FI60887B - Foerfarande foer kinetisk enzymsubstratbestaemning samt reagens foer genomfoerande av foerfarandet - Google Patents
Foerfarande foer kinetisk enzymsubstratbestaemning samt reagens foer genomfoerande av foerfarandet Download PDFInfo
- Publication number
- FI60887B FI60887B FI763653A FI763653A FI60887B FI 60887 B FI60887 B FI 60887B FI 763653 A FI763653 A FI 763653A FI 763653 A FI763653 A FI 763653A FI 60887 B FI60887 B FI 60887B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- reaction
- enzyme
- substrate
- enzymatic
- reagent
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/61—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving triglycerides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
r., .... KUULUTUSJULKAISU ί fl ö O 7 «Hl» 11 (11) UTLAGGNINOSSKRIFT oUÖÖ/ ♦ C (45) Patentti myönnetty 13 04 1?32
Patent meddelat ^ y / (51) Kv.ik.3/int.a.3 C 12 Q 1/00 SUOMI—FINLAND (21) Ptt«nulh»k*mu« — PttuntaraBkning 7 6 3653 (22) Hakamispilvl — Aiw5knlng*dag 20.12.76 * * (23) Alkupllvi—Glltighetadag 20.12.76 (41) Tullut luikituksi — Bllvlt offtntllg 25.06.77
Patentti- ja rekisterihallitus .... .... , _ . . . . ^ . (44) Nlhtivlkslpanon ja kuul. ulkaltun pvm. — οί n o fti
Patent- och registerstyrelsen ' ' Antöktn utlagd och utl.akriften publkerad 31 · OI
(32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus —Begird prlorltet 2^.12.75
Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken
Tyskland(DE) P 2550536.8 (71) Boehringer Mannheim GmbH., Sandhofer Strasse 112-132, D-6800 Mannheim-Waldhof, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Joachim Ziegenhorn, Unterpfaffenhofen, August Wilhelm Wahlefeld,
Weilheim, Alexander Hagen, Tutzing, Wolfgang Gruber, Tutzing-Unterzeismering, Hans Ulrich Bergmeyer, Tutzing, Saksan Liitto-tasavalta-Förbundsrepiibliken Tyskland(DE) (7*0 Berggren Oy Ab (5*0 Menetelmä entsyymisubstraattien kineettiseksi määrittämiseksi sekä reagenssi menetelmän toteuttamista varten - Förfarande för kinetisk enzymsubstratbestämning samt reagens för genomförande av förfarandet
Keksinnön kohteina ovat menetelmä entsyymisubstraattien kineettiseksi määrittämiseksi sarjareaktioitten avulla sekä tämän toteuttamiseen soveltuva reagenssi.
Eniten käytetty menetelmä entsymaattisessa substraattimäärityksessä on niin sanottu päätearvomenetelmä. Tässä menetelmässä mitataan entsvmaattisen reaktion määritettävä substraatti reaktion päätyttyä, siis kun koko substraatti on reagoinut. Useissa tavanmukaisissa substraattimäärityksen päätearvomenetelmissä, erikoisesti myös ana-lyysiautomaatteja käytettäessä, on ajantarve nykyisin 10-20 minuuttia analyysia kohti. Tämä tilanne on epätyydyttävä, koska ajantarve on liian suuri, ja mittauslaitteiden sekä analyysiautomaattien optimaalinen hyväksikäyttö estyy.
On tunnettua, että käyttämällä kineettistä menetelmää, jossa subst- raattipitoisuus määritetään mittaamalla määritysreaktion nopeus, voidaan saavuttaa tavallisesti esiintyvän analyysiajan huomattava 2 60887 lyheneminen. Tähän vaikuttaa lisäksi se seikka, että tässä menetelmässä, päinvastoin kuin päätearvomenetelmässä, ei yleensä tarvita vertausarvojen määritystä.
Kineettisen substraattimäärityksen teoreettiset perusteet on seikkaperäisesti käsitelty julkaisussa Anal. Chem. 43, 697 ja Advan. Chem. Instrum. 7, 141. Niistä käy ilmi, että erikoisen tärkeitä ovat ensimmäisen tai näennäisesti ensimmäisen kertaluvun reaktiot, koska niitä voidaan analyysiautomaatissa helposti seurata niin sanotun määräaika-periaatteen ("fixed-time"-Prinzip) mukaan.
Määräaika-menetelmissä mitataan määritettävän aineen tai jonkin jälkituotteen pitoisuudenmuutos tiettynä aikavälinä. Jos määri-tysreaktio valittuna aikavälinä tapahtuu ensimmäisen tai näennäisesti ensimmäisen kertaluvun mukaan, on voimassa yhtälö: c ---4-S- ° e'ktl - e -kt2 Tässä merkitsee k reaktion nopeusvakiota, cq määritettävän aineen alkupitoisuutta ja Ac sen pitoisuudenmuutosta mittausaikavälinä At = t2 ~ t^. Yhtälöstä ilmenee, että mitattu pitoisuudenmuutos on suoraan verrannollinen haettuun alkupitoisuuteen, kun k, t-^ ja t2 pidetään vakioina. Viimeksimainitut ehdot ovat helposti täytettävissä analyysiautomaateissa, minkä vuoksi tätä menetelmää voidaan erittäin edullisesti soveltaa tällaisissa laitteissa.
Myöskin on jo tunnettua valita menetelmän ehdot siten, että saadaan näennäisesti nollannen kertaluvun reaktio. Kvantitatiivinen määritys on tällöin tosin mahdollista vain käyttäen likiarvomene-telmiä, jotka usein edellyttävät kalibrointikäyrien laatimista.
Edellä mainituissa julkaisuissa sekä muissa kineettistä substraa-tinmääritystä koskevissa kirjoituksissa (Bergmeyer, H.U.: Methoden der Enzymatischen Analys 2. Aufl., Bd II, s. 1172-1173, 1941) on ensi sijassa käsitelty menetelmän soveltuvuutta yksivaiheisiin reaktioihin. Tällaisilla reaktioilla on kuitenkin vain rajoitettu merkitys. On nimittäin usein tarpeellista muodostaa koejärjestelmä useista osareaktioista riittävän spesifisyyden ja käyttökelpoisuuden saavuttamiseksi. Toisaalta ei ole tunnettua, miten 3 60887 tällaisia yhdistettyjä koejärjestelmiä voidaan käyttää substraat-tipitoisuuksien rutiininomaiseksi kineettiseksi määrittämiseksi. Aivan päinvastoin on viime aikoina viitattu siihen, että reaktio-sarjat tekevät kineettiset määritykset ongelmallisiksi (Chem, Rundschau, 26, 24 (1973)), koska esimerkiksi osallistuvien entsyymien aktiivisuuden häviäminen tekee menetelmän nopeasti käyttökelvottomaksi. Niinpä tähän saakka on oltu sitä mieltä, että yksivaiheinen menetelmä nimenomaan entsyymikineettisissä substraa-tinmäärityksissä on parempi kuin kaksivaiheinen (ja vastaavasti yleensä monivaiheinen) menetelmä. Tämä selittää sen, minkä vuoksi kaksi- tai monivaiheiset koejärjestelmät, joita käyttäen substraat-tipitoisuudet voidaan rutiininomaisesti määrittää kineettisesti, eivät ole tulleet käyttöön.
Niinpä keksinnön tarkoituksena on aikaansaada menetelmä substraatti-pitoisuuksien määrittämiseksi sarjareaktioiden avulla kineettiues-ti, joka menetelmä voidaan toteuttaa rutiininomaisesti ja jossa monivaiheisen koejärjestelmän osavaiheet tapahtuvat kokonaan tai osittain entsyymikatalyysiä käyttäen.
Tämä tavoite saavutetaan keksinnön mukaan menetelmällä, joka on tarkoitettu entsyymisubstraattien kineettiseen määrittämiseen sarjareaktioiden avulla, ja jolle on tunnusomaista, että valitaan se osareaktio, jolla on suurin spesifisyys reaktiosarjän lähtö-substraattiin nähden ja lisätään muun tai muiden osareaktioiden entsyymiä tai entsyymejä sellainen ylimäärä, joka on ainakin kaksi kertaa reaktion suorittamiseksi tarvittava määrä, siten että eniten spesifinen osareaktio muodostuu reaktionopeutta määrääväksi ja seuraa ensimmäisen tai pseudo-ensimmäisen kertaluvun kinetiikkaa, ja mittaamalla muutos mainitun reaktiotuotteen pitoisuudessa ennalta määrätyn ajan kuluessa.
