DE69122105T2 - Verfahren zur Erlangen von Monosialogangliosiden - Google Patents
Verfahren zur Erlangen von MonosialogangliosidenInfo
- Publication number
- DE69122105T2 DE69122105T2 DE69122105T DE69122105T DE69122105T2 DE 69122105 T2 DE69122105 T2 DE 69122105T2 DE 69122105 T DE69122105 T DE 69122105T DE 69122105 T DE69122105 T DE 69122105T DE 69122105 T2 DE69122105 T2 DE 69122105T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- mixture
- water
- solution
- methanol
- chloroform
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 24
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 claims abstract description 5
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 claims description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 7
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 claims description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims description 4
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 8
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 8
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 5
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical group CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N (-)-D-erythro-Sphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCC=CC(O)C(N)CO WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 description 2
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 2
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N ganglioside GM1 Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N sphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](N)CO WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N 0.000 description 2
- CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 5-amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulopyranosonic acid Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229910014033 C-OH Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910014570 C—OH Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical class O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001338 aliphatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.ClC(Cl)Cl SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 125000000350 glycoloyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000005171 mammalian brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000013557 residual solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01018—Exo-alpha-sialidase (3.2.1.18), i.e. trans-sialidase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erlangung des Monosialogangliosids GM1 (ein Glycosphingolipid, das einen an Monosaccharid-Kopfgruppen gebunden Sialsäure-(N- Acetylneuraminsäure)Teil aufweist, das dem polaren Kopf bei neutralem pH eine Nettoladung gibt und außerdem einen nichtpolaren Kohlenstoffteil aufweist) aus Produkten, die eine Gangliosidmischung enthalten.
- Glycosphingolipide werden in großer Menge zusammen mit anderen Lipiden (z. B. Phospholipiden) in Säugetierhirnen, vor allen Dingen im Cortex gefunden. Bei Rindern ist der Gehalt an Glycosphingolipiden hoch genug, um sie daraus zu kommerziellen Zwecken zu extrahieren. In einer chemischen Zusammensetzung dieser Bestandteile sind Einheiten von Monosacchariden, Sialsäure und ein nichtpolares Fragment, das Ceramid vorhanden, das aus einem natürlichem Aminoalkohol dem Sphingosin, das eine Amidbindung mit Fettsäuren bildet, besteht. Die Einheiten der Monosaccharide sind vor allem Galactose, Glucose und eine Aminohexose, das N-Acetylgalactosamin. Außerdem enthalten sie N-acetyl(und/oder Glycolyl)-Neuraminsäure (Sialsäure). Alle Glycosphingolipide, die eine solche Säure enthalten, gehören zu der Gruppe der sauren Glycosphingolipide und sie werden unter dem speziellen Namen der Ganglioside klassifiziert. Mehr als 60 verschiedene Gangliosidmoleküle, die verschiedene Strukturen aufweisen, sind gefunden worden. Abhängig von der Anzahl von Sialsäureeinheiten werden sie als Monosialoganglioside, Disialoganglioside, Trisialoganglioside und Tetrasialoganglioside gruppiert, die kurz als GM, GD, GT, bzw. GQ bezeichnet werden. Das Nichtvorhandensein des letzten Sialsäurerests erzeugt GA1, ein Asialosphingolipid von GM1. Ein numerischer Suffix, N (entsprechend 5-n, wobei n die Anzahl der Einheiten von neutraler Hexose bedeutet) wird hinzugefügt. Die Buchstaben (in der Regel a, b) bedeuten die Komponenten, die eine Isomerie im Verhältnis zu den Positionen der Sialsäurebestandteile ausüben, mit charakteristischen Eigenschaften für diese Isomere, z. B. unterschiedliche Rf- Werte in Dünnschichtchromatographien. Als Beispiel: GD1b bedeutet ein Disialogangliosid, worin n = 4 und worin der Sialsäurebestandteil isomer in Beziehung zu GD1a ist. So ist also GM1 ein Bestandteil, der durch eine Sialsäureeinheit gebildet wird, sowie 4 Hexoseeinheiten. Dieses Kohlenstoffragment ist an ein Ceramid gebunden. Es besteht aus einem Sphingosin, das eine Amidbindung mit einem Fettsäurefragment bildet. Mehr als eine Fettsäure wurde durch HPLC identifiziert. Sie sind im wesentlichen vom C&sub1;&sub8;- und C&sub2;&sub0;- Typ. (Hiroki NAKABAEYASHI, Masao IWAMORI und Yoshitaka NAGAI), J. Biochem., 96, 977-984 (1984). Die Struktur des GM1 ist in einer beigefügten Figur 1 dargestellt und außerdem durch die folgende schematische Formel:
- wobei Gal = Galactose; Gluc = Glucose; NANA = N-Acetylneuraminsäure; Gal Nac = N-Acetyl-Galactosamin bedeutet. In der beigefügten Figur 2 ist das IR-Spektrum von GM1 dargestellt, in dem charakteristische Peaks entsprechend den C-C-, C-OH-, C-H-, N-C- und N-H-Bindungen angezeigt sind.
- Die molekulare Formel lautet: C&sub7;&sub3;H&sub1;&sub3;&sub1;O&sub3;&sub1;N&sub3; (im Überfluß vorliegende Komponente.) Gemäß der vorgeschlagenen Struktur beträgt MW 1546.80. Der Schmelzpunkt liegt bei: 207º - 232º(d).
- Das Aussehen: Weißes Puder, leicht cremig. Die Löslichkeit: löslich in Wasser. Außerdem löslich in Mischungen von Methanol- Wasser, Methanol-Chloroform und Methanol-Chloroform-Wasser. Praktisch unlöslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Chloroform, Ethylether und leichten aliphatischen Kohlenwasserstoffen (Petroleumether). Das Infrarotspektrum ist der Zeichnung zu entnehmen.
- 1) Infrarotspektrum überlagerbar auf den Standard.
- 2) Es muß eine Koinzidenz der Rf-Werte mit einer authentischen Probe unter Verwendung von Dünnschicht Chromatographie in den verschienden Systemen dieses Patents vorliegen.
- Das lyphilisierte Produkt darf nicht mehr als 0,5 % Wasser enthalten.
- Es sollte nicht mehr davon als 0,1 % enthalten.
- Der Schmelzpunkt darf nicht absinken, wenn die Substanz mit einer authentischen Probe gemischt wird.
- Das Monosialogangliosid GM1 ist in natürlicher Mischung in einer Konzentration von 20 Gew.-% aufzufinden. Deshalb ist die Erlangung von GM1 durch Isolierung ökonomisch nicht attraktiv. Die Transformation der Mischung von Gangliosiden GM1 durch enzymatische oder chemische Hydrolyse ist das geeignetste industrielle Verfahren. In der DE-A-3624816 wird ein chemisches Verfahren zur Erlangung von GM1 beschrieben, worin die Sialsäure zunächst in Einheiten getrennt wird, die Di- und Tri- Sialoganglioside, die in der natürlichen Mischung vorliegen mit gelösten anorganischen oder organischen Säuren hydrolysieren; danach werden die so erhaltenen Bereiche chromatographisch aufgetrennt und in Silicagelsäuren gereinigt. Es gibt jedoch zugängliche Literatur über die Verwendung von Enzymen bei dieser Transformation. Sowohl die enzymatischen als auch die chemischen Verfahren basieren auf der kinetischen Kontrolle der Reaktion. Die Transformationsrate von GT in GD und GM1 ist hoch. Dagegen ist die Hydrolyserate von GM1 in GA1 niedrig. Wenn die experimentellen Bedingungen kontrolliert sind, ist es möglich, die Mischung selektiv zu hydrolisieren und GM1 mit einem hohen Ertrag zu erhalten. Die enzymatische Hypolyse unter Verwendung von Neuraminidase ist in verschiedenen Publikationen beschrieben, z. B.
- 1) Richard Kuhn et al., Chem. Ber. 96, 866 (1963),
- 2) Keiko Nohara-Uchida et al., J. Biochem., 103, 840/2 (1988),
- 3) Myers Metal, Biochem. 23, 1442/8 (1984),
- 4) Drzernick R. et al., Histochem, Journal, 5, 271/90 (1973),
- 5) Schauer R. et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 349, 961/8 (1968)
- 6) S. Hakonori et al., Biochem. 8. 5082/88 (1969),
- 7) Welger D. A. et al., J. Neurochem., 20, 607/12 (1973) und
- 8) Lipovak V. et al., J. Biol. Chem., 246, (24) , 7642 (1971).
- Die EP-A-0451267 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von GM1 aus Gangliosiden unter Verwendung des Neuraminidase Isozym S aus Bakterien der Gattung Arthrobacter, worin eine wässrige Lösung, die die Ganglioside enthält und ein Puffer (pH 3-6) mit einer wässrigen Lösung der Neuraminidase inkubiert wird, gefolgt von einer Extraktion des GM1 mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol und einer Lyophilisation.
- Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., Vol 358, No. 7, 1977, Seiten 789 - 795 offenbart die Immobilisierung von Neuraminidase aus Clostridium perfringens, die erhöhte Stabilität unter verschiedenen Bedingungen des immobilisierten Enzyms im Gegensatz zu dem löslichen Enzyms und die Verwendung der immobilisierten Enzyme um verschiedene Substrate, einschließlich GD1a Micellen und menschliche Erythrozyten, zu spalten.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erlangung von Monosialogangliosiden (GM1) aus einer wässrigen Lösung, die eine Gangliosidmischung enthält, vorgestellt, durch Inkubation der Lösung in Gegenwart von Neuroaminidase um die Di-, Tri- und/oder Tetrasialoganglioside darin zu hydrolysieren, um den GM1-Gehalt der Mischung anzureichern, wonach das GM1 aus der Reaktionslösung durch ein Verfahren extrahiert wird, das die Verwendung einer Lösungsmittelmischung aus einem aliphatischem Alkohol und einem Haloalkan und eine Lyophilisation enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation bei einem pH-Wert von 5 bis 5,5 in Gegenwart einer immobilisierten Neuroamidase aus Clostridium perfringens durchgeführt wird, die resultierende Lösung getrocknet wird, der Rest wieder in einer Lösungsmittelmischung mit einem aliphatischen Alkohol, Wasser und einem Haloalkan gelöst wird, die erhaltene Lösung einer Ausschlußchromatographie unterworfen wird, die Fraktion(en), die das GM1 enthalten, gesammelt werden, und diese Fraktion(en) lyophilisiert werden.
- In der vorliegenden Anwendung wird die Hydrolyse der natürlichen Gangliosidmischung zu GM1 durch Verwendung einer immobilisierten Neuraminidase von Clostridium perfringens bei einem pH von 5 bis 5,5 durchgeführt. Dieses Verfahren ermöglicht es, GM1 in einem sehr hohen Ertrag und großer Reinheit zu erhalten. Berücksichtigt man, daß während der Transformation der Ganglioside mit mehr als einer Sialsäureeinheit zu Monosialo, die freie Sialsäure gebildet wird, ist es notwendig, diese genauso wie Spuren von GD1, die vorliegen, wenn die enzymatische Reaktion gestoppt ist, zu eliminieren. Unter den oben beschriebenen Bedingungen dieser Erfindung ist kein GA1 vorhanden. Diese Reinigung wird durchgeführt durch eine Filtrationschromatographie über Gele (Ausschlußchromatographie), wobei mit Mischungen aus Chloroform: Methanol:Wasser eluiert wird, besonders vorzugsweise im Volumenverhältnis von 60:30:4,5. Die Passage des Transformationsprodukts durch Sephadex G50 (Sephadex G25 kann auch verwendet werden) ermöglicht es, GM1 von hoher Reinheit zu erhalten. Sephadex G50 besteht aus mit Epichlorhydrin quervernetztem Dextran. Der pH-Bereich wurde gewählt, um eine hohe Transformationsrate in einer geeigneten Zeit zu erzielen. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens ist es, daß das immobilisierte Enzym hergestellt und wieder verwendet werden kann. Auf diese Weise wird der Nachteil seines hohen Preises aufgewogen und unser Verfahren ist industriell anwendbar.
- Die enzymatische Aktivität hängt von dem pH ab, wie sich aus den folgenden Beispielen ergeben wird:
- a) Unlösliche Neuraminidase (Sigma Typ VI A), von Clostridium perfringens, gebunden an Agarose:5,3 Einheiten/g zu hydrolysierender Ganglioside.
- b) Natrium Acetat/Essigsäurepuffer, bei pH 5,0, 23,7 ml/g von hydrolysierten Gangliosiden. Inkubationstemperatur der Mischung: 37 ºC. Hydrolyseprofil:
- a) Unlösliche Neuraminidase (Sigma Typ VI A) von Clostridium perfringens gebunden an Agarose: 5,3 Einheitenig von zu hydrolysierenden Gangliosiden.
- b) Gesamtganglioside (natürliche Mischung).
- zu Beispiel 2:
- c) Natriumacetat/Essigsäurepuffer bei pH 5,3, 23,7 ml/g Ganglioside. Inkubationstemperatur der Mischung: 37 ºC. Hydrolyseprofil:
- a) Unlösliche Neuraminidase (Sigma Typ VI A) von Clostridium perfringens, gebunden an Agarose: 5,3 Einheiten/g Ganglioside.
- b) Gesamtganglioside (natürliche Mischung).
- c) Natriumacetat/Essigsäurepuffer bei pH 5,5, 23,7 ml/g Ganglioside. Inkubationstemperatur: 37 ºC. Das Hydrolyseprofil sieht wie folgt aus:
- Das Arbeitsverfahren mit dem immobilisierten Enzym kann batchweise erfolgen. Sobald die Reaktion beendet ist, verfahren wir gemäß dem folgenden Beispiel:
- Das in Agarose immobilisierte Enzym wird zentrifugiert, der Überstand, der GM1 enthält, wird abgetrennt und so gehalten, bis er gereinigt ist. Der Rest wird zweimal mit der Pufferlösung beim Arbeits-pH gewaschen und zweimal mit einer Lösung von 2,0 M (NH&sub4;)&sub2; SO&sub4;, bei pH 7,0. Es wird in diesem Medium aufbewahrt und kann mehr als fünfmal wieder verwendet werden.
- Es wird eine Lösung von GM1, wie erhalten gemäß den Beispielen 1 - 3 aus 1 g Gangliosiden (natürliche Mischung) genommen. Dieses wird in einem Rotaryverdampfer bei 40 - 50 ºC getrocknet. Der Rest wird in einer Mischung von Chloroform:Methanol:Wasser in einem jeweiligen Volumenverhältnis von 60:30:4,5 aufgenommen und die erhaltene Lösung wird durch eine Sephadexsäule G50 mit 10 g Sephadex in der oben genannten Lösungsmittelmischung gegeben. Die Fraktionen werden durch Dünnschichtchromatographie (J. Neurochem. 10, 613 (1963), J. Chromatog. 106, 425 (1975)) analysiert, aufgespürt entweder mit Resorcinolreagenz (Biochem. Biophys. Acta, 24, 604 (1957) oder mit Jod und diejenigen, die reines GM1 enthalten, werden zusammengeführt. Die gesammelten Fraktionen werden lyophilisiert.
Claims (5)
1. Verfahren zur Erlangung von Monosialogangliosiden (GM1) aus
einer wässrigen Lösung, die eine Gangliosidmischung enthält,
durch Inkubation der Lösung in Gegenwart von Neuroaminidase um
die Di-, Tri- und/oder Tetrasialoganglioside darin zu
hydrolisieren, um den GM1-Gehalt der Mischung anzureichern,
wonach das GM1 aus der Reaktionslösung durch ein Verfahren
extrahiert wird, das die Verwendung einer Lösungsmittelmischung
aus einem aliphatischem Alkohol und einem Haloalkan und eine
Lyophilisation enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die
Inkubation bei einem pH-Wert von 5 bis 5,5 in Gegenwart einer
immobilisierten Neuroamidase aus Clostridium perfringens
durchgeführt wird, die resultierende Lösung getrocknet wird,
der Rest wieder in einer Lösungsmittelmischung mit einem
aliphatischen Alkohol, Wasser und einem Haloalkan gelöst wird,
die erhaltene Lösung einer Ausschlußchromatographie unterworfen
wird, die Fraktion(en) , die das GM1 enthalten, gesammelt
werden, und diese Fraktion(en) lyophilisiert werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Ausschlußchromatographie unter Verwendung einer mit
Epichlorhydrin vernetzten Dextransäule durchgeführt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Lösungsmittelmischung eine Mischung aus Chloroform,
Methanol und Wasser ist.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß
Chloroform, Methanol und Wasser in einem Volumenverhältnis von
60:30:4,5 vorliegen.
5. Verfahren gemäß einem oder mehrer der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das immobilisierte Enzym
nach der Hydrolyse außerdem gewaschen wird und das gewaschene
immobilisierte Enzym in dem Inkubationsschritt wieder verwendet
wird.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP91310220A EP0540790B1 (de) | 1991-11-05 | 1991-11-05 | Verfahren zur Erlangen von Monosialogangliosiden |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69122105D1 DE69122105D1 (de) | 1996-10-17 |
| DE69122105T2 true DE69122105T2 (de) | 1997-02-06 |
Family
ID=8208451
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69122105T Expired - Fee Related DE69122105T2 (de) | 1991-11-05 | 1991-11-05 | Verfahren zur Erlangen von Monosialogangliosiden |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0540790B1 (de) |
| AT (1) | ATE142701T1 (de) |
| DE (1) | DE69122105T2 (de) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3703199B2 (ja) * | 1996-03-01 | 2005-10-05 | タカラバイオ株式会社 | モノシアロガングリオシドｇｍ１の製造方法 |
| US7943750B2 (en) * | 2007-06-18 | 2011-05-17 | Laboratoire Medidom S.A. | Process for obtaining pure monosialoganglioside GM1 for medical use |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2905678A1 (de) * | 1978-02-16 | 1979-12-20 | Science Union & Cie | Pharmazeutische zubereitungen auf der grundlage von bakterienenzymen |
| JPH0653764B2 (ja) * | 1985-07-31 | 1994-07-20 | 三井東圧化学株式会社 | モノシアロガングリオシドの製造法 |
| JP2724588B2 (ja) * | 1988-05-02 | 1998-03-09 | 丸金醤油株式会社 | ノイラミニダーゼ・アイソザイムｓ及びガングリオシド類の製造法 |
-
1991
- 1991-11-05 EP EP91310220A patent/EP0540790B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-05 AT AT91310220T patent/ATE142701T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-11-05 DE DE69122105T patent/DE69122105T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0540790B1 (de) | 1996-09-11 |
| DE69122105D1 (de) | 1996-10-17 |
| EP0540790A1 (de) | 1993-05-12 |
| ATE142701T1 (de) | 1996-09-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kamerling et al. | Migration of O‐acetyl groups in N, O‐acetylneuraminic acids | |
| Ghidoni et al. | On the structure of two new gangliosides from beef brain | |
| DE69232138T2 (de) | Methode zur isolation von glykosyltransferasen | |
| Ishizuka et al. | Characterization of gangliosides from fish brain | |
| EP0371414B1 (de) | Glykosphingolipide mit kopplungsfähiger Gruppe im Sphingoidanteil, ihre Herstellung und Verwendung | |
| DE69228128T2 (de) | Glycosphingolipide | |
| DE69228692T2 (de) | Methode zur enzymatischen synthese von kohlenhydraten | |
| Sugita et al. | Studies on glycosphingolipids of larvae of the green-bottle fly, Lucilia caesar I. Isolation and characterization of glycosphingolipids having novel sugar sequences | |
| Araki et al. | Characterization of a diphosphonopentaosylceramide containing 3-O-methylgalactose from the skin of Aplysia kurodai (sea hare) | |
| Dennis et al. | Glycosphingolipids in cestodes: Chemical structures of ceramide monosaccharide, disaccharide, trisaccharide and tetrasaccharide from metacestodes of the fox tapeworm, Taenia crassiceps (Cestoda: Cyclophyllidea) | |
| EP0934327A1 (de) | Saccharid-bibliothek | |
| US4868292A (en) | Preparation of monosialoganglioside | |
| Schwarting et al. | Glycolipids of murine lymphocyte subpopulations. Structural characterization of thymus gangliosides. | |
| DE69122105T2 (de) | Verfahren zur Erlangen von Monosialogangliosiden | |
| Kawamura et al. | A new procedure for the isolation of brain gangliosides, and determination of their long chain base compositions | |
| Hori et al. | Studies on Glycosphingolipids of Fresh-Water Bivalves IV. Structure of a Branched Globoside Containing Mannose from Spermatozoa of the Fresh-Water Bivalve, Hyriopsis schlegelii | |
| Slomiany et al. | Characterization of three new fucolipids from hog gastric mucosa | |
| Slomiany et al. | Characterization of two major neutral glyceroglucolipids of the human gastric content | |
| EP0368131B1 (de) | Neoglykoproteine, ihre Herstellung und Verwendung | |
| Saito et al. | Glycolipids and their developmental patterns in chick thigh and leg muscles. | |
| Sugita et al. | Studies on glycosphingolipids of fresh-water bivalves. VI. Isolation and chemical characterization of neutral glycosphingolipids from spermatozoa of the fresh-water bivalve, Hyriopsis schlegelii | |
| Cifonelli et al. | The capsular polysaccharide of pneumococcus type XII, SXII | |
| SUGITA et al. | Neutral glycosphingolipids of ova of the fresh-water bivalve, Hyriopsis schlegelii | |
| DE69518246T2 (de) | Aminosäuren konjugaten | |
| Ando et al. | On the minor gangliosides of erythrocyte membranes of Japanese cats |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |