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Verfahren zur Erzeugung einer Vitamin-D-reichen Hefezubereitung Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung einer Vitamin-D-reichen Hefezubereitung.
Es ist vielfach bekannt, die Hefe zur Erzeugung von Vitamin-D-haltigen Zubereitungen
zu ver,-wenden, da sie für diesen Zweck mancherlei Vorteile bietet. Hefe ist ein
relativ ergosterinreiches .Naturprodukt und stellt ein günstiges Ausgangsmaterial
für die Ultraviolettbestrahlung dar. Dabei wird das Ergosterin zum Teil in Vitamin
D2 übergeführt, so daß man auf diese Weise V:itamin-D-haltige Zubereitungen erhält.
Hierüber geben beispielsweise die deutsche Patentschrift 499 524 (1928), die britische
Patentschrift 35-1371 (193o) und, die USA.-Patentscb.rift 2 057 399 (1932)
u. a. Aufschluß. Auch über die Art der Hefebestrahlung selbst sind zahlreiche Verfahren
bekanntgeworden, die, entweder die Bestrahlung von Trockenhefe beispielswe:ise auf
einem laufenden Band bzw. auf Auftragwalzen in geringeir Schichthöhe oder aber von
Hefesuspensionen in dünner Schicht betreffen (vgl. beispielsweise die deutsche Patentschrift
295'o3 [19I5], französische Patentschrift 569 518 [1923] und die kanadische
Patentschrift 339 893 [19321). Ferner zeigte sich, daß im Gegensatz zu Lebertran
und andren öligen Vitamin-D-Präparaten das Vitamin D in bestrahlter Hefe praktisch
unbegrenzt haltbar ist. Außerdem ist durch klinische Untersuchungen erwiesen, da.ß
das Vitamin D in bestrahlter Hefe weitaus besser verträglich ist; es kann in dieser
Form daher in größeren Mengen
verabreicht werden, ohne unerwünschte
Nebenwirkungen toxischer Art zu haben, wie dies bei Anwendung größerer Mengen reiner
Vitamin-D-Präparate der Fall ist. Schließlich hat das Vitamin D in. bestrahlter
Hefe einen erweiterten Wirkungsbereich, indem es gegen Kükenrachitis stärker wirksam
ist als reines, durch Bestrahlung von reinem Ergosterin erhältliches Vitamin D2
(vgl. dazu Scheunert et a1., Vitamine und Hormone, 3, S.37 [194'1).
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Diesen Vorteilen stehen jedoch auch gewisse Nachteile gegenüber. Die
Vitamin-D-haltigen Hefezubereitungen besitzen den typischen, Hefegeschmack, der
besonders bei pharmazeutischen Präparaten unerwünscht ist. Ferner ist bei der üblichen
Hefeverarbeitung keine Gewähr dafür gegeben, daß die Hefezellen tatsächlich tot
sind, daß also keine Nebenwirkungen durch lebende Hefezellen verursacht werden können.
Außerdem ist der Steringehalt der Hefe begrenzt, so. daß die Bestrahlung der normalen
Hefe nicht ohne weiteres ein Produkt mit so hohem Vitamin-D-Gehalt ergibt, wie es
für manche pharmazeutischen Zwecke erwünscht ist. Der Sterin- und damit Vitamin,
D-Gehalt der bestrahlten normalen Hefe ist im allgemeinen nicht ausreichend, um
ihre Vorteile insbe:-sondere hinsichtlich der Haltbarkeit und Verträglichkeit voll
ausnutzen zu können.
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Man hat sich daher bemüht, durch bestimmte Maßnahmen den Gehalt der
Hefe an Ergosterin zu erhöhen, vor allem dadurch, daß man die Hefe in einem stickstoffarmen
oder stickstofffreien Medium zu züchten suchte, so z. B. nach der deutschen Patentschrift
720 007 (r939). Allerdings zeigte die Nachprüfung (vgl. Angew. Chemie, 62, S. 572
[i9501), daß hierbei nicht tatsächlich die absolute Menge an Sterinen erhöht wird,
sondern daß es sich lediglich um eine proportionale Zunahme des Steringehaltes infolge
Veratmung von Zellinhaltsstoffen handelt. Durch diese bekannte Maßnahme werden aber
die andren obenerwähnten, der Hefe anhaftenden Nachteile nicht beseitigt.
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Es wurde nun gefunden, daß man durch eine erfindungsgemäße An-,vendung
verschiedener, sich zu einer mehrstufigen Behandlung ergänzender, verfahrenstechnischer
Maßnahmen zum Ziel gelangen, also die, obenerwähnten Nachteile der Hefe ohne Beeinträchtigung
ihrer Vorteile überwinden kann, so daß die letzteren voll in Erscheinung treten.
Man geht dabei folgendermaßen vor: Der erste Schritt besteht darin, daß man Reservestoffe
der Hefe, die im Sinnes des zu erzielenden Endproduktes lediglich als Ballaststoffe
anzusehen sind, entfernt. Dies gelingt in der Weise, daß man, eine biologische »Verarmung«
der Hefe vornimmt, die entweder oxyb.iontisch,, also durch Veratmung von Zellinhaltss-töffen,
oder ano@xybliontisch, also durch Vergärung von Zellinhaltsstoffen erfolgen kann.
Im ersteren Falle geht man soa vor, d.aß eine w äßrige Hefesuspension ohne Zusatz
von Nährstoffen einer kräftigen Belüftung bei 32 bis 35° unterworfen wird. Hierdurch
werden Reservestoffe der Zelle, wie besonders Glycogen, durch Veratmu.ng zu Kohlensäure
abgebaut und auf diese Weise entfernt. Im zweiten Fall wird die Hefe in breiigem
Zustand einer Selbstgärung bei 35 bis 370 unterworfen. Nacheinigen Stunden ist dieser
Prozeß beendet, und man kann dann zum zweiten Prozeß übergehen.
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Der zweite Schritt besteht in einer Entfernung von Zellinhaltsstoffen
durch Autolyse. Dabei wird die oxydativ verarmte Hefe durch Separieren zunächst
wiedergewonnen und in breiigem oder halbfestem Zustands bei etwa 5o° der Autolyse
überlassen. Im Falle der nichtoxydativ verarmten: Hefe wird lediglich die Temperatur
auf 50° gesteigert. In beiden Fällen verbleibt die Hefe so. lange bei dieser Temperatur,
bis eine völlige Verflüssigung des Ansatzes stattgefunden hat. Die verflüssigte
Masse wird dann separiert und der dabei verbleibende Rückstand gründlich ausgewaschen.
Bei dieser Prozedur geht ein beträchtlicher Teil von Zellinhaltsstoflen, vor allem
Eiweißstoffe und Nucleinsäure, in Lösung, während die vorhandenen Sterine unbeeinträchtigt
bleiben. Der Gehalt an Sterinen im verbleibenden Rückstand ist daher gegenüber dem
Steringehalt der Ausgangshefe beträchtlich erhöht.
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In einer dritten Operation wird sodann. der feuchte Rückstand noch
einer Behandlung mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie
beispielsweise Methanol, unterworfen. Dadurch werden einerseits solche Geschmacksstoffe,
die nicht bereits durch die bisherigen Operationen entfernt worden sind, beseitigt,
und andererseits werden symplexa.rtige Verbindungen zwischen Sterinen und Eiweißstoffen
gelöst, soweit dies nicht bereits. durch die Autolyse bewerkstelligt wurde. Die
Sterine gehen bei dieser Operation nicht in Lösung, sondern verbleiben in dem durch
Separieren wiedergewonnenen. Rückstand. 'Falls die Autolyse im Sinne: des zweiten
Schrittes genügend weit fortgeschritten ist. braucht übrigens nicht erst separiert
zu werden, sondern es kann die Autolysenflüssigkeit unmittelbar mit Methanol usw.
behandelt werden, so@ daß dann die Separierung und Auswaschung der extrahierten
Hefe erst am Schluß erfolgen kann.
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Der durch diese Maßnahmen bedingte Effekt besteht darin, daß der Steringeh.alt
des gewonnenen Extraktionsrückstandes gegenüber der Ausgangshefe beträchtlich erhöht
ist. Wenn der Steringehalt der verwendeten Hefe beispielsweise 0,7 bis 1,2% betrug,
wie dies meistens bei den Backhefen der Fall ist, so besitzt der Rückstand nach
erfolgter Behandlung gemäß der Erfindung einen Steringehalt von etwa 1,5 bis 2°/o.
Wenn die Ausgangshefe o,2 bis 0,4.% Sterin enthält, wie dies in der Regel bei den
Wuchshefen vom Typus der Torula utilis oder Candiida tropicalis der Fall ist, so,
enthält der nach der erfindungsgemäßen Behandlung solcher Hefen anfallende Rückstand
nun etwa o,.4 bis 0,8°/o Sterin. Der Gehalt an Sterinen wird durch die Behandlung
gemäß der Erfindung daher etwa verdoppelt, und das in der geschilderten Weise gewonnene
Produkt stellt somit ein im Sinne des Erfindungsgedankens besonders geeignetes Ausgangsmaterial
dar,
das bei Bestrahlung die Gewinnung einer Hefezubereitung mit einem insbesondere für
pharmazeutische Zwecke ausreichend hohen Vitamin-D-Gehalt gewährleistet.
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Nach beendeter Durchführung der vorbeschriebenen Behandlung wird schließlich,
erfindungsgemäß der unlösliche Heferfickstand entweder in üblicher Weise getrocknet
und bestrahlt oder in Wasser suspendiert und in dieser Form der Bestrahlung unterworfen.
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Man erhält auf' diese Weise ein Produkt, dessen Vitamin D nicht nur,
wie auch in: der bestrahlten Vollhefe, unbegrenzt haltbar ist, sondern das infolge
seines erhöhten Ergosteringehaltes höhere V itamiri-D-Einheiten besitzt als die
unbehandelte und nur bestrahlte Hefe. Darüber hinaus ist aber das Produkt völlig
geschmacklos und enthält keine lebenden Hefezellen mehr.
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Wünscht man aber eine noch weiter gehende Steigerung des Steringehaltes
unter gleichzeitiger Beibehaltung der obengeschilderten Vorteile der bestrahlten
Hefe, so, gewinnt man .erfindungsgemäß aus dem in der beschriebenen Weise erhaltenen
Heferückstand durch Extraktion in an sich bkannter Weise das Hefefett und setzt
dieses vor oder nach der Bestrahlung dem Heferückstand oder der autolysierten Hefe
zu. Es ist zwar bekannt, daß das extrahierte Hefefett bestrahlt werden kann (vgl.
britische Patentschrift 285 083 [19z8] oder ungarische Patentschrift ioo
696 119271); die daraus hergestellten Präparate haben aber den Nachteil aller öligen
Vitamin-D-Präparate, d. h., sie sind wenig haltbar und verursachen bei der Verabfolgung
an ernährungsgestörte Patienten unerwünschte Nebenwirkungen. Dagegen kann man durch
Beimengung von Hefefett zu Hefe oder einer Hefezubereitung einen besonderen Effekt
erzielen, der nicht ohne weiteres vorauszusehen wa:r und der über den. Effekt hinausgeht,
der bei einer Applizierung von. bestrahltem Hefefett neben bestrahlter oder unbestrahlter
Hefe erreichbar ist.
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Man geht dabei vorteilhafterweise von einer Hefe oder Hefezubereitung
aus, die bereits einen: hohen Steringehalt besitzt, und setzt den durch Extraktion
gewonnenen fettlöslichen Anteil einer gleichartigen Hefe zu und unterwirft das so
vorbereitete Produkt der Ultraviolettbestrahlung. Man kann aber auch umgekehrt vorgehen
und das extrahierte Hefefett zuerst bestrahlen und sodann der bestrahlten oder unbestrahlten
Hefe oder Hefezubereitung zusetzen., wobei gegebenenfalls die Mischung einer nochmaligen
Bestrahlung unterzogen werden kann. In beiden Fällen trifft die nicht vorherzusehende
Wirkung ein, daß die günstigen Eigenschaften von Hefebestandteilen, gleichgültig,
ob dieselben den wasserlöslichen oder fettlöslichen Fraktionen oder den unlöslichen
Anteilen anhaften mögen, in der Weise genutzt werden, daß man ein Produkt mit den
oben angeführten wünschenswerten Eigenschaften., insbesondere hinsichtlich der Haltbarkeit
und Verträglichkeit, erhält, und das daher die Applizierung hoher Vitamin-D-Mengen
ohne schädigende Nebenwirkungen ermöglicht. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen
Verfahrens besteht darin, daß als Ausgangsmaterial die bei der Hef@aextra.ktherstellung
als Abfallprodukte anfallenden Rückstände verwendet und. damit einer nutzbringenden
Verwertung zugeführt werden können.
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Ausführungsbeispiel i q. kg Frischhefe (entsprechend etwa i
kg Trockenhefe) mit einem Ergosteringehalt von 0,8% (in der Trockensubstanz)
werden in io 1 Phosphatpuffer vom p$ 5,2 suspendiert und bei 32° einige Stunden
mit 5 bis 61 Luft pro, Minute belüftet. Sodann wird die Hefe separiert, auf einen
Trockensubstanzgehalt von :2o bis 25 % abgepreßt und bei 50° etwa: 20 bis 24 Stunden
der Autolyse überlassen. Sodann wird wieder separiert, der feste Anteil gründlich
ausgewaschen und in feuchtem Zustand mit der gleichen Menge Methanol 1/2 Stunde
unter Rückflußkühlung gekocht. Dann wird der Heferückstand abgepreßt und ausgewaschen.
Man erhält 350 g extrahierten Heferückstand (berechnet als Trockensubstanz)
rnit einem Ergosteringehalt von 2% (in der Trockensubstanz). Schließlich wird der
Heferückstand entweder getrocknet und bestrahlt oder in Wasser suspendiert und dann
bestrahlt. Man erhält schließlich, je nach der Bestrahlungsmethode, ein Produkt,
das 2o ooo bis 6o ooo Internationale Vitamin-D-Einheiten pro. g enthält.
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Ausführungsbeispiel 2 io kg Frischhefe mit einem Trockensubstanzgehalt
von 18% und einem Steringehalt von. 0,q.0/0 (in der Trockensubstanz) werden in ein
passendes Gefäß eingestampft und auf 37° erwärmt. Alsbald setzt die Selbstgärung
ein. Sobald dieselbe nachzulassen beginnt, steigert man die Temperatur auf 5o° und
hält etwa: 2o Stunden bei dieser Temperatur, wobei völlige Verflüssigung der Masse
durch Autolyse stattfindet. Man separiert dann und wäscht den Heferückstand gründlich
aus. Diesen versetzt man sodann mit der gleichen Menge Methanol und kocht 1/2 Stunde
unter Rückflußkühlung. Nach dem Abpressen und Auswaschen erhält man 700 g
(berechnet als Trockensubstanz) mit einem Ergosteringehalt von 0,9% (in der Trockensubstanz).
Nach dem Bestrahlen dieses Produktes erhält man schließlich ein Präparat, das 2o
ooo bis 40 000 Internationale Einheiten, an Vitamin. D je g enthält.
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Ausführungsbeispiel 3 5 kg Frischhefe mit einem Trockensubstanzgehalt
von 20% und einem Steringehalt von o,80/0 (in der Trockensubstanz) werden ebenso
wie im Beispiel i verarbeitet, wobei man 350 g einer sterinredchen Hefefraktion
erhält. aoo g dieses Produktes werden in üblicher Weise mit Benzol extrahiert, wodurch
man nach denn Entfernen des Lösungsmittels io g Hefefett erhält. Man nimmt dieses
in Äthanol auf und versetzt damit die im Wasser suspendierten restlichen. 15o g
der erwähnten Hefefraktion unter gründlichem Rühren, so daß eine. möglichst feine
Verteilung erreicht wird. Die so erhaltene, Mischung enthält nun fast 7% Sterin
in der Trockensubstanz.
Nach dem Bestrahlen dieses Anteiles erhält
man je nach der Bestrahlungsdauer ein Produkt, das r5o ooo bis Zoo ooo Internationale
Einheiten an Vitamin D pro g besitzt.
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Ausführungsbeispiel 4 Aus Zoo bis 3oo Teilen einer sterinreichen Hefe
oder Hefezubereitung gewinnt man durch Extraktion das sterinhaltige Hefefett. Man
bestrahlt dieses in üblicher Weise nach dem Aufnehmen in einem Lösungsmittel und
löst dann das Bestrahlungsprodukt in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel,
wie beispielsweise Äthylalkohol. Sodann bereitet man einAutolysat aus roo Teilen
einer sterinreichen Hefe und bestrahlt dieses Autolysat. Sodann wird dieses mit
der Lösung des bestrahlten Hefefettes unter gründlichem Rühren versetzt, so daß
eine möglichst feine Verteilung des Vitamin D erzielt wird. Schließlich wird die
Mischung getrocknet. Man erhält so ein Produkt, dessen Vitamin-D-Gehalt auf über
Zoo ooo Internationale Einheiten gesteigert werden kann und das trotzdem noch alle
Vorteile, hinsichtlich Haltbarkeit, Verträgl.ichkeit und Wirksamkeit in sich vereinigt.