Sarjareaktioilla tarkoitetaan tässä vähintään kahden osareaktion sarjaa, joista reaktioista ainakin kahta katalysoidaan entsymaattisesti ja joissa substraatin reagointi ja varsinainen mit-tausreaktio (indikaattorireaktio) tapahtuvat eri vaiheissa.
Käytettäessä keksinnön mukaisessa menetelmässä entsyymejä ylimäärä saavutetaan lisäksi se etu, että säilytyksen aiheuttamaa näiden entsyymien aktiivisuuden muuttuminen tulee kompensoiduksi. Eni- 4 60887 ten spesifiseen osareaktioon osallistuvan entsyymin aktiivisuuden vähenemisellä ei sen sijaan ole olennaista merkitystä, koska tämä ei yleensä vaikuta Michaelis-vakion arvoon. Tietystikin on estettävä tämän entsyymin aktiivisuuden täydellinen häviäminen, mihin tarkoitukseen voidaan käyttää tavanomaisia entsyymin stabilointi-menetelmiä, jotka ovat tuttuja asiantuntijalle.
Entsyymin ylimäärällä tarkoitetaan tässä vähintään kaksi kertaa, sopivimmin moninkertaisesti niin suurta entsyymimäärän käyttöä kuin mikä reaktion tapahtumiseksi nopeasti olisi tarpeen. Lisättäessä eri määriä osavaiheisiin käytettäviä entsyymejä tulevat, kuten edellä on mainittu, eri osareaktioitten nopeudet huomattavasti vaihtelemaan, täten voidaan suhteellisen yksinkertaisella tavalla tehdä eniten spesifinen reaktio nopeutta määrittäväksi.
Käytettäviä entsyymejä voidaan vaihdella ja valita entsyymi, joka on täysin määrättyä alkuperää, ja jolla on haluttu Michaelis-vakio. Erilaista alkuperää olevilla entsyymeillä, jotka katalysoivat samoja reaktioita, voi olla erilaiset Michaelis-vakiot sen mukaan, onko ne saatu esim. mikro-organismeista tai nisäkkäiden maksasta.
Myös pH-arvon avulla voidaan vaikuttaa reaktionopeuteen keksinnön mukaisessa mielessä. Niinpä voidaan sen osareaktion entsyymiä, joka aiotaan tehdä nopeutta määrittäväksi, käyttää epäoptimaali-sella pH-arvolla, mikä aiheuttaa tämän entsyymin Michaelis-vakion suurenemisen. Samalla tavalla on myös mahdollista käyttää hyväksi entsyymien riippuvuutta lämpötilasta, vaikka tätä ei pidetä edullisena, koska yleisenä pyrkimyksenä on yhtenäistää entsymaattis-ten määritysreaktioiden lämpötila.
60887
Reaktioketjun eniten spesifisellä osareaktiolla tarkoitetaan sitä osareaktiota, joka osoittaa suurinta spesifisyyttä reaktion läh-tösubstraatin suhteen ja joka voidaan muodostaa nopeutta määrittäväksi kuten yllä on mainittu. Tämä osareaktio voi olla, mutta sen ei tarvitse olla entsymaattisesti katalysoitu. Esimerkki näennäisesti ensimmäisen kertaluvun epäentsymaattisesta reaktiosta, jolla on erittäin suuri spesifisyys, on mutarotaatio a- ja β-glukoosin välillä. Jos sinänsä eniten spesifistä osareaktiota ei voida tehdä nopeutta määrittäväksi, esimerkiksi entsyymin liian pienestä todellisesta tai näennäisestä Michaelis-vakiosta johtuen, niin kelpaa seuraavaksi spesifisin osareaktio, joka voidaan muodostaa nopeutta määrittäväksi, keksinnön mukaiseksi eniten spesifiseksi osareaktioksi.
Keksinnön olennaisena tunnusmerkkinä on, että nopeutta määrittävä vaihe muodostetaan sellaiseksi, että se tapahtuu ensimmäisen tai näennäisesti ensimmäisen kertaluvun mukaan. Jos eniten spesifinen osareaktio, joka muodostetaan nopeutta määrittäväksi, ilman muuta tapahtuu ensimmäisen kertaluvun mukaan, niin erikoistoimenpiteet tässä suhteessa eivät ole tarpeen. Toisin on järjestyksessä toisen ja korkeamman kertaluvun reaktioitten laita. Tällöin reaktio voidaan muuttaa seuraamaan näennäisesti ensimmäistä kertalukua. Tämä voidaan, kuten asiantuntijalle on tunnettua, aikaansaada siten, että toisen tai jonkin muun reaktioon osallistuvan aineen, joka ei ole määritettävä substraatti tai sen reaktiotuote, pitoisuus pidetään reaktion aikana vakiona käyttämällä ainetta ylimäärin. Sitäpaitsi pitää, mikäli on kyseessä entsymaattinen reaktio, valita entsyymi, jolla on niin suuri Michaelis-vakio, että se tulee olemaan suuri verrattuna kokeessa esiintyvään substraattipitoi-suuteen.
Keksinnön kohteena on lisäksi reagenssi käytettäväksi entsyymi-substraattien kineettiseen määritykseen entsymaattisten sarjare-aktioiden avulla. Tällainen reagenssi sisältää sinänsä tunnettuja entsyymejä ja reaktioon osallistuvia aineita, ja keksinnön mukaiselle reagenssille on tunnusomaista se, että reagenssi sisältää ylimäärän, joka on ainakin kaksi kertaa reaktion suorittamiseksi tarvittava määrä, vähemmän spesifisen osareaktion tai vähemmän spesifisten osareaktioiden entsyymiä tai entsyymejä, eniten spesifisen osareaktion saattamiseksi reaktionopeutta määrääväksi.
6 60887
Keksintö mahdollistaa entsyymikineettisten substraattimittausten suorittamisen sarjareaktioita käsittävissä koejärjestelmissä ja samalla näiden määritysten suorittamiseen tarvittavan ajan lyhentämisen. Samalla saavutetaan olennainen riippumattomuus osallistuvien entsyymien aktiivisuudesta, niin että menetelmä toimii täsmällisesti myös silloin, kun osallistuvien entsyymien aktiivisuudet ovat varastoinnin vuoksi alentuneet merkittävästi. Lisäksi keksintö mahdollistaa sellaisten monivaiheisten entsyymikineettisten substraattimittausten suorittamisen kaikissa käytössä olevissa analyysiautomaateissa, joissa keksinnön mukaisesti on vaikeuksitta mahdollista sovittaa reagenssien kvantitatiivinen koostumus mille tahansa analyysiautomaatille soveltuvaksi.
Seuraavat esimerkit selittävät keksintöä edelleen.
7 60887
Esimerkki 1
Verensokerinmääritys GOD/PAP-menetelmän mukaan Määritys tapahtuu seuraavan yhtälön mukaisesti: ot-D-glukoosi Λ $-D-glukoosi 37 % 63 % β-D-glukoosi + K~o + 00 GOD . D-glukonihappo + H900 EC.1.1.3.4 H„o? + fenoli + 4-aminoantipyriini _PQD v kinoidinen väri- EC.1.11.1.7 . e .
aine + 2^0
Peroksidaasi-entsyymiä (POD) annostellaan sellainen ylimäärä, että tarkkaan näennäisesti ensimmäisen kertaluvun mukaan tapahtuva muta-rotaatio a- ja β-glukoosin välillä tai glukoosiin nähden suuren K^-arvon vuoksi samoin näennäisesti ensimmäisen kertaluvun mukaan tapahtuva glukoosioksidaasi (GOD)-reaktio tulee nopeutta määrittäväksi vaiheeksi.
Tämä saavutetaan reagenssilla, jolla on seuraava koostumus:
80 - 120 millimoolia fosfaattipuskuria, pH 7,0 0,8 U/ml tai enemmän POD 12 U/ml tai enemmän GOD
0,60 - 1,80 millimoolia 4-aminoantipyriiniä 3,0 - 13,5 millimoolia fenolia
Yllä oleva reagenssi soveltuu erikoisesti menetelmän toteuttamiseen nopeissa keskipako-analysaattoreissa. Ensimmäinen lukema otetaan noin 35 sekuntia sen jälkeen kun reagenssi on sekoitettu tutkittavan näytteen kanssa, ja toinen lukema 1,5 - 3,5 minuuttia myöhemmin. Käyttämällä 500 - 600^,ul reaktioseosta ja 5 - 20^,ul näytettä voidaan veren sokeripitoisuus aina arvoon 1000 mg/100 ml saakka määrittää.
Esimerkki 2
Triglyseridin määritys
Triglyseridit hajotetaan entsymaattisesti glyseroliksi ja rasvahapoksi .
8 60887
Glyserolin määritys tapahtuu seuraavien yhteenliittyvien reaktioit-ten mukaan j
Glyseroli + ATP gly^rokinaasi EC2 -7.1.30 > glyseroli-3-fosfaatti
+ ADP
ADP + fosfoenolipyruvaatti Pyruvaattiklnaasi EC2.7.1.40> ATp + pyru_ vaatti
Pyruvaatti + NADH + H+ laktaattidehydrogenaasi EC1.1.1.27>laktaatti
Menetelmä toteutetaan kineettisesti käyttäen seuraavia reagensseja: Reagenssi 1: 45 - 55 millimoolia/1 fosfaattipuskuria, pH 7,0 4.6 - 3,1 millimoolia/1 magnesiumsulfaattia 300 - 400 mikromoolia/1 natriumdodesyylisulfaattia
2.3 - 3,5 millimoolia/1 ATP
280 - 420 mikromoolia/1 fosfoenolipyruvaattia
120 - 230 mikromoolia/1 NADH
4 7.7 x 10 U/l tai enemmän lipaasia 2 5.8 x 10 U/l tai enemmän esteraasia 2 9,6 x 10 U/l tai enemmän pyruvaattikinaasia 5.3 x 10^ U/l tai enemmän laktaattidehydrogenaasia
Reagenssi 2: 2.9 x 10^ U/l glyserokinaasia
Reaktio mitataan nopeassa keskipako-analysaattorissa aallonpituudella 340 nm ja lämpötilassa 25°C. Lisättäessä ATP-pitoisuutta kokeessa pyruvaattikinaasin Michaelis-vakio kasvaa näennäisesti niin paljon, että se tulee olemaan suuri verrattuna kokeen glyseroli-ylärajaan. Muita entsyymejä annostellaan ylimäärä. Siten pyruvaattikinaasireak-tio tulee nopeutta määrittäväksi, ja glyserolipitoisuus voidaan määrittää reaktionopeuden perusteella.
Määrityksen suorittamiseksi sekoitettiin keskenään 10^ul tutkittavaa seeruminäytettä, 30-50^,ul fysiologista keittosuolaliuosta ja 500-600 yul reagenssia 1, joka ei vielä sisältänyt glyserokinaasia, ja seoksen annettiin seistä 10 minuuttia. Sen jälkeen lisättiin glyserokinaasi, 9 60887 ja ensimmäisen lukema otettiin 50 sekunnin sekä toinen lukema 150-200 sekunnin kuluttua.
Menetelmä soveltuu käytettäväksi triglyseridin pitoisuusalueella 500-9000 mg/1.
Regressiovertaussuora y = 0,99 x + 0,51 Korrelaatiokerroin r = 0,999.
Esimerkki 2 a Glyserolin määritys
Menetelmä toteutetaan kineettisesti käyttäen seuraavia reagensseja: Reagenssi 1: 45 - 55 millimoolia/1 fosfaattipuskuria, pH 7,0 4.6 - 3,1 millimoolia/1 magnesiumsulfaattia 300 - 400 mikromoolia/1 natriumdodesyylisulfaattia
2.3 - 3,5 millimoolia/1 ATP
280 - 420 mikromoolia/1 fosfoenolipyruvaattia
120 - 230 mikromoolia/1 NADH
•y 9.6 x 10 U/l tai enemmän pyruvaattikinaasia 5.3 x 10^ U/l tai enemmän laktaattidehydrogenaasia
Reagenssi 2: 2,9 x 10·^ U/l tai enemmän glyserokinaasia
Reaktio mitataan nopeassa keskipako-analysaattorissa aallonpituudella 340 nm ja lämpötilassa 25°C.
Lisättäessä ATP-pitoisuutta kokeessa pyruvaattikinaasin Michaelis-vakio kasvaa näennäisesti niin paljon, että se tulee olemaan riittävän suuri verrattuna kokeen glyseroli-ylärajaan. Muita entsyymejä annostellaan ylimäärä. Siten pyruvaattikinaasireaktio tulee nopeutta määrittäväksi, ja glyserolipitoisuus voidaan määrittää reaktionopeuden perusteella.
Määrityksen suorittamiseksi sekoitettiin keskenään lOO^ul tutkittavaa seeruminäytettä, lOO^ul fysiologista keittosuolaliuosta ja 500- 10 60887 600yul reagenssia 1, joka ej vielä sisältänyt glyserokinaasia. Sen jälkeen lisättiin glyserokinaasi, ja ensimmäinen lukema otettiin 50 sekunnin sekä toinen lukema 150-200 sekunnin kuluttua.
Menetelmä soveltuu käytettäväksi glyserolipitoisuusalueella 50-900 mg/1.
Esimerkki 3
Kolesterolin kokonaismäärä Määritys tapahtuu seuraavan yhtälön mukaan:
Kolesteroliesteri + H,0 jL°lffteroli-esteraasi> kolesteroli + £ ¢- 1 EC 3.1.1.13 rasvahappo
Kolesteroli + 02 j?°lesterolioksldaasl) kolestenonl + h202 H202 + CH30H katalaasi_^ h2C0 + 2H20 EC 1.11.1.6 H2CO + 2CH3COCH2COCH3 + NH^ _^ ^ ^Ö1 Θ +3 Η2<0 CH3 I f CH3 ch3 ^N'n'^Nsch3
H
Xmaks = 112 ""
Annosteltaessa kolesteroliesteraasi- ja kolesterolioksidaasi-entsyy-mejä ylimäärä tulee näennäisesti ensimmäisen kertaluvun mukaisesti tapahtuva värireaktio nopeutta määrittäväksi. Menetelmä toteutetaan esimerkiksi Eppendorf 5032—automaatissa käyttäen seuraavaa reagenssia: 0,45 - 0,75 moolia/1 ammoniumfosfaattipuskuria, pH 7,0 1,36 - 2,04 moolia/1 metanolia 16 - 24 millimoolia/1 asetyyliasetonia 0,79 - 1,19 g/1 hydroksipolyetoksidodekaania 500 kU/1 tai enemmän katalaasia 20 U/l tai enemmän kolesteroliesteraasia 20 U/l tai enemmän kolesterolioksidaasia 11 60887
Muuten saman koostumuksen omaava vertausreagenssi ei sisällä koles-terolioksidaasia.
Määrityksen suorittamiseksi Eppendorf 5032-automaatissa 0,01 ml tutkittavaa näytettä sekoitetaan 1,0 ml:aan reagenssia, ja seosta haudutetaan 20 minuuttia lämpötilassa 37°C. Sen jälkeen ekstinktio luettiin elohopeaviivan 405 nm kohdalta.
Muuten saman koostumuksen omaavan vertauserän, paitsi että se ei sisältänyt kolesterolioksidaasia, suhteen meneteltiin tarkkaan samoin kuin edellä. Ekstinktioerosta koe-erän ja vertauserän välillä on kolesterolimäärä laskettavissa.
Regressiosuora y = 0,98 x + 1,98; korrelaatiokerroin r = 0,997.
Claims (2)
1. Förfarande för kinetisk bestämning av ett enzymsubstrat, i vilket förfarande substratet omsättes i en reaktionsserie av ät-minstone tvä enzymatiska delreaktioner, där en mätbar reaktions-produkt erhälles, kännetecknat av att den delreaktionen som är mest specifik beträffande reaktionsseriens utgängssubstrat utväljes och ett överskott av ätminstone tvä gänger den för ut-förande av reaktionen behövliga mängden av den andra eller de andra delreaktionernas enzym eller enzymer tillsättes, sälunda att den mest specifika delreaktionen blir hastighetsbestämmande och följer första eller pseudo-första ordningstalets kinetik, och ändring i den nämnda reaktionsproduktens koncentration bestämmes inom ett förutbestämt tidsintervall.
1. Menetelmä entsyymisubstraatin kineettiseksi määrittämiseksi, jossa menetelmässä substraatti saatetaan reagoimaan ainakin kahden entsymaattisen osareaktion reaktiosarjassa, jossa saadaan määritettävissä oleva reaktiotuote, tunnettu siitä, että valitaan se osareaktio, jolla on suurin spesifisyys reaktiosarjän läh-tösubstraattiin nähden ja lisätään muun tai muiden osareaktioiden entsyymiä tai entsyymejä sellainen ylimäärä, joka on ainakin kaksi kertaa reaktion suorittamiseksi tarvittava määrä, siten että eniten spesifinen osareaktio muodostuu reaktionopeutta määrääväksi ja seuraa ensimmäisen tai pseudo-ensimmäisen kertaluvun kinetiikkaa, ja mitataan muutos mainitun reaktiotuotteen pitoisuudessa ennalta määrätyn ajan kuluessa.
2. Reagenssi entsyymisubstraattien kineettistä määrittämistä varten entsymaattisten sarjareaktioiden avulla patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä, joka reagenssi sisältää sinänsä tunnettuja entsyymejä ja reaktioon osallistuvia aineita, tunnettu siitä, että reagenssi sisältää ylimäärän, joka on ainakin kaksi kertaa reaktion suorittamiseksi tarvittava määrä, vähemmän spesifisen osareaktion tai vähemmän spesifisten osareaktioiden entsyymiä tai entsyymejä, eniten spesifisen osareaktion saattamiseksi reaktionopeutta määrääväksi.
2. Reagens för kinetisk bestämning av ett enzymsubstrat med enzymatiska seriereaktioner enligt förfarandet enligt patentkra-
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2558536A DE2558536B2 (de) | 1975-12-24 | 1975-12-24 | Verfahren zur kinetischen Substratbestimmung und Reagens zu seiner Durchführung |
| DE2558536 | 1975-12-24 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI763653A FI763653A (fi) | 1977-06-25 |
| FI60887B true FI60887B (fi) | 1981-12-31 |
| FI60887C FI60887C (fi) | 1982-04-13 |
Family
ID=5965531
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI763653A FI60887C (fi) | 1975-12-24 | 1976-12-20 | Foerfarande foer kinetisk enzymsubstratbestaemning samt reagens foer genomfoerande av foerfarandet |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4229527A (fi) |
| JP (1) | JPS5934116B2 (fi) |
| AU (1) | AU511225B2 (fi) |
| BE (1) | BE849804A (fi) |
| CA (1) | CA1100022A (fi) |
| CH (1) | CH625272A5 (fi) |
| DD (1) | DD127909A5 (fi) |
| DE (1) | DE2558536B2 (fi) |
| FI (1) | FI60887C (fi) |
| FR (1) | FR2336682A1 (fi) |
| GB (1) | GB1571899A (fi) |
| HU (1) | HU174894B (fi) |
| IT (1) | IT1064332B (fi) |
| NL (1) | NL7613819A (fi) |
| SE (1) | SE441364B (fi) |
| SU (1) | SU1055346A3 (fi) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2833723A1 (de) * | 1978-08-01 | 1980-02-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagens zur bestimmung eines oxidierten pyridincoenzyms |
| DE2950381A1 (de) * | 1979-12-14 | 1981-06-19 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagens zur bestimmulng von triglyceriden |
| ATE4328T1 (de) * | 1980-09-19 | 1983-08-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagens zur bestimmung von glycerin. |
| DE3046241A1 (de) * | 1980-12-08 | 1982-07-15 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagenz zur bestimmung von cholesterin |
| DE3208253A1 (de) * | 1982-03-08 | 1983-09-15 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur spezifischen bestimmung des cholesterins der ldl-fraktion im serum |
| DE3340709A1 (de) * | 1983-11-10 | 1985-05-23 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Kompetitiver inhibitor fuer gk |
| DE3439181C2 (de) * | 1984-10-23 | 1994-01-20 | Lange Gmbh Dr Bruno | Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Konzentration einer Substanz |
| CN109596551A (zh) * | 2018-12-24 | 2019-04-09 | 苏州科铭生物技术有限公司 | 一种基于微量法的纤维素酶活性测定试剂盒及其方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5033795B1 (fi) * | 1970-11-25 | 1975-11-04 | ||
| IT986838B (it) * | 1972-05-12 | 1975-01-30 | Sclavo Inst Sieroterapeut | Complesso di reagenti per la deter minazione enzimatica del glucosio sistema glucosio ossidasi perossi dasi con metodo manuale e automati co con lettura a termine o in cinetica |
| AT324282B (de) * | 1972-06-19 | 1975-08-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagens zur bestimmung von triglyceriden |
| DE2349819A1 (de) * | 1973-10-04 | 1975-04-17 | Eppendorf Geraetebau Netheler | Verfahren zur enzymkinetischen konzentrationsbestimmung eines substrats |
| DK678474A (fi) * | 1974-02-15 | 1975-10-13 | Hoffmann La Roche |
-
1975
- 1975-12-24 DE DE2558536A patent/DE2558536B2/de active Granted
-
1976
- 1976-11-15 CA CA265,619A patent/CA1100022A/en not_active Expired
- 1976-11-30 IT IT29969/76A patent/IT1064332B/it active
- 1976-12-13 NL NL7613819A patent/NL7613819A/xx not_active Application Discontinuation
- 1976-12-17 SE SE7614226A patent/SE441364B/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-12-20 GB GB53002/76A patent/GB1571899A/en not_active Expired
- 1976-12-20 FI FI763653A patent/FI60887C/fi not_active IP Right Cessation
- 1976-12-21 FR FR7638547A patent/FR2336682A1/fr active Granted
- 1976-12-22 HU HU76BO1647A patent/HU174894B/hu not_active IP Right Cessation
- 1976-12-22 DD DD7600196540A patent/DD127909A5/xx unknown
- 1976-12-22 AU AU20832/76A patent/AU511225B2/en not_active Expired
- 1976-12-23 BE BE173591A patent/BE849804A/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-12-23 CH CH1628576A patent/CH625272A5/de not_active IP Right Cessation
- 1976-12-24 SU SU762432255A patent/SU1055346A3/ru active
- 1976-12-24 JP JP51156114A patent/JPS5934116B2/ja not_active Expired
-
1978
- 1978-10-23 US US05/954,139 patent/US4229527A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NL7613819A (nl) | 1977-06-28 |
| FI763653A (fi) | 1977-06-25 |
| IT1064332B (it) | 1985-02-18 |
| HU174894B (hu) | 1980-04-28 |
| CA1100022A (en) | 1981-04-28 |
| DE2558536B2 (de) | 1979-07-12 |
| SU1055346A3 (ru) | 1983-11-15 |
| DE2558536C3 (fi) | 1991-03-07 |
| DE2558536A1 (de) | 1977-07-07 |
| FR2336682A1 (fr) | 1977-07-22 |
| CH625272A5 (fi) | 1981-09-15 |
| FR2336682B1 (fi) | 1982-10-22 |
| GB1571899A (en) | 1980-07-23 |
| US4229527A (en) | 1980-10-21 |
| JPS5934116B2 (ja) | 1984-08-20 |
| AU2083276A (en) | 1978-06-29 |
| SE7614226L (sv) | 1977-06-25 |
| FI60887C (fi) | 1982-04-13 |
| JPS5282387A (en) | 1977-07-09 |
| BE849804A (fr) | 1977-06-23 |
| AU511225B2 (en) | 1980-08-07 |
| SE441364B (sv) | 1985-09-30 |
| DD127909A5 (de) | 1977-10-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4490465A (en) | Coupled enzyme systems for determination of dissolved substances | |
| Okabe et al. | Enzymic determination of free fatty acids in serum. | |
| CA1339058C (en) | Process and agent for the colorimetric determination of an analyte by means of enzymatic oxidation | |
| US4212938A (en) | Reagent and method for the determination of cholesterol | |
| JPH0577399B2 (fi) | ||
| EP0200540B1 (en) | Analytical element and method for determination of creatine kinase isoenzyme | |
| US3977944A (en) | Enzyme-kinetic determination of the concentration of a substrate | |
| EP0116307B1 (en) | Composition, analytical element and method for the quantification of creatine kinase | |
| CN107505273A (zh) | 血清总胆汁酸含量测定试剂盒及其使用方法 | |
| FI60887B (fi) | Foerfarande foer kinetisk enzymsubstratbestaemning samt reagens foer genomfoerande av foerfarandet | |
| US6309852B1 (en) | Method and reagent for quantitative determination of 1,5-anhydroglucitol | |
| US4892816A (en) | Method for the determination of cholesterol | |
| EP0121254B1 (en) | Process for determining substrate or enzymatic activity | |
| US5962248A (en) | Quantitative determination method for chloride ions | |
| US4910134A (en) | Ascorbic acid decomposing method | |
| Winartasaputra et al. | Fluorometric and colorimetric enzymic determination of triglycerides (triacylglycerols) in serum. | |
| US4778757A (en) | Method for the determination of substrates or enzyme activities | |
| CA1179929A (en) | Process and reagent for determination of glycerol | |
| US5436133A (en) | Enzyme assay of biochemical substances | |
| US4695539A (en) | Process for quantitative determination of substrate treated with oxidase | |
| FR2540137A1 (fr) | Procede tres sensible d'analyse quantitative enzymatique | |
| EP0386237B1 (en) | Enzyme assay of biological substances | |
| JPS6123998B2 (fi) | ||
| CN115992199A (zh) | 一种增强己糖激酶酶活性的方法 | |
| JP2643205B2 (ja) | 高感度比色定量法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH |