NO122090B

NO122090B -

Info

Publication number: NO122090B
Application number: NO0736/68A
Authority: NO
Inventors: C Krayenbuehl; M Schou
Original assignee: Nordisk Insulinlab
Priority date: 1967-03-01
Filing date: 1968-02-28
Publication date: 1971-05-18
Also published as: US3584121A; CH561066A5; NL6802798A; DE1667900B2; BE711554A; SE385769B; DK116527B; NL157208B; GB1222100A; DE1667900A1; FR1556052A; DE1667900C3

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av en hurtigvirkende, holdbar, nøytral oppløsning av rent, krystallinsk

okseinsulin eller okseinsulin som ved tilsetning av Zn er krystalliserbar i vann, eller blandinger av

slik okseinsulin og insulin av annen opprinnelse.

Holdbare, noytrale oppløsninger av insulin har sammenlignet med insulinopplosninger som har en pH-verdi på 3-4 ("alminnelig insulin"), visse terapeutiske fordeler, idet de dels har en noe hurtigere innsettende virkning, som i enkelte tilfeller er tillagt klinisk be-tydning, dels kan få en utvidet anvendelse ved blanding av suspensjoner av insulin eller insulinforbindelser med pH-verdi omkring noy-tralpunktet, som gir en forsinket virkning ved injeksjon, for dermed å danne injéksjonsblandinger, i hvilke de bibeholder deres hurtig innsettende virkning mens den suspenderte insulin eller insulinfor-bindelse stadig forblir langsomt resorberbar. Videre er nSytralt, opplost insulin bedre egnet til intravenos inngivelse enn surt, opplost insulin. Med noytral skal det i det folgende, når intet annet

er anfort, forståes pH-verdier fra 6.5-8.

Holdbare, noytrale insulinopplosninger med hurtig begynnende virkning har hittil vært fremstilt som oppløsninger av svineinsulin og dette har flere årsaker. Således er svineinsulin noen steder, f.eks. i Danmark, tilgjengelig i stor mengde og dessuten har man hatt den oppfatning at den ovre, iso-elektriske utfellingsgrense for svineinsulin i motsetning til insulin fremstilt av pankreas av okser og kalver, i det folgende omtalt som okseinsulin, ligger tilstrekkelig langt under blodets pH til at man derved oppnår sikkerhet for at det ikke ved henstand på grunn av mindre reaksjonsendringer, forekommer en insulinutfelling i oppløsningen. Denne oppfatning har funnet stotte i at det ut fra okseinsulin kan fremstilles suspensjoner av insulinkrystaller ved noytral reaksjon, som er langsomt resorberbare.

Det er imidlertid også behov for å kunne anvende okseinsulin som bestanddel i en noytral opplosning av insulin, blant annet fordi okseinsulin fremstilles i vesentlig storre mengde enn svineinsulin.

Okseinsulin har imidlertid den for fremstillingen av holdbare, noytrale oppløsninger, som kan anvendes i terapien for injek-sjonsformål, uheldige egenskap at det under visse betingelser er vesentlig mindre opploselig enn svineinsulin. Foreliggende oppfinnelse bygger på den antagelse at det måtte være mulig ved fremstilling av en slik opplosning å gi opplosningsmidlet en sammensetning ved hvilken det kompenseres for denne mindre opploselighet. Denne antagelse har vist seg å holde stikk og oppfinnelsen går således ut på en fremgangsmåte til fremstilling av en hurtigvirkende, holdbar, noytral opplosning av rent, krystallinsk okseinsulin eller okseinsulin som ved tilsetning av Zn er krystalliserbart i vann, eller blandinger av sådan okseinsulin og insulin av annen opprinnelse, under tilsetning av et aromatisk stoff tilhorende fenolgruppen.

Fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at det aromatiske stoff tilhorende fenolgruppen tilsettes opplosninger av det angjeldende insulin i en konsentrasjon i hvilken det virker opploselighetsfremmende for insulinkrystaller og som ligger mellom grensene 0.15 og 0.5 g per 100 ml, og at opplSsningen ved tilsetning av en puffer bibringes en pH-verdi mellom 6.5 og 8, idet det tilsettes andre for frembringelse av en til injeksjon brukbar opplosning egnede stoffer og eventuelt Zn-ioner.

Herved oppnåes det tilsiktede formål, idet det har vist seg at det ved tilsetning av et aromatisk stoff av den angitte type i den angitte konsentrasjon, til okseinsulin som inneholder sink i den for dets krystallisering nodvendige mengde, oppnåes å bringe dettes ut-fellingssone ned under pH = 6.5 og bibringe oppløsningen en fullsten-dig fysisk stabilitet over lengre tid.

Det er overraskende at stoffer fra fenolgruppen, som har vært kjent som konserveringsmidler, kan ha denne virkning, idet man i erfaringene fra den tidligere anvendelse av slike konserveringsmidler kun har kunnet finne stotte for den oppfatning at de utover en motsatt virkning, nemlig den å fremme krystalliseringstendensen hos visse insulinforbindelser som f.eks. protamininsulin og sink-protamininsulin. Det er endog angitt at de nevnte konserveringsmidler kan gjore seg gjeldende ved selve insulinets krystallisering, ihvertfall innenfor visse intervaller for insulinets sinkinnhold. Ytterligere har det vist seg at visse andre konserveringsmidler som er alminnelig anvendte i insulinopplosninger, som f.eks. metyl- eller etyl-hydroksybenzoat, ikke har denne virkning, men tvertimot nedsetter okseinsulinets opploselighet ved pH-verdier som ligger over den ovre grense for det iso-elektriske utfellingsområde.

Det har vist seg at et innhold i vevisotonisk konsentrasjon av natriumklorid og lignende, i vandig medium sterkt dissosierte elektrolytter, i meget hoy grad nedsetter oppløsningens stabilitet og derfor må unngåes. For oppnåelse av dette er en særlig viktig"utforelsesform av fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen kjennetegnet ved at det som hjelpestoff for frembringelse av isotoni med blod- og vevs-væske tilsettes glycerol eller karbohydrater slik som glukose.

Merkelig nok har man kunnet konstatere at et innhold av natriumfosfat i opplosningen ikke nedsetter okseinsulinets opploselighet i tilfelle av oppløsninger av den foreliggende type, men tvert imot under de gitte betingelser og i den for terapeutiske formål alminnelig benyttede konsentrasjon, i motsetning til visse andre puffer-stoffer foroker oppløsningens stabilitet ved å medfore ytterligere forhoyet opploselighet av okseinsulinet. En fremgangsmåte som utgjor en utforelsesform av foreliggende oppfinnelse er derfor kjennetegnet ved at det som puffer tilsettes natriumfosfat. Herved oppnåes i forbindelse med den nevnte forokelse av oppløsningens stabilitet en god puffervirkning.

Det har videre vist seg at man, dersom insulinet har et meget lavt innhold av sink, bare såvidt oppnår den onskede opploselighet hvis pH-verdien ligger i området 6.5-7» og at man derfor ved

t

insulin med sådant metallinnhold fortrinnsvis bor benytte oppløsninger med pH-verdi mellom 7 og 8.

En spesielt hensiktsmessig utforelsesform for foreliggende fremgangsmåte er kjennetegnet ved at det i forbindelse med fosfatpuffer og fenol eller m-kresol tilsettes sink til et totalinnhold av 0.3 - 0.8 % Zn, beregnet i forhold til insulinmengden.

Oppfinnelsen skal i det folgende nærmere forklares, dels i forbindelse med tegningen som viser noen opploselighetskurver, og dels gjennom et antall utforelseseksempler.

På tegningen viser

fig. 1 en sammenligning mellom opploselighetskurver for okse- og svineinsulin med og uten innhold av m-kresol,

fig. 2 en sammenligning mellom opploselighetskurver for samme okseinsulin med og uten tilstedeværelse av forskjellige konserveringsmidler.

Såvel i fig. 1 som i fig. 2 angir abscissen oppløsningens pH-verdi og ordinaten hvor mange prosent av den tilstedeværende insulin som ved den angjeldende pH-verdi befinner seg i opplosning etter et dogns henstand ved 20°C. Man har i begge figurer gått ut fra opp-løsninger inneholdende det angjeldende insulin i en konsentrasjon av 40 internasjonale enheter (TE), per ml. I begge tilfelle inneholder mediet som puffer M/75 fosfatpuffer og som hjelpemiddel for tilveie-bringelse av isotoni med legemsvæske 1.6 % vekt/volum glycerol. Det er anvendt krystallinsk insulin med et innhold av 0.7 % vekt/vekt sink.

I fig. 1 refererer kurvene 1 og 2 seg til okseinsulin, kurvene 3 °S 4 til svineinsulin. Ved kurve 1 og 3 inneholder oppløs-ningen intet konserveringsmiddel, ved kurven 2 og 4 dreier det seg derimot om insulinopplosninger inneholdende 0.3 % vekt/volum m-kresol.

Ved sammenligning av kurvene fremgår det at okseinsulin, når det ikke er konserveringsmiddel tilstede, har et meget bredt utfellingsområde og at det, med den angitte sammensetning, ikke er mulig å oppnå en klar opplosning med lavere pH-verdi enn ca. 7.1. Dette gir erfaringsmessig ikke tilstrekkelig sikkerhet for unngåelse av utfell-inger under normal oppbevaring av en noytral okseinsulinopplosning. Derimot har både svineinsulin og okseinsulin et langt smalere utfellingsområde når det er m-kresol tilstede. For okseinsulinets vedkomm-ende har tilsetning av dette konserveringsmiddel en slående og for formålet avgjorende virkning, mens virkningen for svineinsulinets ved-kommende er ubetydelig. Det er likevel klart at svineinsulin ikke-får dårligere opploselighet som folge av kresoltilsetningen under de om-talte betingelser, og av dette kan man trekke den slutning at oppløs-ningen meget vel kan inneholde en blanding av okseinsulin med svineinsulin og muligens også andre insulinarter, dersom dette måtte være onskelig.

I fig. 2 viser kurvene 5> 6 og 7 opplo.seligheten av okseinsulin henholdsvis'uten tilsetning av konserveringsmiddel, ved tilsetning av 0.3 % vekt/volum m-kresol, og ved tilsetning av 0.1 % vekt/volum av det velkjente konserveringsmiddel metyl-p-hydroksybenzoat. Kurvene viser at tilsetningen av metyl-p-hydroksybenzoat, som ikke er noen fenolforbihdelse, er temmelig uvirksom for formålet, men bekrefter forovrig gjennom forlopet av kurvene 5 °g 6 det faktum som allerede er illustrert i fig. 1 ved kurvene 1 og 2, at tilsetningen av fenolforbindelsen m-kresol fremmer opploseligheten av okseinsulin i stor og for oppfinnelsens formål tilstrekkelig grad.

Folgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

Krystallinsk okseinsulin tilsvarende 80 000 IE inneholdende 0.5 % vekt/vekt Zn, opploses i 300 ml vann inneholdende 4 ml 1 N HC1. Til dette tilsettes 500 ml. av en opplosning av 3 g m-kresol og 16 g glycerol og 200 ml av en M/l5 opplosning av natriumfosfatpuffer (pH 7.75). Opplosningen etterstilles eventuelt med 1 N NaOH eller 1 N HC1 til pH 7.00 - 7.20 og sterilfiltreres.

Eksempel 2

. Krystallinsk okseinsulin tilsvarende 40 000 IE inneholdende 1 % vekt/vekt Zn, opploses i 300 ml vann inneholdende 2 ml 1 N HC1. Til dette tilsettes 500 ml av en opplosning av 3 g m-kresol og 50 g glukose og 200 ml av en M/l5 opplosning av natriumfosfatpuffer (pH 7.00). Opplosningen etterstilles eventuelt med 1 N NaOH eller 1 N HC1 til pH 6.75 - 6.95 og sterilfiltreres.

Eksempel 3

Amorft okseinsulin tilsvarende 40 000 IE inneholdende 0.1 % ■ vekt/vekt Zn opploses i 300 ml vann inneholdende 2 ml 1 N HC1. Til dette tilsettes 500 ml av en opplosning av 2.5 g fenol og 16 g glycerol og 200 ml av en M/15 opplosning av natriumfosfatpuffer (pH 7.90). Opplosningen etterstilles eventuelt med 1 N NaOH eller 1 N HC1 til pH 7.30 - 7.50 og sterilfiltreres.

Eksempel 4

Krystallinsk okseinsulin tilsvarende 40 000 IE inneholdende 0.5 % vekt/vekt Zn opploses i 300 ml vann inneholdende 2 ml 1 N HC1. Til dette tilsettes 500 ml av en opplosning av 2.5 g fenol og 16 g glycerol og 200 ml av en M/15 opplosning av natriumfosfatpuffer (pH 7.30). Opplosningen etterstilles eventuelt med 1 N NaOH eller 1 N HG1 til pH 7.10 - 7.30 og sterilfiltreres.

" Eksempel 5

Amorft okseinsulin tilsvarende 40 000 IE inneholdende 0.7 % vekt/vekt Zn opploses i 300 ml vann inneholdende 0.6 ml 1 N NaOH. Til dette tilsettes 500 ml av en opplosning av 3 g m-kresol og 16 g glycerol og 200 ml av en 0.05 M opplosning av natriumacetatpuffer fpH 7.5O). Opplosningen etterstilles eventuelt med 1 N HG1 eller 1 N

NaOH til pH 7.5O - 7.70 og sterilfiltreres.

Eksempel 6

Krystallinsk okseinsulin tilsvarende 4-0 000 IE inneholdende

1 % vekt/vekt Zn opploses i 300 ml vann inneholdende 2 ml 1 N HG1.

Til dette tilsettes 500 ml av en opplosning av 3 g m-kresol og 16 g glycerol og 200 ml av en 0.05 M opplosning av natriumcitrat og ca.

2.4 ml 1 N NaOH til pH 7.4O - 7.60 og sterilfiltrering foretas.

Eksempel 7

Amorft okseinsulin tilsvarende 40 000 IE inneholdende 0.5 % vekt/vekt Zn opploses i 300 ml vann inneholdende 0.4 ml 1 N NaOH. Til dette tilsettes 500 ml av en opplosning av 3 g m-kresol og 16 g glycerol og 200 ml av en M/15 opplosning av natriumfosfat fpH 6.75^• Opplosningen etterstilles eventuelt med 1 N NaOH eller 1 N HG1 til pH 6.9O - 7-10 og sterilfiltreres.

Eksempel 8

Amorft okseinsulin tilsvarende 40 000 IE inneholdende 0.5 % vekt/vekt Zn opploses i 200 ml av en M/l5 opplosning av sek. natriumfosfat (pH 8.73). Til dette tilsettes 500 ml av en opplosning av 3 g m-kresol og 16 g glycerol og vann inneholdende 6.6 ml 1 N HC1 til et samlet volum på 1000 ml. Opplosningen etterstilles eventuelt med 1 N NaOH eller 1 N HC1 til pH 6.9O - 7.10 og sterilfiltreres.

Eksempel 9

Krystallinsk okseinsulin tilsvarende 40 000 IE inneholdende 0.5 % vekt/vekt Zn og opploses i 300 ml vann inneholdende 10 ml 2 M H^PO,. Til dette tilsettes 500 ml av en opplosning av 3 g m-kresol

og 16 g glycerol. Opplosningen tilsettes ca. 30.4 ml 1 N NaOH til pH 6.9O, hvoretter det hele fortynnes til 1000 ml og sterilfiltreres (pH 6.90 - 7.10).

Eksempel 10

Krystallinsk svineinsulin tilsvarende 40 000 IE inneholdende 0.5 % vekt/vekt Zn opploses i 300 ml vann inneholdende 10 ml 2 M H^PO^. Til dette tilsettes 500 ml av en opplosning av 3 g m-kresol og 16 g glycerol. Opplosningen tilsettes ca. 30.4 ml 1 N NaOH til pH 6.90 hvoretter det hele fortynnes til 1000 ml og sterilfiltreres fpH 6.90 - 7-10).

Eksempel 11

Krystallinsk insulin (50 % svin + 50 $ okse) tilsvarende

40 000 IE inneholdende 0.5 % vekt/vekt Zn opploses i 300 ml vann inneholdende 10 ml 2 M H^PO^. Til dette tilsettes 500 ml av en opplosning av 3 g m-kresol og lo g glycerol. Opplosningen tilsettes ca. 30.4 ml 1 N NaOH til pH 6.90, hvoretter det hele fortynnes til 1000 ml og

sterilfiltreres (pH 6.90 - 7.10).

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av en hurtigvirkende, holdbar, noytral opplosning av rent, krystallinsk okseinsulin eller okseinsulin som ved tilsetning av Zn er krystalliserbart i vann, eller blandinger av slik okseinsulin og insulin av annen opprinnelse, under tilsetning av et aromatisk stoff tilhorende fenolgruppen, karakterisert ved at det aromatiske stoff tilhorende fenolgruppen tilsettes til oppløsninger av det angjeldende insulin i en konsentrasjon i hvilken det virker opploselighetsfremmende for insulinkrystaller og som ligger mellom grensene 0.15 og 0.5 g per 100 ml, og at opplosningen ved tilsetning av en puffer bibringes en pH-verdi mellom 6.5 og 8, idet det tilsettes andre til frembringelse av en til injeksjon brukbar opplosning egnede stoffer og eventuelt Zn-ioner.

2. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at det som hjelpestoff for frembringelse av isotoni tilsettes glycerol eller karbohydrater slik som glukose.

3. Fremgangsmåte ifolge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det som puffer tilsettes natriumfosfat.

4« Fremgangsmåte ifolge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at det i forbindelse med fosfatpuffer og fenol eller m-kresol tilsettes sink til et totalinnhold på-0.3 - 0.8 % Zn beregnet i forhold til insulinmengden.