierte Ribonuclease in die aktive Enzymformο Diese aktive Ribonuclease
lässt sich dann anhand von Standardmethoden bestimmen, welche in der Literatur beschrieben sind, beispielsweise durch Messung
der Veränderungen in der optischen Dichte (J. Biolo Chenu 2Q7
(1954) S«2O1) oder durch Messung der Veränderung des pH-Werts
mittels eines entsprechenden Messgerätes (Biochim. Biophys.
209844/1221 ·
Acta 26ί (1£37) 3, 3Q2)O ' ^
Die Menge an aktiver Ribonuclease lässt sich aber auch aufgrund ihrer Fähigkeit zur hydrolytischen Umwandlung von Cytidin-2»31-phosphat
in Cytidin-3'-phosphat bestimmen. Diese Umwandlung lässt sich durch Messung der Veränderung in der optischen Dichte
messend verfolgen (Biochemo Je 7j_ (1960) S«.234)o Die betreffende hydrolytische Umlagerung kann auch anhand von Veränderungen
im pH-Wert bestimmt werden.
Theoretisch kann die Aktivität des Enzyms Rcr.mngase durch die
Reaktivierung jedes beliebigen Proteins mit falsch angeordneten Cysteinbausteinen bestimmt werden, weil diese Reaktivierung
durch die Rearrangase katalysiert wird, doch ist Ribonuclease für diesen Zweck besonders bevorzugt, weil die Geschwindigkeit
einer spontanen Reaktivierung sehr gering ist und eine Anzahl von Standardmethoden zur Bestimmung der Ribonuclease-Aktivität
zur Verfügung steht0 Anstelle von Ribonuclease kann bei diesem
Aktivitätstest auch ein Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor eingesetzt
werden.
Das Ausmass der insgesamt durch die carcinogene Substanz freigesetzten
Rearrangase-Aktivität lässt sich berechnen und kann
als Bewertungsmaßstab für die carcinogene Aktivität der untersuchten Substanz verwendet werden.
Die erfindungsgemässe Bestimmungsmethode ermöglicht daher eine einfache und direkte Überprüfung von Substanzen bezüglich
ihrer carcinogenen Aktivität. Die verschiedenen Verfahrens-
209844/122 1 öwamAi inspected
stufen können standardisiert v/erden, und die mittels Substanzen mit bekannter careinogener Aktivität erhaltenen Ergebnisse
können als Eichmaßstab verwendet werden, so dass eine Bezugsgrösse vorhanden ist, mittels welcher das Vorhandensein und
die relative "Höhe der carcinogenen Aktivität irgendeines Untersuchungsmaterials
'abgeschätzt werden können. Die erfindungsgemässe Bestimmungsmethode hat daher besonderen Wert für Herstellungsverfahren
der verschiedensten Art, weil sie es dem Hersteller ermöglicht, festzustellen, ob das von ihm zu verarbeitende
Material etwa potentielle carcinomas Eigenschaften
aufweist, und der Hersteller kann dadurch den gesamten Herstellungsprozess aufgrund solcher Untersuchungsergebnisse
überwachen und regeln»
Gemäss einer speziellen Ausführungsform der erfindungsgemässen
Bestimmungsmethode wird ein Membranpräparat verwendet, welches aus einer glatten Oberflächen-Reticularmembran ohne daran gebundene
Ribosomen besteht, wobei aber solche Ribosomen in Gegenwart eines Steroidhormons an das Reticulum gebunden werden0
Für diesen Zweck eignet sich beispielsweise Oestradiol, falls männliche Ribosomen an von männlichen Lebewesen stammende,
glatte Oberflächenmembrane gebunden .werden sollen, während
Testosteron für von weiblichen Lebewesen stammende Gewebe Anwendung findete Oestradiol kann auch durch einen Extrakt von
weiblichen Ribosomen ersetzt werden und anstelle von Testosteron kann ein Extrakt von männlichen Ribosomen Anwendung finden<
>· In beiden Fällen kann das betreffende Hormon auch durch einen Extrakt des rauhen Reticulums ersetzt werden.
20984*/1221
Das glatte endoplasmische Reticulum zeigt eine hohe Rearranga.se-Aktivität,
aber wenn Ribosomen in Anwesenheit eines Steroid-Hormons an das Reticulum angelagert werden, verschwindet diese
enzymatische Aktivität vollständig. Wenn jedoch ein solches glattes Reticulum vor der Behandlung zwecks Anlagerung von
Ribosomen mit einer carcinogenen Substanz behandelt wird, dann lassen sich die Ribosomen nicht an die Membran anlagern und
daher tritt keine Veränderung in der ursprünglichen Rearrangase-Aktivität ein. Die vorstehend beschriebene Methode zur Bestimmung
der Rearrangase-Aktivität kann daher auch in diesem Fall zur Bestimmung der carcinogenen Aktivität der untersuchten
Substanz Anwendung finden.
Die erfindungsgemässe Untersuchungs-Ausstattung zur Durchführung
des vorstehend beschriebenen Bestimmungsverfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass sie die folgenden Reagentien
enthält .:
(a) Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat oder ein diese
Verbindung lieferndes Material
(b) eine Sucrose-MgClpKCl-Tris-Pufferlösung
(c) Protein mit statistischer Verteilung der Disulfid-Bindungen, das durch Einwirkung von Rearrangase in
eine enzymatisch aktive Form umgelagert wird
(d) 2-Mercaptoäthanol oder ein äquivalent wirkendes Thiol
(e) ein Substrat zur Bestimmung dee A'asmasses der enzymatischen
Aktivität des in -uie ak+v-~ ν λ-.τ? -r.gelagerten Pro-
.·.-/ ·■'·■- 209844/122 1
teins gemäss (c).
•Die Untersuchungs-Ausstattung enthält vorzugsweise, auch eine
detaillierte G-ebrauchsanleitung zur Durchführung der folgenden
Massnahmen : .
1) Herstellung einer ersten Lösung durch·Zusatz der zu untersuchenden
Substanz zu Reagenz (a);
2) Zusatz von Reagenz (b) zu dieser Lösung und weiterer Zusatz von isolierten Zellmembranen mit maskierter
Rearrangase-Aktivität;
3) Herstellung einer zweiten Lösung durch Zusatz von Reagenz (c) zu einem Elektrolyt und Einstellung des pH-Werts
mittels einer Base auf· einen vorherbestimmten Wert, sowie
weiterer Zusatz von Reagenz (d) zu dieser Lösung;
4) ' Herstellung einer dritten Lösung durch Zusatz von Reagenz (e) zu einem Elektrolyten;
5) Zusetzen einer Probe der ersten Lösung zu einem vorherbestimmten
Zeitpunkt zu einer Probe der zweiten Lösung;
6) Zusatz einer Probe der Mischung von der vorhergehenden Stufe (5) zu einem vorherbestimmten Zeitpunkt zu einer
Probe der dritten Lösung;
7) Bestimmung und Verfolgung ■ r.. einer Eigens chaf t sand erung
dieser Mischung, welche auf den Grad der Aktivierung des Proteins gemäss (c) durch die Rearrangase anspricht;
inspected 2098U/1221 ·
8) Auswertung des Ausmasses der Degranulierung der rauhen
Microsomal-Membran. ·
Als Protein (c) wird vorzugsweise ungezielt,oxydierte Ribo-,
nuclease und als Substrat (e) wird vorzugsweise Oytidin-2·,5"·-
cyclische Phosphorsäure oder.ein davon abgeleitetes Salz, insbesondere
das Natriumsalz, verwendet= Als Elektrolyt für die Auflösung des Proteins (c) und des Substrats (e) w-ird vorzugsweise
Kaliumchlorid oder eine äquivalent wirkende Verbindung verwendet, und als Base zur Einregelung des pH-Wertes der zweiten
Lösung ist Borax oder eine äquivalent wirkende Verbindung gut geeignet"» Diese Elektrolytsubstanz bzw. die Base sowie
ein Präparat aus isolierten Zellmembranen können gleichfalls als Reagentien in der erfindungsgemässen Untersuchungs-Ausstattung
vorhanden sein»
Die Beispiele erläutern die Erfindung ο
5/ug de D11 der zu untersuchenden Substanz werden zu ^einem
Präparat zugesetzt, welches die rauhe Microsomal-Membran aus
der Leber männlicher Ratten zusammen mit etwa 10 mg Protein/ml in Anwesenheit von 1 mMol WADPH, 50 mMol Tris-Pufferlösung
(Tris ist die Abkürzung von der Verbindung Tris-(hydroxymethyl)
aminomethan), 25 mMol KCl, 5 mMol MgGl2 und 250 mMol Sucrose
enthält. Das die rauhe Microsomal-Membran enthaltende Präparat enthält ausserdem einige Bestandteile von glatter Membran, welche
die microsomale Hydroxylase liefert, die zur Aktivierung
209844/1-221 original inspected
bestimmter carcinogener Substanzen erforderlich ist ο Anschliessend
setzt man 10 Volumenprozent überstehender Flüssigkeit des Microsomäi-Präparates hinzu und bebrütet· dann diese Untersuchuhgsmischung
2 Stunden lang bei 200C und einem pH-Wert von 7»3<
Ausserdem wird eine entsprechend zusammengesetzte Untersuchungsmischung in gleicher Weise bebrütet .welche jedoch kein ITADHi
enthält, um so der Möglichkeit Rechnung zu tragen, dass die' cai?cino.gene Aktivität der zu untersuchenden Substanz durch die
Microsomai-Hydroxylase nicht gefördert sondern zerstört wird»
Anschliessend wird der prozentuale Anteil der insgesamt vornan- "
denen latenten Enzymaktivität, welche freigesetzt worden ist, aufgrund ihrer Wirkung auf ungezielt oxydierte Ribonuelease
bestimmt. ■
Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle I
zusammengefasst. In der Pussnote ist angegeben, falls die z.ü untersuchende Substanz nicht in einer Konzentration von 5/u.g/ml
eingesetzt worden isf bzw ο falle keine NADPH mitverwendet wurde.
209844/1221
Tabelle I
Geprüfte Substanz | Prozent Gesamt- Enzym-Aktivität nach 2 Stunden |
*%,ug / ml | In der Literatur angegebenes carcinogenes Verhalten |
Naphtalin | O. | **)10/Ug / ml, ohne NADPH | Null |
2-Naphthylamin | 0-5 | + | |
Anthracen | 0 | Null | |
2,7-Diaminofluoren . | 15 | + | |
1,2-Benzanthracen | 10 | + | |
1,2-Benzanthrachinon | 15 | + | |
2-Aminochrysen | 15 | + | |
6-Aminochrysen | 0 | Null | |
3-Aminopyren | 17 | 4 | |
5,4-Benzopyren | 40 | 4 | |
Benzo-(b)-chrysen | 0 | Null | |
5 > 4»8,9-Dibenzpyren | 25 | 4- | |
CG14*): | • 15 | 4- | |
Aflatoxin B**^ | 20 | + | |
Beispiel 2
In diesem Beispiel werden die einzelnen Verfahrensschritte mehr im einzelnen erläutert.
209844/1221
ORIGINAL INSPECTED
Bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Messverfahren wird Ribonuclease
verwendet, wel'che auf chemischem Wege reduziert wurde und die dann wieder oxydiert wurde. Da sich bei diesem Oxydationsvorgang
die Disulfid-Brücken nicht wieder in ihren ur-i
sprünglichen Stellungen ausbilden, wird das Enzym durch eine . solche Oxydation inaktiv» Die Reaktivierung.erfolgt'dann durch
das freigesetzte Rearrangase-Enzym in der vorstehend erläuterten V/eise ο Wenn man daher den Anstieg der Menge an aktiver Ribonuclease
verfolgt, so ist dieser Anstieg dem Ausmass der Begranulation proportional„
Der Geschwindigkeitsanstieg, mit dem sich aktive Ribonuclease
bildet, wird bei diesem Messverfahren durch Beobachtung der Veränderungen im pH-Wert verfolgt, der eintritt, weil Ribonuclease
im aktiven Zustand Cytidin-2»,3'-cyclisches Monophosphat
hydrolysiert»
1° Herstellung der reduzierten Ribonuclease ■
50 mg einer Ribonuclease, die viermal umkristallisiert worden war und 40 bis 50 Kunitz-Einheiten je mg entspricht, werden zu
1,3 ml einer 8 m-Harnstofflösung zugesetzt und der pH-Wert wird
unter Verwendung von Methylamin auf.etwa 8,5 eingestellt» Dann setzt man 0,05 ml Mercapto-äthanol hinzu und leitet Stickstoff
in Blasen durch die Lösung.
Das Teströhrchen wird dann abgeschmolzen und 4 bis 5 Stunden
lang bei 30 bis 350C bebrütet» Anschliessend gibt man die Lösung
auf eine lonenaustauschersäule (Sephadex G-25) und eluiert mit
ORiQiNAL INSPEGTEO
209844/1221
0,1 m-Essigsäure» Die einzelnen Fraktionen werden gesammelt ^
und ihre optische Dichte "wird bei 280 m/u bestimmte
Die reduzierte Ribonuclease enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und mittels 0,1 m-Essigsäure bis zu einer optischen,Dichte
von 0,500 bei 280 m/U verdünnt» Diese verdünnte Lösung wird
dann für die weitere Messung verwendet.
2 α Oxydation der reduzierten Ribonuclease
Man lässt die Ribonuclease-Lösungen sich spontan oxydieren. Für diesen Zweck sind'etwa 3 Tage vollständig ausreichend.
3 ο Herstellung vom Membranpräparaten aus Rattenleber
Lösungen : '
a) TKM-Pufferlösung .
TRIS - 50 mMol KCl - 25 mMol MgCl2 - 5 mMol
Einstellen auf pH 7,6 mit HCl
b) 2 m-Sucrose in TKM
c) 0,25 m-Sucrose in TKM
d) 1,35 m-Sucrose in TKM
■ Methode :
5 Ratten werden getötet, ihre Lebern werden entfernt und in kalte TKM-Pufferlösung eingelegt, welche 0,25 molar an Sucrose ist.
Unter Verwendung von Scheren werden die Rattenlebern in kleine
209844/1221
Stückchen zerschnitten. Anschliessend werden die Lebern homogenisiert»
Dieses Homogenat wird dann zentrifugiert (15 000 gs 20 Minuten, 40C). Die überstehende Suspension wird abgetrennt
und das gebildete Pellet wird verworfen.
Die Fraktionierung der Membransuspension erfolgt in einer
Sucrose-Gradientenlösung in Zentrifugenröhrchen von 12 il,
Die Gradientenlösung wird hergestellt, indem man jeweils 2,5 ml
einer 2,0 molaren Sucroselösung in jedes Röhrchen einpipettiert und dann mit 3 ml einer 1,35 m-Sucroselösung überschichtet„
Man füllt jedes Röhrchen mit der Membransuspension auf, wobei man diese sorgfältig über die Gradientenlösung überschichtet
und dabei ein Vermischen der einzelnen Schichten vermeidet. Man zentrifugiert dann diese Röhrchen (120 000 g, 4 Stunden,
40C). Auf diese V/eise wird die Membransuspension in 4 Hauptkomponenten
aufgetrennte Man erhält eine überstehende rotgefärbte Lösung, welche als S II bezeichnet wird».In der Grenzschicht
zwischen der 0,25 m-Sucroselösung und der 1,35 m-Sucroselösung
hat sich die glatte Membran angereichert", während sich die
rauhe Membran an der Grenzschicht zwischen der 1,35 m-Sucrose- und der 2 m-Sucroselösung befindete Ausserdem erhält man ein
Pellet aus Polysomeno Die einzelnen Komponenten werden unter
Verwendung einer Injektionsspritze voneinander getrennt und die die rauhe Membran enthaltende Fraktion wird im Verhältnis von
etwa 1 : 2 unter Verwendung einer TKM-Pufferlösung, welche etwa
0,25 molar an Sucrose ist, verdünnt. Diese Suspension wird anschliessend zentrifugiert (120 000 g, 1 Stunde, 40C) und
das aus der rauhen Membran bestehende Pellet wird in etwa 6 ml
'-. * - 209844/1221 ORtStNAt INSPECTED
einer TKM-Pufferlösung, welche etwa 0,25 molar an Sucrose ist,,
suspendiert.
4. Bestimmung der Ribonuclease im Membranpräparat
Von der in der vorstehenden Weise erhaltenen Membransuspension
werden 2 Proben von etwa jeweils 100 >ul für.die Bestimmung der
Ribonuclease entnommene Zu jeder Probe werden 3 ml einer 0,1 n-Perchlorsäurelösung
zugesetzt, und die Teströhrchen werden 10 Minuten lang in Eis gestellt. Anschliessend werden die Röhrchen
auf einer niedrigtourigen Zentrifuge zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Dann setzt man zu jedem
Teetröhrchen 3,2 ml einer 3n-Kaliumhydroxidlösung hinzu
und bebrütet die Mischung 1 Stunde lang bei 37°C. Nach dem Abkühlen
der Mischung in Eis setzt man zu jedem Röhrchen 0,8 ml einer 2,2 n-Perchlorsäurelösung hinzu und lässt diese Mischung
5 Minuten lang stehen. Die Suspension wird dann zentrifugiert und die .dabei erhaltene überstehende Lösung wird im Verhältnis
1 : 2 mit Wasser verdünnt« Alischiiessend bestimmt man die optische
Dichte dieser Lösung bei 260 nyu.
256/Ug/ml der ursprünglichen Probe entsprechen einer optischen
Dichte von 0,1 .
5. Bestimmung des Proteingehalts der rauhen Membran
Hierfür verwendet man die Methode nach Lowry, welche in einer Verdünnung von 1 : 50 bzw. 1 : 100 an der gemäss Absatz 3)
erhaltenen Membransuspension durchgeführt wird.
ORIGINAL INSPECTED
209844/1221
Für diese Bestimmung sind die folgenden Lösungen erforderlich :
A 2 Prozent Natriumcarbonat in 0,1 n-Natriumhydroxid
B1 1 Prozent Kupfersulfat
B2 2 Prozent Na- oder K- oder KNa-Tartrat ·
B 1 : 1 B1 + B2
C 50 ml A + 1 ml B ·■-.··
D. 1 : 2,5 in Wasser: Folin-Ciocalteu
Zu 5 ml der Lösung C setzt man 0,2 ml der Memb.ransuspension
' hinzu ο Man "bebrütet: dann 15 Minuten lang bei Zimmertemperatur,
setzt weiterhin 0,3 ml der Lösung D hinzu und vermischt1ganz
rasche Nach 30 Minuten wird die optische Dichte bei 750 ni/U
bestimmt. Als Standard kann für diese Methode ein OctenserumAlbumin
verwendet werden=
6 ο Verhältnisse von Ribonuclease zu Protein
Damit ein Membranpräparat als rauh bezeichnet werden kann,
soll das Verhältnis von Ribonuclease zu !Protein im Bereich von 0,14 bis 0,19 liegen. Durch dieses Verhältnis unterscheidet
sich eine rauhe Membran sehr deutlich von einer glatten Membran, bei der das entsprechende Verhältnis einen Wert im Bereich von
0,02 bis 0,03 hat ο ' '
7 ο Bestimmung der carcinogenen Aktivität
Für diese Bestimmungsmethode sind die folgenden Lösungen erforderlich
: .·■■'■·
INSPECTED
209844/1221
*) Cytidin-2*,^-cyclische Phosphorsäure
>
Natriumsalz (abgekürzt CMP) · 10 mg/ml 0,1 m KCl
carcinogene Substanz 1 mg/ml Wasser oder DM?
*) Mercaptoäthanol 10 /Ul in 7 ml Wasser
*) Raite Membrane 10 - 20 mg Protein / ml
0,25 m-Sucrose in TKM
KCl 0,1 m in Wasser
Essigsäure 0,1 m in Wasser
Borax-Lösung 0,05 m in V/asser
*) NADPH ■ 5 mMol in TKM
*) ungezielt oxidierte '.,
Ribonucleases lösung mit einem Wert für
die optische Dichte bei 280 m/U von 0,500 in
0,1 m-Essigsäure
*) In Eis gekühlt
***) DMP = Dimethylformamid
***) DMP = Dimethylformamid
Diese Bestimmungsmethode beruht auf der Veränderung des pH-Werts einer Lösung von cyclischer CMP während der durch Ribonuclease
hervorgerufenen Hydrolyse ο Da jedoch die Veränderung im pH-Wert
nur,etwa einer Grössenordnung von 0,1 bis 0,2 pH-Wert-Einheit
entspricht, muss das pH-Wert-Messgerät mit einem Scalenverbreiterer verbunden werden, damit die Messungen mit dem erforderlichen
Genauigkeitsgrad durchgeführt werden können. Beispielsweise eignet sich zu diesem Zweck ein E.I.L.-pH-Meter
Modell 7030. Dieses Messgerät ist über eine Rückschaltung mit einem Registriergerät mit einem vollen Scalenausschlag für
209B44/1221
10 mV verbundene Alle pH-Wert-Messungen werden in einer mit ;
Wassermantel versehenen Zelle von 5 ml Fassungsvermögen bei einer Temperatur von 350G durchgeführt»
Messmethode · ' ·
a) Unter Verwendung geeigneter Puffersubstanzen wird das
pH-Wert-Messgerät standardisiert.
b) Man stellt die degranulierte zu untersuchende Mischung her<>
Zu 100 /Ul NADPH werden 5 bis 50 zug der zu untersuchenden
carcinogenen Substanz zugesetzt, und dann füllt man mit TKM-Pufferlösung "bis auf 0,3 ml auf« Zu dieser Mischung setzt
man 0,2 ml der Membransuspensiou hinzii und beginnt die Zeitmessung
der Degranulierung»
c) Herstellung der Messlösung. . ' '
Zu 0,65 g ml einer Oj,1 molaren KCl-lösung setzt man iOQ/ul
reoxidierte Ribonuclease hinzu und stellt unter Verwendung von 0,05 molarer Boraxlösung auf einen pH-Wert von 7,0 ein«
Eu dieser Mischung setzt man 50/ul Meroaptoäthanol hinzu und ·
unmittelbar nachdem die Degranulierung eingesetzt hat, wird
eine Probe von 100/Ul entnommen und mit der vorstehend beschriebenen
Mischung vereinigt» Zu diesem Zeitpunfk soll ein zweiter
"Zeitmesser in Gang gesetzt werden» Der pH-Wert der Misqhung
wird ijetzt unter Verwendung von Boraxlösung auf 7»6 eingestellt,
Diese Mischung wird in eine zweite Messzelle überführt und bei
350G bebrütet« ' - ■ . ' '
2 0 9 8 A k / 1 2 2.1 ORlGlNAi INSPECTED
d) Herstellung einer Lösung von cyclischer CMP
Eine Messzelle wird mit 0,9 ml Kaliumchloridlösung beschickt,
und dann setzt man 1OO/U1 cyclische CMP hinzu<
> Während 2 bis 3 Minuten lässt man das Gleichgewicht sich einstellen»
e) Durchführung der eigentlichen Messung
Nachdem die durch Verfahrensmassnahme (c) eingeleitete Reaktiv
ierung der inaktiven Ribonuclease etwa 7 Minuten lang abgelaufen ist, wird eine Probe von 100/ul in die Lösung der cyclischen
CMP- übertragen und das pH-Wert-Messgerät wird auf die verbreiterte pH-Wert-Scala eingestellte Der Ablauf der Hydrolyse der
cyclischen CMP kann nunmehr anhand der Veränderungen im pH-Wert verfolgt werden© Während der Messung soll Stickstoff über die
Oberfläche der Reaktionsmischung geblasen werden, um eine atmosphärische
Verseuchung zu vermeiden und damit zufällige pH-Wertänderungen auszuschaltenο Diese Bestimmung wird in Zeitabständen
von 10 Minuten bis zu einer Gesamtzeit von etwa 40 Minuten wiederholte Der Gradient der Messkurven soll allmählich
ansteigen, da die Konzentration an aktiver Ribonuclease mit der Zeit in dem Ausmass zunimmt, wie die inaktive Form
durch die Rearrangase reaktiviert wird.
Eine Stunde nach Beginn der Massnahmen von Verfahrensstufe . (b)
wird die Verfahrensstufe (c) wiederholt, und der ganze Messvorgang
wird wiederum so vorgenommen, wie es vorstehend unter (e) beschrieben ist β Diesen gesamten Messvorgang wiederholt man
dann nochmals nach etwa 2 Stunden ο
20984 4/1221 original. iMS?«=cr?o
;Die gesamte Messung soll ausserdem in Abwesenheit von NADPH
Wiederholt werden«
Auswertung der Messresultate '
Der Anstieg in der Rearrangase-Konzentratlon, welche: durch den
Degranulierungsvorgang freigesetzt worden ist, wird nach Ablauf einer Stunde, nach Ablauf von 2 Stunden gemessen und mit dem
Blindwert zum Zeitpunkt 0 verglichene Zu den jeweiligen Zeitpunkten ist ausserdem der Anstieg der Konzentration an aktiver
Ribonuclease gemessen worden, indem man eine Berie von pH-Wert-Veränderungen
verfolgt, welche sich aus der Hydrolyse cyclischer CMP mittels aktiver Ribonuclease ergeben.
Daher erhält man zu jedem Zeitpunkt der Degranulierungsbestimmung
T , T.J ufnd Tg eine Reihe von Messkurven (a, b und c) mit
steigendem Gradienten«. Dieser Sachverhalt ist in dem Diagramm
von Figo 1 für einen Zeitpunkt T wiedergegeben.
Es wird dann graphisch die Abhängigkeit der·" Gradienten der Kurven a, b und c gegen die Zeit für jede Probe im Anschluss
an die Bestimmung des Ribonuclease-Wertes aufgetragen. Dieser Sachverhalt i3t in Fig. 2 der Zeichnung wiedergegebene
Beide graphischen Darstellungen werden für den Zeitpunkt T=O, T = 1 Stunde und T = 2 Stunden angefertigt, und im lalle des .
Vorliegens einer carcinogenen Aktivität, d«h. bei positivem
Ausfall der Bestimmung, ergibt sich das Gesamtergebnis aus der
graphischen Darstellung von Fig. 3»
^ -^O ORIGINAL INSPECTED
SchliesBlioh kann man die Gradienten der Kurven A, B und C von
Fig;.. 3 gegen die Zeit für den Zeitpunkt T = O, T = 1 Stunde
und T = 2 Stunden auftragen.
Im Falle eines negativen Ergebnisses der Bestimmungsmethode
hat keine Degranulierung stattgefunden, und daher nimmt die
Menge an Rearrangäse auch nicht' zu. Die Blindwert-Bestimmung der Rearrangäse ergibt daher einen mit der Zeit abnehmenden
Wert (Denaturierungseffekt) und daher ist die Neigung der
Kurve C ".'<'... als die .Neigung der Kurve B und diese wiederum
<^ als die Neigung der Kurve A.
B e i α ρ i :e 1 3
Dieses Beispiel erläutert die Anwendung des erfindungsgemässen Bestimmungsverfahrens an der Substanz Aminopyren.
Aminopyren wird in einer Konzentration von 5/Ug/ml eingesetzt.
Die erste BebrUtungsmischung hat die folgende Zusammensetzung :
0,4 ml eines Microsomal-Membranpräparates (rauhe Membran
\ '. * in einer Konzentration von 10 mg/ml)
0,1 ml einer NADPH-Iösung (5. mMol) / .
5 /ul einer Lösung, welche 0,5 mg/ml Aminopyren in Dimethylformamid
enthält
Alle Lösungen werden in einem Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 der folgenden Zusammensetzung hergestellt :
2098447122!
250 mMol Sucrose
50 mMol TRIS-Base - '
25 »Mol KCl ' ·
5 mMol MgCl2 · '
Von dieser ersten Bebrütungslösung werden jeweils Anteile von
100/Ul zum Zeitpunkt T = 0,' T = 60Minuten und T = 120 Minuten
entnommen und mit einer zweiten Bebrtitungsmischung der folgenden Zusammensetzung vermischt :
0,7 ml 0,1 m KCl
0,10 ml eines ungezielt oxydierten Ribonuclease-Substrats
(500vug/ml in 0,1 m-Essigsäure)
0,05 ml ß-Mercaptoäthanol (2 χ 10 Mol)
Zusatz von ' 0,05 molarer Boratlösung zur Einstellung
eines pH-Wertes von 7,6«, ·
Diese zweite Lösung wird dann "bei 320C gehalten.
Jeweils 100/ul-Proben dieser zweiten Lösung werden zum Zeitpunkt
t = 5 Minuten, 12 Minuten, 20 Minuten,! 28 Minuten und
35 Mrtiuten in 1 ml einer Lösung von Cytidin-2»3'-CVcIiBc]IeS Monophosphat
in 0,1 molarer KCl (1 mg/ml) eingetragen und der pH-Wert dieser Lösung wird 5 Minuten lang unter Verwendung eines
Registriergeräts mit entsprechendem Streifen-Registrierpapier registriert (volle Ablesungsbreite der Skala =0,1 pH-Wert-Einheiten)
O
Die pH-Wert-Änderungen der einzelnen Proben werden zum Zeitpunkt
t = 5 Minuten, 12 Minuten, 20 Minuten, 28 Minuten und
209844/1221
35 Minuten gemessen (vergl# nächstehende Tabelle II), und die '
Geschwindigkeit des Anstiegs der pH-Wertveränderung für Proben der ersten Bebrütungslösung zum Zeitpunkt 0 sowie nach 60 und
120 Minuten wird aus den Rearrangase-Aktivitäten zu diesen , Zeitpunkten berechnet.
- | pH- | *) Wert-Änderung ' |
T = | 60 Min | T = | 120 Min. |
T = | 0 | 0, | 32 | 0, | 36 | |
t = 5 Min. | 0.· | 32 | 0, | 38 | 0, | 48 |
t = 12 « | 0, | 35 | 0, | 48 | 0, | 61 |
t = 20 " | 0, | 38 | 0, | 55 | 0, | 74 |
t = 28 tt | 0, | 42 | 0, | 63 | 0, | 86 |
t = 35 * | 0, | 45 | ||||
Geschwindigkeit des | ||||||
Anstiegs der pH- | ||||||
Wert -Yeränderung | ||||||
(willkürliche Ein | VJl | 8 | ||||
heiten) | 2 | |||||
*) 80 x pH/Min |
Die pH-Wert-Änderungen sind in Fig» 4 gegen die Bebrütungszeit
der zweiten Mischung aufgetragen und ergeben die Rearrangase-Aktivitäten, d.h.«, den Gradienten der einzelnen Kurven.
2098U/1221
Diese Rearrangase-Aktivitäten werden dann gemäss ]?ig. 5
gegen die Bebrütungszeit der ersten BebrütungalöBung aufgetragen, wodurch man das Ablösen der Ribosome von der Membran
verfolgen -kann.
Offensichtlich steigt bei der Substanz Aminopyren- die Rearrangase-Aktivität im Lauf der Zeit an, so dass diese
Verbindung als carcinogen-aktiv eingestuft werden muss.
Claims (1)
- Patentansprüche1. Verfahren zur Bestimmung der carcinogenen Aktivität von Substanzen, dadurch gekennzeichnet , dass man die zu untersuchende Substanz mit isolierten Zellmembranen kontaktiert, welche eine maskierte Rearrangase-Aktivität aufweisen, und dass man nach einem vorher bestimmten Zeitraum die Rearranga3e-Aktivität misst.2. Verfahren nach Anspruch 1,-dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem endoplasmischen Reticulum von Rattenlebern gewonnene- Zellmembran anwendete3ο Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die zu untersuchende Substanz in Anwesenheit von reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat mit der isolierten. Zellmembran kontaktiert und dadurch die in der Microsomal-Membran vorhandene ftydroxylase aktivierte4ο Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Rearrangase-Aktivität aufgrund ihrer Fähigkeit zur Umlagerung von Disulfid-Bindungen in einem Protein mit statistischer Anordnung der Disülfidbindungen bestimmt»5β Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Protein mit statischer Anordnung der Disulfid-Bindungen eine inaktive, ungezielt oxydierte Ribonuclease verwendet und deren Aktivität nach Umlagerung der Disulfid-Bindungen bestimmt»209-8 44/1221 OFHGtNAL inspected6β Verfahren nach Anspruch 4 und 5f dadurch gekennzeichnet, dass man die Aktivität der Ribonuclease aufgrund ihrer Fähigkeit zur Hydrolyse.von Cytidin-21,3'-phosphat .; in ■ Cytidin-3.' -phosphat bestimmt ο . '7ο Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man Standardwerte für- die Rearrangase-Aktivität mittels bekannter carcinogener Substanzen bestimmt und damit das Verhalten carcinogen-verdächtiger Substanzen mittels Standardverfahren vergleicht.8. Untersuchungs-Ausstattung zur Durchführung des Bestimmungs-Verfahrens nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Reag'entien enthält :(a) Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat oder einediese Verbindung lieferndes Material,(b) .Sucrose-MgCl-gKCl-Tris-Pufferlösung(c) Protein mit statistischer Verteilung der Disulfid-Bindungen, welches durch Einwirkung von Rearrangase in eine enzymatisch aktive Form umgelagert wird,(d) 2-Mercaptoäthanol oder ein äquivalent wirkendes Thiol,(e) Substrat zur Bestimmung des Ausmasses der enzymatischen Aktivität des in die aktive Form umgelagerten Proteins gemäss (c)2098U/1221 «.,„„,-ORIGINAL INSPECTED9· Untersuchungs-Ausstattung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine detaillierte Gebrauchsanleitung zur Durchführung der folgenden Massnahmen enthält :1) Herstellung einer ersten Lösung durch Zusatz der zu untersuchenden Substanz zu Reagenz (a);2) Zusatz von Reagenz (b) zu der Lösung nach 1) und wexte-rer Zusatz von isolierten Zellmembranen mit maskierter Rearrangase-Aktivität;3) Herstellung einer zweiten Lösung durch Zusatz von Reagenz (c) zu einem Elektrolyten und Einstellung den pH-Wertes mittels einer Base auf einen vorher bestimmten Wert und weiteren Zusatz von Reagenz (b)j4) Herstellung einer dritten Lösung durch Zusatz von Reagenz (e) zu einem Elektrolyten;5) Zusatz einer Probe der ersten Lösung zu einem vorher bestimmten Zeitpunkt zu einer Probe der zweiten Losung;6) Zusatz einer Probe" der Mischung von Stufe (5) zu einem vorher bestimmten Zeitpunkt zu einer Probe der dritten Lösung}7) Bestimmung und Verfolgung einer Eigenschaftsänderung dieser Mischung, welche auf den Grad der Aktivierung des Proteins gemäss (c) durch die Rearrangase anspricht}8) Auswertung des Ausmassee der Degranulierung der rauhen Microsomal-Membran.209 844 / 122110« Untersuchungs-Ausstättung nach Anspruch 8 und 9» dadurch gekennzeichnet, dass sie ausserdem isolierte Zellmembran-Präparate mit maskierter Rearrangase-Aktivität enthält <rο Untersuchungs-Ausstattung nach Anspruch 8 bis 1O,'dadurch gekennzeichnet, dass sie als Protein (c) ungezielt oxydierte ßibonuclease und als Substrat (e) Cytidin-2·,3•-cyclische Phosphorsäure oder ein davon abgeleitetes Salz enthälto12o Untersuchungs-AvAüC;tattung nach Anspruch 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Elektrolyt Kaliumchlorid oder eine äquivalent wirkende Verbindung und als Base Borax oder eine äquivalent wirkende Verbindung enthält.209844/1221
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