DE2558536C3 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kinetischen Bestimmung von Enzymsubstraten mittels gekoppelter Reaktionen.

Die gebräuchlichste Methode der enzymatischen Substratbestimmung ist die sogenannte Endwertmetho­ de. Hierbei wird das zu bestimmende Substrat einer enzymatischen Reaktion gemessen, in dem die Reaktion bis zum Stillstand ablaufen gelassen wird, also das gesamte Substrat umgesetzt wird. Bei zahlreichen gebräuchlichen Endwert-Methoden für die Substratbe­ stimmung, insbesondere auch an Analysenautomaten, liegt der Zeitbedarf pro Analyse gegenwärtig bei 10 bis 20 min. Dieser Zustand ist unbefriedigend, weil der Zeitbedarf zu hoch ist und die optimale Ausnutzung der Meßgeräte und Analysenautomaten verhindert wird.

Es ist bekannt, daß durch Anwendung des kinetischen Verfahrens, bei dem die Substrat-Konzentration durch Messung der Geschwindigkeit der Bestimmungsreak­ tion ermittelt wird, eine drastische Verringerung der üblichen Analysenzeit erzielt werden kann. Dazu trägt nicht zuletzt auch der Umstand bei, daß bei diesem Verfahren im Gegensatz zur Endwert-Methode die Ermittlung von Probenleerwerten i. allg. entfällt.

Die theoretischen Grundlagen der kinetischen Sub­ stratbestimmung wurden ausführlich in Anal. Chem. 43,697 und Advan. Anal. Chem. Instrum. 7, 141 behandelt. Daraus ist es bekannt, daß von besonderer Bedeutung Reaktionen erster oder pseudoerster Ord­ nung sind, da sich diese im Analysenautomaten meßtechnisch besonders einfach nach dem sogenannten "fixed-time"-Prinzip verfolgen lassen.

Bei den "fixed-time"-Verfahren mißt man die Konzentrationsänderung der zu bestimmenden Sub­ stanz oder eines Folgeprodukts innerhalb eines festen Zeitintervalls. Läuft die Bestimmungsreaktion im gewählten Zeitabschnitt nach erster oder pseudoerster Ordnung ab, dann gilt die Beziehung:

Hier bezeichnet k die Geschwindigkeitskonstante der Reaktion, c₀ die Anfangskonzentration der zu bestim­ menden Substanz und Δc die Konzentrationsänderung derselben im Meßzeitintervall Δt=t₂-t₁. Der Glei­ chung ist zu entnehmen, daß die gemessene Konzentra­ tionsänderung der gesuchten Anfangskonzentration direkt proportional ist, wenn k, t₁ und t₂ konstant gehalten werden. Letztere Bedingungen lassen sich an Analysenautomaten leicht einhalten, weshalb dieses Verfahren an derartigen Geräten besonders vorteilhaft eingesetzt werden kann.

In den oben zitierten Veröffentlichungen und in anderen Arbeiten, die sich bisher mit der kinetischen Substrat-Bestimmung befaßten, wird in erster Linie die Anwendbarkeit des Verfahrens auf einstufige Reaktio­ nen diskutiert. Derartige Reaktionen sind jedoch nur von begrenzter Bedeutung. Es ist nämlich häufig erforderlich, die Testsysteme im Interesse einer ausreichenden Spezifität und Praktikabilität aus mehre­ ren Teilreaktionen zusammenzusetzen. Andererseits ist nicht bekannt, wie derartige gekoppelte Testsysteme so aufzubauen sind, so daß man mit ihnen unter Routinebedingungen Substrat-Konzentrationen auf ki­ netischer Basis bestimmen kann. Ganz im Gegenteil wird noch in jüngster Zeit darauf hingewiesen, daß gekoppelte Reaktionen kinetische Bestimmungen pro­ blematisch machen (Chem. Rundschau, 26, 24 [1973]), da beispielsweise ein Aktivitätsverlust von beteiligten Enzymen das Verfahren rasch unbrauchbar macht. Daher war man bisher der Ansicht, daß ein einstufiges Verfahren gerade bei enzymkinetischen Substratmes­ sungen dem zweistufigen (und dementsprechend über­ haupt mehrstufigen) vorzuziehen sei. Dies erklärt, warum bisher gekoppelte Testsysteme, mit denen man unter Routinebedingungen Substratkonzentrationen kinetisch bestimmen kann, sich nicht in der Praxis bewährt haben.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung von Substratkonzentratio­ nen mittels gekoppelter Reaktion auf kinetischer Basis zu schaffen, welches sich unter Routinebedingungen durchführen läßt und bei dem die Teilschritte der mehrstufigen Testsysteme ganz oder teilweise unter Enzymkatalyse ablaufen.

Gelöst wird diese Aufgabe er­ findungsgemäß durch ein Verfah­ ren nach Patentanspruch 1.

Erfindungsgemäß ist es möglich, die schnellsten Reaktionen der Reaktionskette so weit zurückzudrän­ gen, daß lediglich die spezifischste Reaktion die langsamste Reaktion und damit geschwindigkeitsbe­ stimmend wird, so daß in einem beliebig kurzen vorgegebenen Zeitintervall gemessen werden kann. Das Verfahren unterscheidet sich damit grundsätzlich von den auf prinzipiell gleichen Reaktionsabläufen aufbau­ enden Endwertmethoden, wie sie beispielsweise aus H. U. Bergmeyer, Methoden der Enzymatischen Analyse, 2. Auflage, Band II, Seite 1172/1173 und 1741 (1970) bekannt sind. Bei diesen Verfahren wurden die Parameter so eingestellt, daß man möglichst schnelle Reaktionsabläufe erhält, da man den Endwert der langsamsten Reaktion abzuwarten hatte.

Unter gekoppelten Reaktionen wird hier eine Folge von mindestens zwei Teilreaktionen verstanden, von denen wenigstens eine enzymatisch katalysiert wird und bei denen die Umsetzung des Substrates und die eigentliche Meßreaktion (Indikatorreaktion) in ver­ schiedenen Reaktionsschritten ablaufen.

Zu den Möglichkeiten, die spezifischste Teilreaktion so zu gestalten, daß sie geschwindigkeitsbestimmend ist und nach pseudoerster Ordnung abläuft, gehören geeignete Auswahl der Art der eingesetzten Enzyme, künstliche Veränderung der Michaelis-Konstante eines oder mehrerer der eingesetzten Enzyme, Änderungen des Substrats, geeignete Auswahl der Konzentrationen der beteiligten Enzyme und Reagentien, der Tempera­ tur, des pH-Wertes, Einsatz von Cofaktoren, Beschleu­ nigern und Hemmstoffen.

Die weniger spezifische Teilreak­ tion bzw. die weniger spezifischen Teilreaktionen werden durch eine Überdosierung der in diesen Teil­ reaktionen wirksamen Enzyme be­ schleunigt. Dies hat den zusätz­ lichen Vorteil, daß eine Aktivitätsänderung dieser Enzyme durch Lagerungsein­ flüsse kompensiert wird. Beim Enzym der spezifischsten Teilreaktion dagegen spielt eine Aktivitätsabnahme keine wesentliche Rolle, da die Michaelis-Konstante hierdurch ja nicht beeinflußt wird. Natürlich muß aber verhindert werden, daß die Aktivität dieses Enzyms völlig verloren geht, wozu die üblichen Methoden der Enzymstabilisierung angewandt werden können, die dem Fachmann bekannt sind.

Unter einer Überdosierung wird hier der Einsatz einer wenigstens doppelt so großen Enzymmenge, vorzugsweise einer vielfach größeren Enzymmenge, als sie an sich für den raschen Ablauf der Reaktion erforderlich wäre, verstanden. Durch entsprechende Mengen der für die Teilschritte eingesetzten Enzyme lassen sich ja, wie oben erwähnt, die Geschwindigkeiten der einzelnen Teilreaktionen erheblich variieren, so daß auf relativ einfache Weise diejenige Reaktion geschwin­ digkeitsbestimmend gemacht werden kann, welche den spezifischsten Verlauf zeigt.

Die Art der eingesetzten Enzyme kann verändert werden, indem man ein Enzym ganz bestimmter Herkunft, je nach der gewünschten Michaelis-Konstan­ te, auswählt. Denn Enzyme verschiedener Herkunft, welche die gleiche Reaktion katalysieren, können unterschiedliche Michaelis-Konstanten haben, je nach­ dem ob sie z.B. aus Mikroorganismen oder aus Säugetierleber gewonnen werden.

Eine künstliche Veränderung der Michaelis-Konstan­ te läßt sich z.B. erreichen durch Änderung des Metallatoms im aktiven Zentrum des Enzyms. Eine andere Möglichkeit besteht in der partiellen Spaltung des Enzyms, entweder durch Dissoziation in seine Untereinheiten, wenn das Enzym aus solchen besteht, oder durch proteolytische Abspaltung eines Teils der Peptid-Kette. Eine weitere Möglichkeit besteht in der chemischen Modifizierung des aktiven Zentrums. Diese kann z.B. erfolgen durch Veränderung einzelner reaktiver Gruppen von Aminosäuren des Zentrums wie der Oxydation einer SH-Gruppe oder dergleichen. Weitere Möglichkeiten zur künstlichen Änderung der Michaelis-Konstante bestehen in einer Konformations­ änderung des Enzyms durch Zusatz eines allosterischen Effektors, durch Zusatz bestimmter Ionen, durch geeignete Auswahl der Art des Puffers, durch Einstellung bestimmter Salzkonzentrationen in der Lösung und dergleichen.

Eine Änderung des Substrats selbst kann erfolgen durch Komplexierung bei Zusatz geeigneter Komplex­ bilder, durch Mizellbildung, beispielsweise durch Deter­ genszusatz oder dergleichen.

Auch mit dem pH-Wert läßt sich eine Beeinflussung der Reaktionsgeschwindigkeiten im erfindungsgemä­ ßen Sinne bewirken. So kann das Enzym derjenigen Teilreaktion, die geschwindigkeitsbestimmend gemacht werden soll, unter einem nicht optimalen pH-Wert, der zu einer Erhöhung der Michaelis-Konstante dieses Enzyms führt, eingesetzt werden. In gleicher Weise läßt sich auch die Temperaturabhängigkeit von Enzymen ausnutzen, obwohl dies nicht bevorzugt wird, da die allgemeine Bestrebung dahingeht, die Temperaturen enzymatischer Bestimmungsreaktionen zu vereinheitli­ chen.

Weitere Mittel zur Beeinflussung der Geschwindig­ keit der Teilreaktionen im erfindungsgemäßen Verfah­ ren sind der Zusatz von Reaktionsteilnehmern und Reaktionsprodukten, welche die Michaelis-Konstante eines Enzyms echt oder scheinbar verändern. Im gleichen Sinne können auch Inhibitoren verwendet werden. Letzteres ist beispielsweise aus der DE-OS 23 49 819.3, bekannt. Schließlich läßt sich die Geschwin­ digkeit einer nichtenzymatischen Teilreaktion durch Zusatz eines Katalysators oder eines Hemmstoffes beeinflussen.

Unter der spezifischsten Teilreaktion der Reaktions­ kette wird diejenige Teilreaktion verstanden, welche die größte Spezifität hinsichtlich der Ausgangssubstanz der Reaktion zeigt und außerdem durch entsprechende Auswahl der Reaktionsparameter geschwindigkeitsbe­ stimmend gestaltet werden kann. Diese Teilreaktion kann enzymatisch katalysiert sein, sie muß es aber nicht.

Ein weiteres wesentliches Merkmal der Erfindung besteht darin, daß der geschwindigkeitsbestimmende Schritt so gestaltet werden muß, daß der nach erster oder pseudoerster Ordnung abläuft. Wenn die spezifischste Teilreaktion, die geschwindigkeitsbestimmend gestaltet wird, ohnehin nach erster Ordnung abläuft, so sind besondere Maßnahmen in dieser Hinsicht nicht erforderlich. Anders bei Reaktionen zweiter und höherer Ordnung. Hier muß eine pseudoerste Ordnung herbeigeführt werden. Dies läßt sich dadurch erreichen, daß die Konzentration des zweiten oder weiteren Reaktionspartners, der nicht das zu bestimmende Substrat oder ein Folgeprodukt desselben ist, durch entsprechende Dosierung während der Reaktion praktisch konstant gehalten, also im Überschuß eingesetzt wird. Außerdem muß, wenn es sich um eine enzymatische Reaktion handelt, die Michaelis-Konstan­ te so hoch gewählt werden, daß die groß ist gegenüber der Obergrenze der in Betracht kommenden Substrat­ konzentration im Test.

Die Erfindung ermöglicht es, enzymkinetische Sub­ stratmessungen in gekoppelten Testsystemen durchzu­ führen und damit die zur Durchführung derartiger Bestimmungen erforderliche Zeit erheblich zu verrin­ gern. Gleichzeitig wird dadurch weitgehende Unabhän­ gigkeit von der Aktivität der beteiligten Enzyme erreicht, so daß Präzision des Verfahrens auch dann voll gegeben ist, wenn durch Lagerung schon ein wesentlicher Aktivitätsverlust bei den beteiligten Enzymen aufgetreten ist. Weiter ermöglicht es die Erfindung, derartige mehrstufige enzymkinetische Sub­ stratmessungen auf allen gängigen Analysenautomaten durchzuführen, wobei es anhand der Lehren der Erfindung ohne Schwierigkeiten möglich ist, die quantitative Zusammensetzung der Reagentien jedem beliebigen Analysenautomaten anzupassen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1 Triglyceridbestimmung

Die Triglyceride werden enzymatisch zu Glycerin und Fettsäuren gespalten.

Die Bestimmung des Glycerins erfolgt gemäß den folgenden gekoppelten Reaktionen:

Das Verfahren wird kinetisch mit folgenden Reagen­ tien durchgeführt:

Reagens 1:
45-55 mmol/l Phosphatpuffer pH 7,0
4,6-3,1 mmol/l Magnesiumsulfat
300-400 µmol/l Natriumdodecylsulfat
2,3-3,5 mmol/l ATP
280-420 µmol/l Phosphoenolpyruvat
120-230 µmol/l NADH;
7,7×10⁴ U/l oder mehr Lipase
5,8×10² U/l oder mehr Esterase
9,6×10² U/l oder mehr Pyruvatkinase
5,3×10³ U/l oder mehr Lactadehydrogenase

Reagens 2:
2,9×10³ U/l oder mehr Glycerokinase.

Die Reaktion wird am centrifugal fast analyzer bei 340 nm und 25°C gemessen. Durch Erhöhung der ATP-Konzentration im Test wird die Michaelis-Kon­ stante der Pyruvat-Kinase scheinbar so weit erhöht, daß sie groß ist gegenüber der Glycerin-Obergrenze im Test. Die anderen Enzyme werden überdosiert. Dadurch wird die Pyruvat-Kinasereaktion geschwindigkeitsbe­ stimmend und die Glycerin-Konzentration kann aus der Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt werden.

Zur Durchführung der Bestimmung wurden 10 µl der zu untersuchenden Serumprobe mit 30-50 µl physiolo­ gischer Kochsalzlösung und 500-600 µl des Reagens, welches die Glycerokinase noch nicht enthielt, gemischt und 10 min. stehen gelassen. Dann wurde die Glyceroki­ nase zugesetzt und nach 50 sec. die erste, nach 150-200 sec. die zweite Ablesung durchgeführt.

Die Methode erfaßt einen Konzentrationsbereich von 500-9000 mg Triglycerid pro Liter.

Regressionsgleichung y=0,99x+0,51
Korrelationskoeffizient r=0,999.

Beispiel 2 Bestimmung von Glycerin

Das Verfahren wird kinetisch mit folgenden Reagen­ tien durchgeführt:

Reagens 1:
45-55 mmol/l Phosphatpuffer pH 7,0
4,6-3,1 mmol/l Magnesiumsulfat
300-400 µmol/l Natriumdodecylsulfat
2,3-3,5 mmol/l ATP
280-420 µmol/l Phosphoenolpyruvat
120-230 µmol/l NADH
9,6×10² U/l oder mehr Pyruvatkinase
5,3×10³ U/l oder mehr Lactatdehydrogenase

Reagens 2:
2,9×10³ U/l oder mehr Glycerokinase.

Die Reaktion wird am centrifugal fast analyzer bei 340 nm und 25°C gemessen.

Durch Erhöhung der ATP-Konzentration im Test wird die Michaelis-Konstante der Pyruvatkinase schein­ bar so weit erhöht, daß sie groß genug ist gegenüber der Glycerinobergrenze im Test. Die anderen Enzyme werden überdosiert. Dadurch wird die Pyruvatkinase- Reaktion geschwindigkeitsbestimmend und die Glyce­ rin-Konzentration kann aus der Reaktionsgeschwindig­ keit bestimmt werden.

Zur Durchführung der Bestimmung werden 10 µl der zu untersuchenden Serumprobe mit 30 bis 50 µl physiologischer Kochsalzlösung und 500 bis 600 µl des Reagens, welches die Glycerokinase noch nicht enthielt, gemischt. Dann wurde die Glycerokinase zugesetzt und nach 50 Sekunden die erste, nach 150 bis 200 Sekunden die zweite Ablesung durchgeführt.

Die Methode erfaßt einen Konzentrationsbereich von 50 bis 900 mg Glycerin pro Liter.

Claims (6)

1. Verfahren zur Bestimmung von Enzymsubstraten mit­ tels gekoppelter Reaktionen, ausgenommen die Be­ stimmung von Glucose mit Glucose-Oxidase und Peroxidase, dadurch gekennzeichnet, daß die Reak­ tionsparameter so gewählt werden, daß die spezi­ fischste Teilreaktion der Reaktionskette geschwindigkeitsbestimmend für die ganze Reak­ tionskette wird und die geschwindigkeitsbestimmende Teilreaktion nach erster oder pseudoerster Ordnung abläuft und die Bestimmung kinetisch durch Messung einer Veränderung in einem vorgegebenen Zeitinter­ vall durchgeführt wird, wobei die weniger spezifi­ sche Teilreaktion bzw. die weniger spezifischen Teilreaktionen durch eine Überdosierung der in diesen Teilreaktionen wirksamen Enzyme beschleunigt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die spezi­ fischste Teilreaktion durch geeignete Auswahl der Art des eingesetzten Enzyms, je nach seiner Michaelis-Konstante, durch künstliche Veränderung der Michaelis-Konstante oder durch künstliche Ver­ änderung des Substrates, so gestaltet wird, daß sie geschwindigkeitsbestimmend ist und nach pseudoer­ ster Ordnung abläuft.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die künstliche Veränderung der Michaelis-Konstante durch Änderung des Metallatoms im aktiven Zentrum, durch partielle Spaltung des Enzyms, durch chemische Modifizierung des aktiven Zentrums oder/und durch Konformations­ änderung erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Ver­ änderung des Substrates durch Komplexierung oder Mizellbildung vorgenommen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zum Her­ stellen eines Reaktionsablaufs nach pseudoerster Ordnung der zweite und weitere Reaktionspartner, der nicht das zu bestimmende Substrat oder ein Folgeprodukt desselben ist, im Überschuß zugegeben wird.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine scheinbare Erhöhung der Michaelis-Konstante durch Zusatz eines Reaktions-Nebenprodukts oder durch Inhibitorzugabe vorgenommen wird.