DE2558536A1 - Verfahren zur kinetischen substratbestimmung und reagens zu seiner durchfuehrung - Google Patents

Verfahren zur kinetischen substratbestimmung und reagens zu seiner durchfuehrung

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DE2558536A1 DE19752558536 DE2558536A DE2558536A1 DE 2558536 A1 DE2558536 A1 DE 2558536A1 DE 19752558536 DE19752558536 DE 19752558536 DE 2558536 A DE2558536 A DE 2558536A DE 2558536 A1 DE2558536 A1 DE 2558536A1
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Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. F.Veickmann,
Dipl.-Ing. H.¥iickmann, Bipl.-Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
8 MÜNCHEN 86, DEN POSTFACH 860 820
MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 48 39 21/22 JJAX (983921/22)
BOEHRINGER MANNHEIM GMBH.
6 8 Mannheim, Sandhofer Straße 112-132
Verfahren zur kinetischen Substratbestimnung und Reagens zu seiner Durchführung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kinetischen Bestimmung von Enzymsubstraten mittels gekoppelter Reaktionen und ein zur Durchführung dieses Verfahrens geeignetes Reagens.
Die gebräuchlichste Methode der enzymatischen Substratbestimmung ist die sogenannte Endwertmethode. Hierbei wird das zu bestimmende Substrat einer enzymatischen Reaktion gemessen, indem die Reaktion bis zum Stillstand ablaufen gelassen wird, also das gesamte Substrat umgesetzt wird. Bei zahlreichen gebräuchlichen Fndwert-Methoden für die Substratbestimmung, insbesondere auch an AnaIysenautomaten, liegt der Zeitbedarf pro Analyse gegenwärtig bei 10 bis 20 min. Dieser Zustand ist unbefriedigend, weil der Zeitbedarf zu hoch ist und die optimale Ausnutzung der Meßgeräte und Analysenautomaten verhindert wird.
Es ist bekannt, daß durch Anwendung des kinetischen Verfahrens, bei dem die Substrat-Konzentration durch Messung der Geschwindigkeit der Bestimmungsreaktion ermittelt wird, eine drastische Verringerung der üblichen Analysenzeit erzielt werden kann. Dazu trägt nicht zuletzt auch der Umstand bei, daß bei diesem Verfahren im Gegensatz zur Endwert-Methode die Ermittlung von Probenleerwerten i. allg. entfällt.
Die theoretischen Grundlagen der kinetischen Substratbestimmung wurden ausführlich in Anal. Chem. 43,697 und Advan.Anal. Chem. Instrum. 7, 141 behandelt. Daraus ist es bekannt, daß von besonderer Bedeutung Reaktionen erster oder
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S-
pseudoerster Ordnung sind, da sich diese im Analysenautomaten messtechnisch besonders einfach nach dem sogenannten "fixed-time"-Prinzip verfolgen lassen.
Bei den "fixed-time"-Verfahren mißt man die Konzentrations änderung der zu bestimmenden Substanz oder eines Folgeprodukts innerhalb eines festen Zeitintervalls. Läuft die Bestimmungsreaktion im gewählten Zeitabschnitt nach erster oder pseudoerster Ordnung ab, dann gilt die Beziehung:
"ο"
e'kt1 - e"kt2
Hier bezeichnet k die Geschwindigkeitskonstante der Reaktion, c die Anfangskonzentration der zu bestimmenden Substanz undAc die Konzentrationsänderung derselben im MeßzeitintervallAt = t„ - t-i. Der Gleichung ist zu entnehmen, daß die gemessene Konzentrationsänderung der gesuchten Anfangskonzentration direkt proportional ist, wenn k, t.. und t2 konstant gehalten werden. Letztere Bedingungen lassen sich an Analysenautomaten leicht einhalten, weshalb dieses Verfahren an derartigen Geräten besonders vorteilhaft eingesetzt werden kann.
In den oben zitierten Veröffentlichungen und in anderen Arbeiten, die sich bisher mit der kinetischen Substrat-Bestimmung befaßten, wird in erster Linie die Anwendbarkeit des Verfahrens auf einstufige Reaktionen diskutiert. Derartige Reaktionen sind jedoch nur von begrenzter Bedeutung. Es ist nämlich häufig erforderlich, die Testsysteme im Interesse einer ausreichenden Spezifität und Praktikabilität aus mehreren Teilreaktionen zusammenzusetzen. Andererseits ist nicht bekannt, wie derartige gekoppelte Testsysteme so aufzubauen sind, so daß man mit ihnen unter Routinebedingungen Substrat-Konzentrationen
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auf kinetischer Basis bestimmen kann. Ganz im Gegenteil wird noch in jüngster Zeit darauf hingewiesen, daß gekoppelte Reaktionen kinetische Bestimmungen problematisch machen (Chem. Rundschau, 26, 24 (1973)), da beispielsweise ein Aktivitätsverlust von beteiligten Enzymen das Verfahren rasch unbrauchbar macht. Daher war man bisher der Ansicht, daß ein einstufiges Verfahren gerade bei enzymkinetischen Substratmessungen dem zweistufigen (und dementsprechend überhaupt mehrstufigen) vorzuziehen sei. Dies erklärt, warum bisher gekoppelte Testsysteme mit denen man unter Routinebedingungen Substratkonzentrationen kinetisch bestimmen kann, sich nicht in der Praxis bewährt haben.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung von Substrat-Konzentrationen mittels gekoppelter Reaktionen auf kinetischer Basis zu beschaffen, welches sich unter Routinebedingungen durchführen läßt und bei dem die Teilschritte der mehrstufigen Testsysteme ganz oder teilweise unter Enzymkatalyse ablaufen.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur kinetischen Bestimmung von Enzymsubstrateh mittels gekoppelter Reaktionen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Reaktionsparameter so gewählt werden, daß die spezifischste Teilreaktion der Reaktionskette geschwindigkeitsbestimmend für die ganze Reaktionskette wird und der geschwindigkeitsbestimmende Schritt nach erster oder pseudoerster Ordnung abläuft.
Unter gekoppelten Reaktionen wird hier eine Folge von mindestens zwei Teilreaktionen verstanden, von denen wenigstens eine enzymatisch katalysiert wird und bei denen die Umsetzung des Substrates und die eigentliche Meßreaktion (Indikatorreaktion) in verschiedenen Reaktionsschritten ablaufen.
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Zu den Möglichkeiten, die spezifischste Teilreaktion so zu gestalten, daß sie geschwindigkeitsbestinimend ist und nach pseudoerster Ordnung abläuft, gehören qeeignete Auswahl der Art der eingesetzten Enzyme, künstliche Veränderung der Michaelis-Konstante eines oder mehrerer der eingesetzten Enzyme, Änderungen des Substrats, geeignete Auswahl der Konzentrationen der beteiligten Enzyme und Reagentien, der Temperatur, des pH-Wertes, Einsatz von Cofaktoren, Beschleunigern und Hemmstoffen.
Vorzugsweise wird die weniger spezifische Teilreaktion bzw. werden die weniger spezifischen Teilreaktionen durch eine Überdosierunq der in diesen Teilreaktionen wirksamen Enzyme beschleunigt. Diese iUisführungsform hat den zusätzlichen Vorteil, daß eine Aktivitätsänderung dieser Enzyme durch Lagerungseinflüsse kompensiert wird. Beim Enzym der spezifischsten Teilreaktion dagegen spielt eine Aktivitätsabnahme keine wesentliche Rolle, da die Michaelis-Konstante hierdurch ja nicht beeinflußt wird. Natürlich muß aber verhindert werden, daß die Aktivität dieses Enzyms völlig verloren geht, wozu die üblichen Methoden der Enzymstabilisierung angewandt werden können, die dem Fachmann bekannt sind.
Unter einer Überdosierung wird hier der Einsatz einer wenigstens doppelt so großen Enzymmenge, vorzugsweise einer vielfach größeren Enzyi?menge, als sie ansich für den raschen Ablauf der Reaktion erforderlich wäre, verstanden. Durch entsprechende Mengen der für die Teilschritte eingesetzten Enzyme lassen sich ja, wie oben erwähnt, die Geschwindigkeiten der einzelnen Teilreakti-' onen erheblich variieren, so daß auf relativ einfache Weise diejenige Reaktion geschwindigkeitsbestimmend gemacht werden kann, welche den spezifischsten Verlauf zeigt.
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Die Art der eingesetzten Enzyme kann verändert werden indem man ein Enzym ganz bestimmter Herkunft, je nach der gewünschten Michaelis-Konstante, auswählt. Denn Enzyme verschiedener Herkunft, welche die gleiche Reaktion katalysieren, können unterschiedliche Michaelis-Konstanten haben, je nach dem ob sie z. B. aus Mikroorganismen oder aus Säugetierleber gewonnen werden.
Eine künstliche Veränderung der Michaelis-Konstante läßt sich z. B. erreichen-durch Änderung des Metallatoms im aktiven Zentrum des Enzyms. Eine andere Möglichkeit besteht in der partiellen Spaltung des Enzyms, entweder durch Dissoziation in seine Untereinheiten, wenn das Enzym aus solchen besteht, oder durch proteolytische Abspaltung eines Teils der Peptid-Kette. Eine weitere Möglichkeit besteht in der chemischen Modifizierung des aktiven Zentrums. Diese kann z. B. erfolgen durch Veränderung einzelner reaktiver Gruppen von Aminosäuren des Zentrums wie der Oxydation einer SH-Gruppe oder dergleichen. Weitere Möglichkeiten zur künstlichen Änderung der Michaelis-Konstante bestehen in einer Konformationsänderung des Enzyms durch Zusatz eines allosterischen Effektors, durch Zusatz bestimmter Ionen, durch geeignete. Auswahl der Art des Puffers, durch Einstellung bestimmter Salzkonzentrationen in der Lösung und dergleichen.
Eine Änderung des Substrats selbst kann erfolgen durch Komplexierung bei Zusatz geeigneter Komplexbilder, durch Mizellbildung, beispielsweise durch Detergenszusatz oder dergleichen.
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Auch mit dem pH-Wert läßt sich eine Beeinflussung der Reaktionsgeschwindigkeiten im erfindungsgemäßen Sinne bewirken. So kann das Enzym derjenigen Teilreaktion, die geschwindigkeitsbestimmend gemacht werden soll, unter einem nicht optimalen pH-Wert, der zu einer Erhöhung der Michaelis-Konstante dieses Enzyms führt, eingesetzt werden. In gleicher Weise läßt sich auch die Temperaturabhängigkeit von Enzymen ausnutzen, obwohl dies nicht bevorzugt wird, da die allgemeine Bestrebung dahingeht, die Temperaturen enzymatischer Bestimmungsreaktionen zu vereinheitlichen.
Weitere Mittel zur Beeinflussung der Geschwindigkeit der Teilreaktionen im erfindungsgemäßen Verfahren sind der Zusatz von Reaktionsteilnehmern und Reaktionsprodukten welche die Michaelis-Konstante eines Enzyms echt oder scheinbar verändern. Im gleichen Sinne können auch Inhibitoren verwendet werden. Letzteres ist beispielsweise aus der DT-OS 23 49 819.3, bekannt. Schließlich läßt sich die Geschwindigkeit einer nichtenzymatischen Teilreaktion durch Zusatz eines Katalysators oder eines Hemmstoffes beeinflussen,
Unter der spezifischsten Teilreaktion der Reaktionskette wird diejenige Teilreaktion verstanden, welche die größte Spezifität hinsichtlich der Ausgangssubstanz der Reaktion zeigt und außerdem durch entsprechende Auswahl der Reaktionsparameter geschwindigkeitsbestimmend gestaltet werden kann. Diese Teilreaktion kann enzymatisch katalysiert sein, sie muß es aber nicht. Ein Beispiel einer nichtenzymatischen Reaktion pseudoerster Ordnung mit sehr hoher Spezifität ist die Mutarotation zwischen «■— und ß-Glucose. Wenn die ansich spezifischste Teilreaktion nicht geschwindigkeitsbestimmend gemacht werden kann, z. B. bei zu geringer echter oder scheinbarer Michaelis-Konstante des Enzyms, so gilt die nächstspezifischste Teilreaktion, die geschwindigkeitsbestimmend gestaltet werden kann, als die spezifischste Teilreaktion im Sinne der Erfindung.
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Ein weiteres wesentliches Merkmal der Erfindung besteht darin, daß der geschwindigkeitsbestimmende Schritt so gestaltet werden muß, daß er nach erster oder pseudoerster Ordnung abläuft. Wenn die spezifischste Teilreaktion, die geschwindigkeitsbestimmend gestaltet wird, ohnehin nach erster Ordnung abläuft, so sind besondere Maßnahmen in dieser Hinsicht nicht erforderlich. Anders bei Reaktionen zweiter und höherer Ordnung. Hier muß eine pseudoerste Ordnung herbeigeführt werden. Dies läßt sich dadurch erreichen, daß die Konzentration des zweiten oder weiteren Reaktionspartners, der nicht das zu bestimmende Substrat oder ein Folgeprodukt desselben ist, durch entsprechende Dosierung während der Reaktion praktisch konstant gehalten, also im Überschuß eingesetzt wird, Außerdem muß, wenn es sich um eine enzymatische Reaktion handelt, die Michaelis-Konstante so hoch gewählt werden, daß sie groß ist gegenüber der Obergrenze der in Betracht kommenden Substratkonzentration im Test.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur kinetischen Bestimmung von Enzymsubstraten mittels gekoppelter enzymatischer Reaktionen. Ein derartiges Reagens ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß es solche Enzyme und Reaktionsteilnehmer und diese in einer solchen Dosierung enthält, daß die spezifischste Teilreaktion des bei Zugabe des Substrats zu einer wässrigen Lösung der Reagens ablaufenden Reaktionskette creschwindigkeitsbestimmend für die ganze Reaktionskette ist und nach erster oder pseudoerster Ordnung abläuft.
Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung wird dies erreicht, indem das Reagens das Enzym oder die Enzyme der weniger spezifischen Teilreaktion oder Teilreaktionen überdosiert enthält.
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Die Erfindung ermöglicht es, enzymkinetische Substratmessungen in gekoppelten Testsystemen durchzuführen und damit die zur Durchführung derartiger Bestimmungen erforderliche Zeit erheblich zu verringern. Gleichzeitig wird dadurch weitgehende Unabhängigkeit von der Aktivität der beteiligten Enzyme erreicht, so daß die Präzision des Verfahrens auch dann voll gegeben ist, wenn durch Lagerung schon ein wesentlicher Aktivxtätsverlust bei den beteiligten Enzymen aufgetreten ist. Weiter ermöglicht es die Erfindung, derartige mehrstufige enzymkinetische Substratmessungen auf allen gängigen Analysenautomaten durchzuführen, wobei es anhand der Lehren der Erfindung ohne Schwierigkeiten möglich ist, die quantitative Zusammensetzung der Reagentien jedem beliebigen Analysenautomaten anzupassen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
Blutzuckerbestimmung nach der GOD/PAP-Methode
Die Bestimmung verläuft gemäß folgender Gleichung: cC-D-Glucose tß-D-Glucose
37 % 63 %
ß-D-Glucose + H9O + 0~ GOD ^D-Gluconsäure + H0O0
H2O0 + Phenol 4-Aminoantipyrin POD chinoider Farbstoff
+ 2H0O
Die Enzyme Glucoseoxidase (GOD) und Peroxidase (POD) werden soweit überdosiert, daß die streng nach pseudoerster Ordnung ablaufende Mutarotation zwischen «C- und ß-Glucose zum geschwindigkeitsbestimmenden Schritt wird.
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Dies wird erreicht durch ein Reagens nachstehender Zusammensetzung:
80-120 mM Phosphatpuffer pH 7,0 1,2 U/ml oder mehr POD
12 U/ml oder mehr GOD
1,2 - 1,8 mM 4-Aminoantipyrin
3,0 - 4,4 M Phenol
Vorstehendes Reagens eignet sich besonders zur Durchführung des Verfahrens an centrifugal fast analyzern. Die erste Ablesung erfolgt 35 see. nach Mischen des Reagens mit der zu untersuchenden Probe, die zweite Ablesung 1,5 - 3,5 min. später. Mit 500 - 600 ^uI des Reaktionsgemisches und 5-20 ,ul Probe können bis zu 1000 mg Blutzucker/ 100 ml bestimmt werden.
Beispiel 2
Triglyceridbestimmung
Die Triglyceride werden enzymatisch zu Glycerin und Fettsäuren gespalten.
Die Bestimmung des Glycerins erfolgt gemäß den folgenden gekoppelten Reaktionen:
Glycerin + ATP Glycerokinase EC2.7.1.30^ Glycerin-3-Phos-
phat + ADP
ADP + Phosphoenolpyruvat Pyruvatkinase EC2.7.1.40.^ ATP +
Pyruvat
Pyruvat + NADH + H+ Lactat-Dehydrogenase EC1 .1 . 1.27^ Lactat +
NAD+
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Das Verfahren wird kinetisch mit folgenden Reagentien durchgeführt: Reagens 1:
45 - 55 minol/1 Phosphatpuffer pH 7,0 4,6 - 3,1 iranol/1 Magnesiumsulfat 300 - 400 Natriumdodecylsulfat 2,3 - 3,5 mol/1 ATP 280 - 420 mol/1 Phosphoenolpyruvat
120-230 mol/1 NADH; 7,7 χ 104 U/l oder mehr Lipase 2
5.8 χ 10 U/l oder mehr Esterase
2 9,6 χ 10 U/l oder mehr Pyruvatkinase 5,3 χ 10 U/l oder mehr Lactatdehydrogenase
Reagens 2: 3
2.9 χ 10 U/l oder mehr Glycerokinase
Die Reaktion wird am centrifugal fast analyzßr bei 340 nm und 25 C gemessen. Durch Erhöhung der ATP-Konzentration im Test wird die Michaelis-Konstante der Pyruvat-Kinase scheinbar so weit erhöht, daß sie groß ist gegenüber der Glycerin-Obergrenze im Test. Die anderen Enzyme werden überdosiert. Dadurch wird die Pyruvat-Kinasereaktion geschwindigkeitsbestimmend und die Glycerin-Konzentration kann aus der Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt werden.
Zur Durchführung der Bestimmung wurden 10 ,ul der zu untersuchenden Serumprobe mit 30 - 50 ,ul physiologischer Kochsalzlösung und 500 - 600 ,ul des Feagens, welches die Glycerokinase noch nicht enthielt, gemischt und 10 min.
stehen gelassen. Dann wurde die Glycerokinase zugesetzt und nach 50 see. die erste, nach 150 - 200 see. die zv/eite Ablesung durchgeführt.
Die Methode erfaßt einen Konzentrationsbereich von 500 - 9000 mg Triglycerid pro Liter.
Regressionsgleichung y = 0,99 χ + 0,51 Korrelationskoeffizient r = 0,999
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Beispiel 2a - Alt
Bestimmung von Glycerin
Das Verfahren wird kinetisch mit folgenden Reagentien durchgeführt:
Reagens 1
45 - 55 mmol/1 Phosphatpuffer pH 7,0
4,6 - 3,1 mmol/1 Magnesiumsulfat
300 - 400 ,umol/1 Natriumdodecylsulfat 2,3 - 3,5 ,umol/1 ATP
2 80 - 420 ,umol/1 Phosphoenolpyruvat
120 - 230 ,umol/1 NADH
2
9,6 χ 10 U/l oder mehr Pyruvatkinase 5,3 χ 10 U/l oder mehr Lactatdehydrogenase
Reagens 2
2,9 χ 10 U/l oder mehr Glycerokinase
Die Reaktion wird am centrifugal fast analyzer bei 340 nm und 25 C gemessen.
Durch Erhöhung der ATP-Konzentration im Test wird die Michaelis-Konstante der Pyruvatkinase scheinbar soweit erhöht, daß sie groß genug ist gegenüber der Glycerinobergrenze im Test. Die anderen Enzyme werden überdosiert. Dadurch wird die Pyruvatkinase-Reaktion geschwindigkeitsbestimmend und die Glycerin-Konzentration kann aus der Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt werden.
Zur Durchführung der Bestimmung werden 10 ,ul der zu untersuchenden Serumprobe mit 30 bis 50 ,ul physiologischer Kochsalzlösung und 500 bis 600 ,ul des Reagens, welches die Glycerokinase noch nicht enthielt, gemischt. Dann wurde die Glycerokinase zugesetzt und nach 50 Sekunden die erste, nach 150 bis 200 Sekunden die zweite Ablesung durchgeführt.
Die Methode erfaßt einen Konzentrationsbereich von 50 bis 900 mg Glycerin pro Liter.
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Beispiel 3
Gesamtcholesterin · df.
Die Bestimmung verläuft gemäß folgender Gleichung:
Cholesterinester +H2O Cholesterin-Esterase^ Cholesterin +
Fettsäure
Cholesterin + O0 Cholesterin-Oxidase Cholestenon + H_0„
H0O0 + CH-.0H Katalase H-CO + 2 H0O
H2CO + 2 CH3COCH2COCH3 + NH3 j- ^6> θ Θ +3 »Ο
/{, = 412 nm max
Durch Überdosierung der Enzyme Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase wird die nach pseudoerster Ordnung ablaufende Farbreaktion geschwindigkeitsbestiinmend. Das Verfahren wird beispielsweise am Eppendorf 5032-Auto· raaten mit nachstehendem Reagens durchgeführt:
0,45 - 0,75 mol/1 Ammoniumphosphatpuffer pH 7 1,36 - 2,04 mol/1 Methanol
16-24 mmol/1 Acetylaceton
0,79 bis 1,19 g/l Hydroxypolyäthoxydodecan 660 kU/1 Katalase oder mehr
35 U/l Cholesterin'-Esterase oder mehr 39 U/l Cholesterin-Oxidase oder mehr
Ein in gleicher Weise zusammengesetztes Leerwertreagens enthält die Cholesterinoxidase nicht.
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Zur Durchführung der Bestimmung am Eppendorf 5032-Automaten werden 0,01 ml der zu untersuchenden Probe mit 1,0 ml des Reagens gemischt und bei 37 0C 20 min. inkubiert. Dann wurde bei Hg 405 mnm die Extinktion abgelesen.
In einem Leerwertansatz mit gleicher Zusammensetzung, der die Cholesterinoxidase nicht enthielt, wurde genauso vorgegangen. Aus der Extinktionsdifferenz zwischen Probenansatz und Leerwertansatz errechnet sich die Cholesterinmenge.
Regressionsgerade y = 0,98 χ + 1,98; Korrelationskoeffizient r = 0,997
Beispiel 4
Harnstoffbestimmung
Die Bestimmung erfolgt gemäß nachstehenden Gleichungen:
Harnstoff + H2O Urease 2NH^ +
4 + + 2NADH + 2</>Ketoglutarat eiutamat-Dehydrogenase^ 2L-
Glutamat +
2NAD+ + H2O
Durch Erhöhung der Glutamat-Dehydrogenase-Konzentration C 3
auf das ,-40-fache der Urease-Konzentration wird die Ureasereaktion geschwindigkeitsbestimmend. Da die Michaelis-Konstante der Urease groß ist gegenüber der Harnstoff-Obergrenze im Test, kann die Substrat-Konzentration aus der Reaktionsgeschwindigkeit ermittelt werden.
Ein geeignetes Reagens ist wie folgt zusammengesetzt:
114 - 170 mmol/1 Triäthanolaminpuffer pH 8,0 12 - 18 mrnol/1 2-Ketoglutarat
1,15 - 1,70 mmol/1 ADP
360 - 550 /umol/1 ß-NADH
2,4-7 χ 10 U/l Urease
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2,1 χ 10 U/l oder mehr Glutamat-Dehydrogenase
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Das Reagens eignet sich für centrifucral fast analyzer. Zur Durchführung des Verfahrens werden 5 ,ul der Probelösung mit 500 - 600 ,ul Reagens gemischt und nach 30 60 see. die erste Ablesung, nach weiteren 150 - 200 see. die zweite Ablesung bei 365 nm durchgeführt.
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Claims (15)

  1. PATENTANSPRÜCHE
    1· Verfahren zur kinetischen Bestimmung von Enzymsubstraten mittels gekoppelter Reaktionen, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsparameter so gewählt werden, daß die spezifischste Toi!reaktion der Reaktionskette geschwindigkeitsbestimmend für die ganze Reaktionskette wird und die aeschwindigkeitsbestimmende Teilreaktion nach erster oder pseudoerster Ordnung abläuft.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die kinetische Bestimmung durch Messung einer Veränderung in einem vorgegebenen Zeitintervall durchgeführt wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekonnzeichnet, daß die spezifischste Teilreaktion durch f'berdosierung des Enzyms oder der Enzyme der anderen Teil reaktion bzw. Teilreaktionen geschwindigkeitsbestimmend gestaltet wird.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifischste Teilreaktion durch geeignete Auswahl der Art des eingesetzten Enzyms, je nach seiner Michaelis-Konstante, durch künstliche Veränderung der Michaelis-Konstante oder durch künstliche Veränderung des Substrats, so gestaltet wird, daß sie geschwindigkeitsbestimmend ist und nach pseudoerster Ordnung abläuft.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die künstliche Veränderung der Michaelis-Konstante durch Änderung des Metallatoms im aktiven Zentrum, durch partielle Spaltung des Enzyms, durch chemische Modifizierung des aktiven Zentrums oder/und durch Konformationsänderung erfolgt.
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  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Veränderung des Substrats durch Komplexierung oder Mizellbildung erfolgt.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Reaktionsablauf nach der pseudoersten Ordnung hergestellt wird, indem der zweite oder, weitere Reaktionspartner, der nicht das zu bestimmende Substrat oder ein Folgeprodukt desselben ist, im Überschuß zugegeben wird.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Reaktionsablauf nach pseudoerster Ordnung durch echte oder scheinbare Erhöhung der Michaelis-Konstante des Enzyms der geschwindigkeitsbestimmenden Teilreaktion eingestellt wird.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die scheinbare Erhöhung der Michaelis-Konstante durch Zusatz eines Reaktionsnebenproduktes oder durch Inhibitorzugabe erfolgt.
  10. TO. Reagens zur kinetischen Bestimmung von Enzymsubstraten mittels gekoppelter enzymatischer Reaktionen, dadurch ■ gekennzeichnet, daß es solche Enzyme und Peaktionsteilnehmer und diese in einer solchen Dosierung enthält, daß die spezifischste Teilreaktion der bei Zugabe des Substrates zu einer wässrigen Lösung des Reagens ablaufenden Reaktionskette ist und nach erster oder pseudoerster Ordnung abläuft.
  11. 11. Reagens nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es das Enzym oder die Enzyme der weniger spezifischen Teilreaktion oder Reaktionen überdosiert enthält.
    709827/0836
  12. 12. Reagens nach Anspruch 11 zur Bestimmung von Blutzucker, bestehend aus 80 - 120 mM Fhosphatpuffer pH 7,0, 1,2 U/ml oder mehr POD, 12 U/ml oder mehr GOD, 1,2 1,8 mM 4-Aminoantipyrin, 3,0 - 4,4 M Phenol
  13. 13. Reagentien nach Anspruch 11 zur Bestimmung von Triglyceriden, bestehend aus:Reagens 1 45 - 55 mmol/1 Phosphatpuffer pH 7,0, 4,6 - 3,1 mmol/1 Magnesiumsulfat, 300 - 400 ,umol/1 Natriumdodecylsulfat, 2,3 - 3,5 mol/1 ATP, 2 80 - 4 20 mol/1 Phosphoenolpyruvat, 120 - 2 30 mol/1 NADII; 7,7 χ 10 U/l oder
    2 2
    mehr Lipase, 5,8 χ 10 U/l oder mehr Esterase, 9,6 χ 10 U/l oder mehr Pyruvatkinase, 5,3 χ 10 U/l oder mehr Lactatdehydrogenase; Reagens 2, 2,9 χ 10 U/l oder mehr Glycerokinase.
  14. 14. Reagens nach Anspruch 11 zur Bestimmung von Gesamtcholesterin, bestehend z.B. aus 0,45 - 0,75 mol/1 Ammoniumphosphatpuffer pH 7, 1,36 - 2,04 mol/1 Methanol, 16 - 24 mmol/1 /\ ce ty lace ton, 0,79 bis 1,19 g/l Hydroxypolyäthoxydodecan, 660 kU/1 Katalase oder mehr, 35 U/l Cholesterinesterase oder mehr, 39 U/l Cholesterinoxidase oder mehr.
  15. 15. Reagens nach Anspruch 11 zur Harnstoffbestimmung, bestehend aus 114 - 170 mmol/1 Triäthanolaminpuffer pH 8,0, 12 - 18 mmol/1 2-Ketoglutarat, 1,15 - 1,70 mmol/1 AD, 360 - 550 ,umol/1 ß-NADH, 2,4 - 7 χ Κ
    mehr Glutamat-Dehydrogenase
    ,umol/1 ß-NADH, 2,4 - 7 χ 102 U/l Urease, 2,1 χ 1O4 U/l oder
    709827/0836
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