DE1667900C3

DE1667900C3 - Schnell wirkende, beständige Rinderinsulinlösung

Info

Publication number: DE1667900C3
Application number: DE1667900A
Authority: DE
Inventors: Charles Henry Hellerup Krayenbuehl; Mette Lynby Schou
Original assignee: NORDISK INSULINLABORATORIUM GENTOFTE DK
Current assignee: NORDISK INSULINLABORATORIUM GENTOFTE DK
Priority date: 1967-03-01
Filing date: 1968-03-01
Publication date: 1982-10-21
Also published as: SE385769B; US3584121A; DK116527B; DE1667900A1; FR1556052A; CH561066A5; BE711554A; DE1667900B2; NL6802798A; NL157208B; GB1222100A; NO122090B

Description

Die Erfindung betrifft eine schnell wirkende, beständige, durch Phosphat-, Citrat- oder Acetatpuffer auf pH 6,5 bis 8 eingestellte Rinderinsulinlösung.

Verglichen mit Insulinlösungen vom pH-Wert 3 bis 4 (gewöhnliches Insulin) bieten schnell wirkende, beständige neutrale Insulinlösungen gewisse therapeutische Vorteile. Ihre Anfangswirkung setzt etwas früher ein, was in manchen Fällen klinisch von Wert ist. Auch können sie in größerem Rahmen, vermischt mit Insulinsuspensionen oder -verbindungen mit pH-Wert nahe dem Neutralpunkt und verzögerter Wirkung bei der Injektion, zur Herstellung von Injektionsgemischen verwendet werden, in denen sie ihre rasch einsetzende Anfangswirkung beibehalten, während das suspendierte Insulin oder die suspendierten Insulinverbindungen langsam resorbierbar bleiben. Außerdem ist eine neutrale Insulinlösung für die intravenöse Anwendung besser geeignet als eine saure Insulinlösung. Hier und im folgenden wird mit neutral der pH-Bereich 6,5 bis 8 bezeichnet. Außerdem sind neutrale, gepufferte Insulinlösungen kühl gelagert, erheblich langer haltbar als saure Insulinlösungen unter den gleichen Bedingungen.

Beständige neutrale Insulinlösungen mit schnell einsetzender Anfangswirkung wurden bisher aus mehreren Gründen nur in Form von Schweineinsulin-Lösungen hergestellt. In einigen Gegenden z. B. in Dänemark ist Schweineinsulin in größeren Mengen verfügbar. Außerdem wurde allgemein angenommen, daß, im Gegensatz zu dem aus Ochsen- und Kälberpankreas gewonnenen Insulin, die obere isoelektrische Fällungsgrenze bei Schweineinsulin ausreichend unterhalb dem pH-Wert des Blutes liegt, um sicherzustellen, daß beim Stehenlassen der Lösung kein Insulin ausfällt, selbst wenn kleine Änderungen in der Reaktion auftreten sollten. Diese Annahme wurde bisher durch die Tatsache gestützt, daß man mit Rinderinsulin Insulinsuspensionen mit neutraler Reaktion herstellen kann, aus denen das Insulin langsam resorbiert wird. Rinderinsulin, das im allgemeinen schwerer löslich ist als Insulin anderer Provenienz, wurde bisher meist in sauren Insulinlösungen verwendet. Diese wirken nach der Injektion als Depotpräparat, weil eine Verschiebung des pH-Wertes auf etwa 7 stattfindet und sich eine schwerlösliche Verbindung als Insulindepot bildet (Pharmazeutische Praxis, 1965, S. 40).

Aus der BE-PS 6 64 409 war es aber auch bekannt, daß Lösungen von gereinigtem Rinderinsulin, die auf einen pH-Wert von 7 bis 8 und mit NaCI isotonisch eingestellt sind, und als Konservierungsmittel den M'.;>\l- oder Propylcster der p-Hydroxyber.zosäiire ciii...iiten, eine Stabilität bis zu 6 Monaten zeigen, die aber häufig für die Praxis nicht ausreichend ist. In der US-PS 30 14 842 ist beschrieben, daß reine Insulinkristalle mit einem Gehalt von 0,78% Zink bei pH 7 beständige Kristallsuspensionen bilden, während entsprechende Schweineinsulinkristalle unter diesen Bedingungen in Lösung gehen.
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, Rinderinsu-Hn. das in beträchtlichen höheren Mengen als Schweineinsulin gewonnen wird, für neutrale Insulinlösungen verfügbar zu machen, die besonders lange stabil bleiben. Die Aufgabe wird mit Hilfe der überraschenden Feststellung gelöst, daß die für den angestrebten

is Verwendungszweck unerwünschte Eigenschaft des Rinderinsulins, nämlich daß es unter den bestimmten Bedingungen merklich weniger löslich ist als Schweineinsulin, kompensiert werden kann durch Zusatz eines Mittels, das das Auflösen von Rinderinsulin beschleunigt, wobei das Rinderinsulin die zur Kristallisationsreinigung erforderliche Menge Zink enthält und vorausgesetzt wird, daß das Rinderinsulin eine dem Zweck entsprechende Reinheit aufweist.
Erfindungsgemäß enthält die beständige, wäßrige, neutrale, injizierbare Zink enthaltende Insuünlösung zur Auflösung vies blutzuckersenkenden Mittels Rinderinsulin eine Phenolverbindung, und zwar Phenol oder m-Kresol in einer Menge von 0,15 bis 0,5 Gewichtsprozent in einer mit Glycerin oder Glukose oder einem ähnlichen Kohlenhydrat, das in wäßriger Lösung nicht elektrolytisch dissoziiert ist, isotonisch eingestellte Lösung. Vermieden werden müssen Natriumchlorid und ähnliche, in wäßrigen Medien stark dissoziierte Elektrolyte. weil sie die Stabilität der Lösung stark verringern, wenn sie in mit dem Gewebe isotonischer Konzentration vorhanden sind.

Es wurde festgestellt, daß bei Anwesenheit einer gegebenen Menge der genannten Konservierungsmittel auch in Gegenwart von Zink in der für die Kristallisation von Insulin erforderlichen Menge der Ausfällungsbereich von Rinderinsulin auf einen pH-Wert bis 6,5 gesenkt und die Lösung während langer Zeitspannen stabilisiert werden kann. Es war überraschend, daß diese Konservierungsmittel in dieser Weise wirken, da bisher nur ihre entgegengesetzte Wirkung, d. h. die Beschleunigung der Kristallisationsneigung bestimmter Insulinverbindungen wie Protamin-Insulin und Protamin-Zinkinsulin bekannt war. Es war sogar /estgestellt worden, daß die in Rede stehenden Konservierungsmittel die Kristallisation von ungebundenem Insulin innerhalb von zumindest einiger Intervalle des Zinkgehaltes des Insulins beschleunigen können. Bestimmte andere, in Insulinlösungen gebräuchliche Konservierungsmittel wie Methyl- oder Athylhydroxybenzoat weisen diese Wirkung nicht auf, sondern vermindern im Gegenteil die Löslichkeit von Rinderinsulin bei pH-Werten oberhalb der oberen Grenze des isoelektrischen Ausfällungsbereiches.

Es hat sich auch überraschend gezeigt, daß ein Gehalt an Natriumphosphat in der Lösung die Löslichkeit des Rinderinsulins nicht verringert, wenn die Lösung von der oben beschriebenen Art ist, sondern, daß im Gegenteil unter den oben angegebenen Bedingungen und unter Anwendung der üblichen Konzentrationen das Phosphat im Gegensatz zu bestimmten anderen Puffern die Stabilität der Lösung erhöht, indem es die Löslichkeit des Rinderinsulins verbessert. Gemäß einer Ausführungsform enthält daher die erfindungsgemäße

Lösung Natriumphosphat als Puffersubstanz. Hierdurch wird nicht nur, wie bereits angegeben, die Stabilität der Lösung verbessert, sondern auch eine gute Pufferwirkung erzielt.

Es wurde weiter festgestellt, daß, wenn das Insulin einen sehr geringen Gehalt an Zink aufweist, die gewünschte Löslichkeit im pH-Bereich 6,5 bis 7 kaum erzielt wird. In diesem Falle werden vorzugsweise Lösungen mit einem pH-Wert zwischen 7 und 8 angewandt.

Eine besonders vorteilhafte Lösung gemäß der Erfindung enthält zusammen mit dem Phosphatpuffer und Phenol oder m-Kresol insgesamt 0,3 bis 0,8 Gewichtsprozent Zink, bezogen auf das Insulingewicht.

Die erfindungsgemäßen Lösungen werden dadurch hergestellt, daß kristallisiertes Rinderinsulin zusammen mit dem Puffer, Phenol oder m-Kresol in der angegebenen Menge gelöst wird. Gegebenenfalls kann die Lösung weitere für injizierbare Insulinlösungen geeignete Bestandteile enthalten.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen und an Hand der Löslichkeitskurven in der Zeichnung näher erläutert.

Fig. 1 zeigt einen Vergleich der Löslichkeitskurven von Rinderinsulin und Schweineinsulin mit und ohne m-Kresol;

F i g. 2 zeigt einen Vergleich der Löslichkeitskurven desselben Rinderinsulins ohne und mit verschiedenen Konservierungsmitteln.

In F i g. 1 und 2 sind auf der Abszisse der pH-Wert der Lösung und auf der Ordinate der Prozentgehalt gelöstes Insulin (insgesamt) beim jeweiligen pH-Wert nach 24stündigem Stehen bei 20°C aufgetragen. In beiden Figuren enthalten die Lösungen das Insulin in einer Konzentration von 40 IE/cm³. In beiden Fällen enthält das Medium m/75 Phosphatpuffer und als mit der Körperflüssigkeit (Blut) isotonisch machendes Mittel 1,6 Gewichtsprozent Glyzerin. Verwendet wurde zur Herstellung der Lösung Kristall-Insulin mit 0,7 Gewichtsprozent Zink.

In F i g. 1 beziehen sich die Kurven 1 und 2 auf Rinderinsulin und die Kurven 3 und 4 auf Schweineinsulin. Die Kurven 1 und 3 beziehen sich auf Lösungen ohne Konservierungsmittel, die Kurven 2 und 4 zeigen das Verhalten von Insulinlösungen, die 0,3 Gewichtsprozent m-Kresol enthalten.

Ein Vergleich der Kurven zeigt, daß Rinderinsulin in Abwesenheit eines Konservierungsmittels einen sehr breiten Fällungsbereich aufweist und daß mit der oben angegebenen Zusammensetzung unterhalb eines pH-Wertes von 7,1 keine klare Lösung erhalten werden kann. Die Erfahrungen zeigten, daß dies keine ausreichende Sicherheit dafür ist, daß beim Lagern einer Rinderinsulinlösung unter normalen Bedingungen keine Ausfällung eintritt. Bei Rinderinsulin ist die Wirkung des zugesetzten Konservierungsmittels auffallend und entscheidend für die Erreichung des gesetzten Zieles, während die Wirkung bei Schweineinsulin fast vernachlässigt werden kann.

In Fig. 2 entsprechen die Kurven 5, 6 und 7 der Löslichkeit von Rinderinsulin ohne Konservierungsmittel bzw. in Gegenwart von 0,3 Gewichtsprozent m-Kresol bzw. in Gegenwart von 0,1 Gewichtsprozent des bekannten Konservierungsmittels Methyl-p-hydroxybenzoaL Die Kurven zeigen, daß die Zugabe von Methyl-p-hydroxybenzoai für die erfindungsgemäßen Zwecke ziemlich ungeeignet ist und bestätigen im übrieen die bereits durch die Kurven I und 2 in F i g. 1 bewiesene Tatsache d. h_ daß die Zugabe der Phenolverbindung m-Kresol die Löslichkeit von Rinderins'ilin in auffallend starkem Maße begünstigt.

In den folgenden Beispielen wird die Herstellung einer Reihe von erfindungsgemäßen Lösungen aus den entsprechenden Ausgangsmaterialien beschrieben.

Beispiel 1

Kristallisiertes Rinderinsulin (80 0001E) mit 0.5 Gewichtsprozent Zn wurde in 300 era' Wasser enthaltend 4cm^J In-HCl gelöst. Diese Lösung wurde mit 500 cm³ einer Lösung von 3 g m-Kresol und 15 g Glycerin und 200 cm³ einer m/15 Natriumphosphatpufferlösung (pH 7,75) versetzt. Gegebenenfalls wurde die Lösung mit In-NaOH oder In-HCI auf pH-Wert 7,00 bis 7.20 eingestellt und dann steril filtriert.

Beispiel 2

Kristallisiertes Rinderinsulin (40 000 IE) mit 1 Gewichtsprozent Zn wurde in 300 cm³ Wasser entnaltend

2 cm³ In-HCl gelöst und mit 500 cm³ e'ner Lösung von

3 g m-Kresol und 50 g Glukose sowie mit 200 cm³ einer m/15 Natriumphosphatpufferlösung (pH 7,00) versetzt. Gegebenenfalls wurde die Lösung mit In-NaOH oder In-HCl auf pH-Wert 6,75 bis 6,95 eingestellt und dann steril filtriert.

Beispiel 3

Amorphes Rinderinsulin (40 000 IE) mit 0,1 Gewichtsprozent Zn wurde in 300 cm³ Wasser enthaltend 2 cm³ In-HCI gelöst und mit 500 cm³ einer Lösung von 2,5 g Phenol und 16 g Glycerin sowie mit 200 cm³ einer m/15 Natriumphosphatpufferlösung (pH 7,90) versetzt. Gegebenenfalls wurde die Lösung mit 1 n-NaOH oder ! n- HCI auf pH-Wert 7,30 bis 7,50 eingestellt und dann steril filtriert.

Beispiel 4

Kristallisiertes Rinderinsulin (40 0001 E) mit 0,5 Gewichtsprozent Zn wurde in 300 cm³ Wasser enthaltend 2 cm³ In-HCI gelöst und mit 500 cm³ einer Lösung von 2,5 g Phenol und 16 g Glycerin sowie mit 200 cm³ einer m/15 Natriumphosphatpufferlösung (pH 7,30) vermischt. Gegebenenfalls wurde die Lösung mit In-NaOH oder In-HCI auf pH-Wert 7,10 bis 7,30 eingestellt und dann steril filtriert.

Beispiel 5

Amorphes Rinderinsulin (40 000 IE) mit 0,7 Gewichtsprozent Zn wurde in 300 cm³ Wasser enthaltend 0,6 cm³ In-NaOH gelöst und mit 500 cm³ einer Lösung von 3 g m-Kresol und 16 g Glycerin sowie mit 200 cm³ einer 0,05 m-Natriumacetatpufferlösung (pH 7,50) versetzt. Hierauf wurde die Lösung gegebenenfalls mit In-HCI oder In-NaOH auf pH-Wert 7,50 bis 7,70 eingestellt und dann steril filtriert.

Beispiel 6

Kristallisiertes Rinderinsulin (40 000 IE) mit 1 Gewichtsprozent Zn wurde in 300 cm³ Wasser enthaltend 2 cm³ In-HCI gelöst. Diese Lösung wurde mit 500 cm¹ einer Lösung von 3 g m-Kresol und 16 g Glycerin sowie

20OcHi¹ einer 0.05 m-Natriumcilratlösung versct/t u'··' mit etwa 2.4 cm¹ In-NaOH auf pH-Wert 7.40 bis /
eingestellt und hierauf steril filtriert.

Beispiel 7

Amorphes Rinderinsulin (40 000 III) mit 0.5 Gewichtsprozent Zn wurde in 300 cm¹ Wasser enthaltend 0.4 cm' In-NaOH gelöst und mit 500cm¹ einer Lösung von 3 g m-Kresol und 16 g Glycerin und mit 200 cm¹ einer m/15 Natriumphosphatlösung (pH 6.75) versetzt. Hierauf wurde die Lösung gegebenenfalls mit In-NaOH oder In-HCI auf pH-Wert 6,90 bis 7.10 eingestellt und dann steril filtriert.

Beispiel 8

Amorphes Rinderinsulin (40 000 IE) mit 0,5 Gewichtsprozent Zn wurde in 200 cm' einer m/15 Lösung von sekundärem Natriumphosphal (pH 8,73) gelöst, mil 500 cm¹ einer Lösung von 3 g m-Kresol und 16 g Glycerin versetzt und das Volumen mit Wasser enthaltend 6.6 cm' In-HCI auf 1000cm' aufgefüllt. Die Lösung wurde gegebenenfalls mit In-NaOH oder In-HCI auf pH-Wert 6,90 bis 7,10 eingestellt und dann steril filtriert.

Beispiel 9

Kristallisiertes Rinderinsulin (40 000 IE) mit 0,5 Gewichtsprozent Zn wurde in 300 cm³ Wasser enthaltend lOcm³ 2 m-HjPO« gelöst. Hierzu wurden 500 cm¹ einer Lösung von 3 g m-Krcsol und 16 g Glycerin gegeben. Die Lösung wurde mit etwa 30.4 cm³ InNaOH auf pH-Wert 6,90 eingestellt, auf 1000cm³ Gesamtvolumen verdünnt und steril filtriert (pH 6.90 bis 7.10).

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Palentansprüche:

1. Schnell wirkende, beständige, durch Phosphat-, Citrat- oder Acetatpuffer auf pH 6,5 bis 8 eingestellte Zink enthaltende Rinderinsulinlösung, dadurch gekennzeichnet, daß sie Phenol und/oder m-Kresol in Mengen von 0,15 bis 0,5 Gewichtsprozent in der mit Glycerin oder Glucose oder einem ähnlichen Kohlenhydrat, das in wäßriger Lösung nicht elektrolytisch dissoziiert ist, isotonisch eingestellten Lösung enthält.

2. Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,3 bis 0,8% Zink enthält, bezogen auf das Insulingewicht.