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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der sich wiederholenden Disaccharid- -Pentapeptid-Grundeinheit (Muropeptid) der Formel
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man den in das Kulturmedium ausgeschiedenen vorgereinigten Peptidoglykankomplex an einem Molekularsieb fraktioniert, die ersten, zu Beginn der Eluierung austretenden hochmolekularen Fraktionen, welche einem ersten Absorptionsmaximum (Maximum I) entsprechen, und sodann auch die nach dem Maximum I austretenden niedrigermolekularen Fraktionen der Inkubation mit Lysozym unterwirft, das Inkubat an Molekularsieben fraktioniert, das Produkt der Enzymhydrolyse, die Disaccharid-Pentapeptid-Einheit der Formel (I),
als homogene Substanz isoliert und diese gegebenenfalls durch Chromatographie an einer Cellulose-Säule unter Einsatz eines Äthanol-Wasser-Gemisches als Elutionsmittel weiter reinigt.
Das N-Acetyl-D-glucosaminyl-N-acetyl-D-muramyl-pentapeptid der Formel (I) kann auf diese Weise bereits nach der Fraktionierung des Inkubats an Molekularsieben in sehr reinem Zustand und in guter Ausbeute erhalten werden. Durch saure Hydrolyse des Muropeptides der Formel (I) und durch Analyse des Ninhydrin-positiven Materials im Hydrolysat wurde nachgewiesen, dass das Muropeptid der Formel (I) ausschliesslich aus Peptidoglykan-Komponenten besteht, d. h. aus D-Glucosamin, D-Muraminsäure, L- und D-Alanin (Molverhältnis 1 : 2), D-Glutaminsäure und meso-Diaminopimelinsäure im stöchiometrischen Verhältnis 1 : 1 : 3 : 1 : 1 zueinander.
Es ist ferner gefunden worden, dass im Produkt der Formel (I) die beiden Amino-monosaccharidreste N-acetyliert sind, dass D-Muraminsäure eine der Zuckerkomponenten ist und diese Komponente eine freie, reduzierend wirkende Gruppe aufweist.
Zweckmässig geht man erfindungsgemäss so vor, dass man pro 100 mg des durch Fraktionierung des vorgereinigten Peptidoglykankomplexes erhaltenen Materials 8 bis 10 mg Lysozym einsetzt und
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bei PH 7, 0 bei 38 C und während 24 h, erfolgt.
Die Inkubation kann beispielsweise in 0, 1 Mol Ammoniumacetat- oder Phosphatpufferlösung vorgenommen werden.
Das Lysozyminkubat wird vorteilhaft an einer Sephadex G-50-Säule mit 0, 1 Mol Lithiumchlorid als Eluens chromatographiert, wobei die Polymeren mit Nichtpeptidoglykanstruktur von den durch enzymatische Spaltung entstandenen Produkten und vom Lysozym getrennt werden.
Vor dem Aufbringen auf die mit Dextrangel (Sephadex G-50) gefüllte Säule kann das Inkubat konzentriert werden. In späteren Fraktionen treten niedrigermolekulare Produkte und Lysozym selbst entsprechend einem breiten Absorptionsmaximum aus.
Das Gemisch der durch enzymatische Hydrolyse entstandenen Produkte und des Lysozyms wird vorzugsweise an einer Dextrangel- (Sephadex G-25-) Säule chromatographiert, wobei die Disaccharid- - Pentapeptid-Grundeinheit von Peptidoglykanfragmenten mit grösserem Molekulargewicht sowie vom Lysozym getrennt wird.
Zur weiteren Reinigung des Muropeptides der Formel (I) durch Chromatographie an einer Cellulose-Säule kann das als Elutionsmittel eingesetzte Äthanol-Wasser-Gemisch ein Volumsverhältnis von 7 : 3 aufweisen.
Die Vorteile des erfindungsgemässen Verfahrens liegen im Einsatz des preiswerten und leicht zugänglichen ausgeschiedenen Peptidoglykankomplexes als Ausgangsstoff und in der Isolierung des Produktes nach der Lysozymhydrolyse, welche die vollständige Entfernung der Polymeren von Nichtpeptidoglykanstruktur, des Lysozyms selbst sowie der Peptidoglykanfragmente, die höheres Molekulargewicht als die Grundeinheit aufweisen, ermöglicht. Das Disaccharid-Pentapeptid der Formel (1), welches in einer Ausbeute von 25 bis 45%, bezogen auf das Material, das an der Enzymspaltung teilnimmt, erhalten wird, ist ein weisses, schwach hygroskopisches, flockiges Produkt.
Durch präliminare Untersuchungen der Adjuvans-Wirkung des Disaccharid-pentapeptides der Formel (I) wurde festgestellt, dass dieses Produkt der Enzymspaltung des Peptidoglykanpolymeren eine immunostimulierende Wirkung aufweist, d. h. Adjuvans-Wirkung besitzt.
Die Erfindung wird an Hand folgender Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1 : Herstellung der Grundeinheit der Formel (1) des Peptidoglykanpolymeren mittels Enzymspaltung des hochmolekularen Materials aus der dem Maximum I entsprechenden Fraktion.
Als Ausgangssubstrat für die Inkubation wird das hochmolekulare Material verwendet, welches durch Fraktionierung des vorgereinigten Peptidoglykankomplexes auf einer Sephadex G-50-Säule (Maximum I) erhalten und dann auf einer Sephadex G-25-Säule gemäss der Vorschrift von D. Keglevic
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et al. (Eur. J. Biochem. 42 [1974], Seiten 389 bis 400) entsalzt wurde.
Man löst 100 mg Substrat in 50 ml 0, 1 Mol Ammoniumacetatpuffer eines PH-Wertes von 7, 0, setzt 10 mg Lysozym (Hersteller :
Firma Sigma, Grade I, aus Hühnereiweiss) zu und hält die Lösung 24 h bei 38OC. Das Inkubat wird im Rotationsverdampfer im Vakuum einer Wasserstrahlpumpe (Temperatur des Wasserbades < 38 C) auf etwa 3 ml konzentriert und das Konzentrat auf eine mit 0, 1 Mol Lithiumchlorid vor- gespülte Sephadex G-50-Säule (70 x 2, 5 cm) aufgebracht. Die Elution (Fraktionen 3 ml/6 min) er- folgt mit einer Lösung gleicher Zusammensetzung und der Austritt der Komponenten wird durch
Messung der Absorption bei 230 nm verfolgt.
Das Elutionsprofil weist zwei Maxima auf :
1. ein kleines Maximum nach einer Durchflussmenge, wo das reine Elutionsmittel, das nicht gespaltene Polymere mit den von Peptidoglykanstruktur verschiedenen Strukturen enthält, endet ;
2. ein grosses breites Maximum, das bei späteren Fraktionen auftritt, welche die Produkte der Enzymspaltung und Lysozym selbst enthalten.
Die dem 2. Maximum entsprechenden Fraktionen werden gesammelt, konzentriert, und das Konzentrat wird auf eine mit Wasser eluierte (Fraktionen 3 ml/6 min) Sephadex G-25-Säule (80 x 2, 5 cm) aufgebracht. Das Elutionsprofil gemäss Absorption bei 230 nm weist drei Maxima auf.
1. ein kleines Maximum, das den von der Grundeinheit der Formel (I) unterschiedlichen grö- sseren Peptidoglykanfragmenten zuzuordnen ist ;
2. ein grosses Maximum, das im Bereich von 250 bis 300 ml Eluat auftritt und eluiertes
Disaccharid-Pentapeptid der Formel (I) signalisiert ;
3. ein Maximum, das nach 350 ml Eluat erscheint und Lysozym und Salze kennzeichnet.
Die dem 2. Maximum entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Disaccharid-Pentapeptid der Formel (I) verbleibt in Form eines weissen flockigen Niederschlages. Die Ausbeute beträgt 35 bis 45 mg (35 bis 45%, bezogen auf die zur Inkubation eingesetzte Menge an Ausgangssubstrat).
Beispiel 2 : Als Ausgangsstoff für die Herstellung der Disaccharid-Pentapeptid-Einheit der Formel (I) kann der ausgeschiedene Peptidoglykankomplex, unabhängig von der Zeitspanne, innerhalb welcher er in die Fermentunterlage des submers kultivierten Mikroorganismus ausgeschieden wird, beispielsweise 1, 3,12 oder 24 h nach Beginn der Kultivierung, eingesetzt werden.
Beispiel 3 : Das Verfahren zur Herstellung der Disaccharid-Pentapeptid-Einheit der Formel (I) führt zu ähnlichen Ergebnissen, wenn Material mit niedrigerem Molekulargewicht verwendet wird, welches bei der Fraktionierung des gereinigten Peptidoglykankomplexes auf einer Sephadex G-50-Säule mit 0, 1 M Lithiumchlorid in Fraktionen nach Maximum I austritt.
Beispiel 4 : Die Disaccharid-Pentapeptid-Einheit der Formel (I) wird durch Chromatographie auf einer Cellulose-Säule gereinigt. Das Muropeptid der Formel (1) (35 mg) wird in 0, 5 ml ÄthanolWasser-Gemisch (7 : 3, v/v) gelöst und auf eine aus einer Suspension von 20 g Cellulose (Hersteller : Firma Whatman, Standard Grade) mit demselben Lösungsmittel vorbereitete Cellulose-Säule (47 x 1, 5 cm) aufgebracht. Der Elutionsverlauf bzw. der Produktgehalt des austretenden Gemisches von Äthanol und Wasser (7 : 3) (Fraktionen 1, 2 ml/20 min) wird durch Absorptionsmessung bei 230 nm verfolgt. Das Produkt der Formel (I) tritt im Bereich von 35 bis 45 ml Eluatvolumen entsprechend einem scharfen Absorptionsmaximum aus.
Die dem Maximum entsprechenden Fraktionen werden vereinigt, auf einem Rotationsverdampfer konzentriert und das wässerige Konzentrat lyophilisiert, wobei 30 mg (85%) der Disaccharid-Pentapeptid-Grundeinheit der Formel (I) als weisses flockiges Pulver erhalten werden.
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