DE2905678A1

DE2905678A1 - Pharmazeutische zubereitungen auf der grundlage von bakterienenzymen

Info

Publication number: DE2905678A1
Application number: DE19792905678
Authority: DE
Inventors: Marcel Forgeot; Nicole Simon-Lavoine
Original assignee: Science Union et Cie
Current assignee: Science Union et Cie
Priority date: 1978-02-16
Filing date: 1979-02-14
Publication date: 1979-12-20
Also published as: IL56679A0; FI790483A; DD141903A5; AR219372A1; PT69235A; EP0004214A1; AU4427879A; NO790512L; ZA79697B; DK64379A; GR68088B; BR7900951A; JPS54147911A; OA06185A; PL213477A1

Description

Die Erfindung betrifft pharmazeutische Zubereitungen, die als Wirkstoff eine Enzymverbindung enthalten und insbesondere pharmazeutische Zubereitungen zur Behandlung von durch Viren verursachten Krankheiten, die als Wirkstoff eine Bakterien-Glykosidhydrolase enthalten.

Es ist bereits eine Reihe von N-Acetylneuraminat-glykohydrolasen oder Neuraminidasen bakteriellen oder viralen Ursprungs bekannt. So wurden bereits die Neuraminidase von Vibrio cholericum, Clostridium perfringens, Vibrio comma und von verschiedenen Influenzaviren beschrieben.

Diese Neuraminidasen besitzen verschiedene Glykoproteinstrukturen und unterschiedliche physikalische und chemisehe Eigenschaften.

Gegenstand der Erfindung sind nun pharmazeutische Zubereitungen zur Behandlung von durch Viren verursachten Erkrankungen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie als Wirkstoff die aus Kulturen von Streptococcus pneumoniae (der Familie der Micrococcaceae) gewonnene N-Acetylneuraminatglykohydrolase enthalten, welcher Wirkstoff neben üblichen, inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch verträglichen Bindemitteln, Trägermaterialien und/oder Hilfs-

25 Stoffen vorliegt.

Die in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen enthaltene N-Acetylneuraminat-glykohydrolase ist ein Enzym, das dann, wenn es am nichtreduzierenden Ende einer Polysaccharidkette gebunden ist, dazu in der Lage ist, die N-Acetylneuraminsäure von Glykoproteinen abzuspalten.

So hat sich bei der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen N-Acetylneuraminat-glykohydrolase gezeigt, daß das mit Hilfe der nachstehenden Verfahrensweisen gebildete Produkt physikalische Eigenschaften besitzt, die sich von denen

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der bislang bekannten anderen Neuraminidasen unterscheiden. Der für die Bildung des Enzyms verantwortliche Stamm ist der bei der Sammlung des Institut Pasteur, Paris, Frankreich hinterlegte Streptococcus pneumoniae-Stamm Nr. I-o44.

In der Tat besitzt dieses Enzym keine Galactosidase-, Protease-, N-Acetyl-glucosaminidase-, Fucosidase- oder Arylsulfatase-Wirkung, wodurch sie sich von den anderen Neur.aminidasen unterscheidet.

Weiterhin besitzt die bei Verwendung von Bronchienglykopeptiden als Substrat ermittelte Michaelis-Konstante K einen Wert von 2,3 χ lo~ , was die sehr starke Affinität dieses Substrats belegt.

Der durch Isoelektrofokussierung bestimmte isoelektrische Punkt weist auf zwei Aktivitätsmaxima dieses Enzyms hin, was auf die Anwesenheit von zwei Isoenzymen mit pHi-Werten von 4,2 und 3,7 schließen läßt. Aufgrund dieser Eigenschaft unterscheidet sich das erfindungsgemäß verwendete Enzym von der aus Clostridium perfringens isolierten Neuraminidase, die homogen ist und deren isoelektrischer Punkt bei einem pH-Wert von 4,7 liegt.

Das Enzym des Streptococcus pneumoniae setzt die N-Acetylneuraminsäure der menschlichen σ(,-Glykoproteinsaure im Verlaufe von 7 Stunden zu 82 % und praktisch die Gesamtmenge (9o %) der N-Acetylneuraminsäure eines Bronchiensialomucins in einer Einwirkungsdauer von 6 Stunden frei.

Die chemische Struktur der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen N-Acetylneuraminat -glykohydrolase wurde bereits von P.. Bienvenu, C. Gaget, C. Bottex und R. Fontanges (C. R. Acad. Sei. (Paris) 285 (Section D) 837 (1977)) be-

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schrieben, ebenso wie ihr Gehalt an verschiedenen Aminosäuren. Sie unterscheidet sich in dieser Hinsicht von der Neuraminidase, die man durch enzymatische Hydrolyse des Grippevirus A (Hong-Kong) 1/68 erhält.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen können in galenischen Formen vorliegen, die ihre Verabreichung auf parenteralem, permukalem (über die Schleimhäute) , pcrkutanem, perlingualem oder rektalem Wege ermöglichen. Sie liegen insbesondere in Form von injizierbaren Lösungen oder Suspensionen, die in Ampullen, Mehrfachdosenfläschchen oder WegwerfInjektionsspritzen enthalten sind, Sublingualtabletten, Aerosolpräparaten zum Besprühen der Nasen- oder Halsschleimhäute, von Lösungen in einem die Haut durchdringenden Lösungsmittel zur perkutanen Verabreichung oder von Tabletten oder Suppositorien vor.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen enthalten weiterhin eines oder mehrere Produkte aus der Bindemittel, Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffe umfassenden Gruppe, die inert, nichttoxischjpharmazeutisch verträglich und für die Verabreichung auf parenteralem, permukalem, perkutanem, perlingualem oder rektalem Wege geeignet sind.

Man kann sie weiterhin mit Haftmitteln, Füllstoffen, Verdünnungsmitteln, Dispergiermitteln, oberflächenaktiven Mitteln, Duftstoffen, Aromastoffen, Emulgiermitteln oder ' ihre Verteilung im Organismus verzögernden Mitteln versetzen. In Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg kann die Einzeldosis innerhalb weiter Grenzen variieren. Die Einzelverabreichung erstreckt sich beim Erwachsenen insbesondere von 3oo Einheiten bis 5ooo Einheiten. Die tägliehe Dosis für den Erwachsenen umfaßt insbesondere die ein- bis viermalige Verabreichung der angesprochenen Ein-

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zeldosis.

Insbesondere im Fall der Verabreichung über die Schleimhäute, die Nase oder den Mund-Rachenraum bewirkt man während zwei Tagen drei Sprühbehandlungen mit einer Lösung oder Suspension in einem wäßrigen Trägermaterial. Im Fall der Verabreichung auf parenteralem Wege kann man während 1 Woche eine Injektion täglich und dann während 2 Monaten eine Verabreichung wöchentlich bewirken.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen sind für die Behandlung von durch Viren und Bakterien verursachten Erkrankungen geeignet. Sie wirken insbesondere gegen Myxovirus influenzae, Rhinovirus und sämtliche Virenstämme,

die auf Neuraminidase ansprechen. Diese Wirkung kann entweder einer direkten Wirkung auf die Glykoproteinhülle des Virus zugesprochen werden, wodurch die Anzahl der Zellschädigungen, die mit der Reproduktion der Virenelemente verknüpft sind, vermindert wird. Sie können auch über einen spezifischen immunostimulierenden Effekt auf die Keime wirken, deren pathogene Wirkung über eine Neuraminidase ähnlicher Antigenstruktur vermittelt wird (beispielsweise Erysipelotrix bei Tieren). Schließlich kann man den erfindungsgemäß eingesetzten Wirkstoffen eine unspezifisehe immunostimulierende Wirkung zuschreiben, die ihre

Verwendung bei der Behandlung von Rhinitis, Rhinopharyngitis, Sinusitis, Angina, Amygdalitis, Laryngitis, Tracheitis, akute Bronchitis, Bronchiolotis, Bronchopneumonien oder chronischer Bronchitis ergänzt.

Man kann den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen auch eine Antitumorwirkung durch Beseitigung der Sialinsäure von der Oberfläche der Zellmembranen, wodurch deren Immunogenität gesteigert wird, zuschreiben.

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a) Wenn man die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen vorbeugend während der ersten beiden Tage des Monats im Verlaufe der 6 Wintermonate an Personen, die der Grippe ausgesetzt sind, oder bevor die Symptome in der Umgebung der von Grippe befallenen Person auftreten, verabreicht, verhindern sie die Phase der VirusVerbreitung nach dem Befall der Zelle, verhindern das Auftreten von klinischen Anzeichen der Grippeinfektion, nämlich von Fieber, Schmerzen, Müdigkeit, Muskelkater, Kopfschmerzen etc. und verhindern zusätzliche Bakterieninfektionen.

b) Wenn man die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen nach dem Auftreten der ersten Anzeichen zum Zwekke der Heilung verabreicht, verursachen sie eine Verbesserung der Zellrückbildung, unabhängig davon, welcher Stamm für die Erkrankung verantwortlich ist, beschleunigen die klinische Heilung und verhindern Komplikationen, insbesondere pneumopathologisehe Krankheitsbilder. 2o

Sie besitzen den großen Vorteil im Hinblick auf die Unschädlichkeit, da sie aufgrund der sehr ausgefeilten Herstellungsverfahren in ultrareinem Zustand vorliegen, einen neutralen pH-Wert aufweisen, frei von Zellgiften sind und nicht die Nachteile von Stoffen besitzen, die ausgehend von abgeschwächten oder abgetöteten Viren hergestellt worden sind und deren Wirkung nur vorbeugend ist, deren antigenes Verhalten nicht stark ausgeprägt·und deren Bildung von Antikörpern gering ist, deren Toxizitat weit davon entfernt ist, vernachlässigt werden zu können, und deren gesamte Reinheit nicht stets gesichert ist.

Die immunostimulierende Wirkung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen wurde experimentell nachgewiesen:

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In vitro zeigt sich eine Aktivierung der Makrophagen durch:

eine größere Verbreitung, 5 eine Steigerung der Phagozytose,

eine Erhöhung der Anzahl der Rosetten E und Rosetten EAC und eine Steigerung der DNA-Synthese in Gegenwart von Lectinen.

Io In vivo kann man

eine Steigerung der humoralen Reaktion, eine Stimulierung der verzögerten Hypersensibilität feststellen.

Man kann die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen somit dazu verwenden, die Bildung eines Autovakzins ausgehend von Tumorzellen oder von Heterovakzinen anzuregen.

Weiterhin verursacht die von Streptococcus pneumoniae Nr. I-o44 gebildete Bakterienneuraminidase aufgrund ihrer Wirkung auf die Glykoproteine der Bronchienschleimhaut eine beträchtliche Verminderung der Viskosität, die bis zu 4o % erreichen kann. Aufgrund dieser Wirkung ist die erfindungsgemäß verwendete Neuraminidase für die Behandlung von chronischen Bronchialerkrankungen geeignet.

Die immunostimulierende und antivirale Wirkung der erfindungsgemäßen Arzneimittel sind als überraschend und nicht vorhersehbar anzusehen, da experimentelle Untersuchungen durch intratumorale Injektionen, insbesondere in ein Malpighi-Karzinom (P. Binder, CR. Acad. Sei. 481 (1975, Serie D) 1545) bei der Ratte eine erheblich erhöhte vorzeitige Mortalität durch Metastasenausbreitung ge-

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zeigt haben. Weiterhin haben Tumorzellen, die zuvor durch Betrahlen mit Röntgenstrahlen abgetötet, dann mit Neuraminidase behandelt und schließlich an Mäuse injiziert worden sind, bevor man denen Tumorzellen B.., implantiert hat, das Wachstum der implantierten Tumoren stimuliert.

Weiterhin haben die Arbeiten von P. Bienvenu et al. (loc. cit.) gezeigt, daß die Bakterien-Neuraminidase offenbar frei ist von einer Schutzwirkung gegen durch den Grippevirus verursachte Infektionen.

Aus all diesen Gründen sind die antiviralen und immunostimulierenden Wirkungen, die in der Humantherapie oder der Veterinärmedizin angewandt werden können, aufgrund der vorbekannten Literatur als überraschend anzusehen und ermöglichen die erstmalige therapeutische Anwendung von pharmazeutischen Zubereitungen, die als Wirkstoff die N-Acetylneuraminat-glykohydrolase von Streptococcus pneumoniae enthalten.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1 25 Gewinnung von N-Acetylneuraminat-glykohydrolase aus Streptococcus pneumoniae

Der zur Gewinnung der Neuraminidase verwendete Stamm ist ein Streptokokkus, der der Familie der Micrococcaceae angehört und unter der Nr. I-o44 in der Sammlung des Institut Pasteur, Paris, Frankreich, hinterlegt worden ist.

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Eigenschaften

Es handelt sich um einen gram-positiven, gepaarten Kokkus mit in gewissen Fällen sehr kurzen Ketten, der (manchmal) 5 eingekapselt ist und gegebenenfalls ein aerobes Verhalten zeigt. Die optimale Kulturtemperatur liegt bei 37 C.

Aufbewahrung

Dieser Stamm wird auf mit Nalidixinsaure versetztem Agar aufbewahrt (Institut Pasteur).

1. Herstellung dieses Mediums.

Man suspendiert 29 g des entwässerten Mediums in 1 1 destilliertem Wasser, wartet 5 Minuten und mischt dann durch, bis man eine homogene Suspension erhält. Man erhitzt dann langsam unter Rühren und läßt bis zur vollständigen Auflösung kochen. Dann stellt man den pH-Wert erforderlichenfalls auf 7,2 ein und verteilt in Röhrchen, die man während 2o Minuten bei 12o°C im Autoklaven sterilisiert. Nach dem Sterilisieren läßt man auf etwa 5o C abkühlen und gibt Io % steriles Pferdeblut zu. Man homogenisiert vorsichtig, um keine Luftblasen zu verursachen und läßt dann in geneigter Stellung abkühlen.

2. Animpfen

Das Animpfen erfolgt in Streifen auf der geneigten Agaroberfläche. Das Inkubieren dieser angeimpften Agarmedien

erfolgt während 18 bis 24 Stunden bei 37°C im Wärmeschrank. Das inokulierte Material wird anschließend zur Aufbewahrung auf 2o %-iger Magermilch gefriergetrocknet.

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II. Herstellung der_Impfkultur

Man suspendiert den Inhalt eines gefriergetrockneten Röhrchens in etwa 2 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung:
5

Gehirn-Herz-Brühe (Difco) 25 g/l

Neopepton (Difco) 1 g/l

Destilliertes Wasser ad 11

pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 7,8 eingestellt Io Sterilisation 3o Minuten bei 12o°C

pH-Wert nach dem Sterilisieren 7,6

Man verwendet diese Suspension zum Animpfen eines Kolbens, der 4 1 des gleichen Mediums enthält. 15

Die anaerobe Inkubierung erfolgt ohne Rühren und ohne Belüften während 24 Stunden in einer bei einer konstanten Temperatur von 3 7°C gehaltenen Umgebung.

ΞΞΞ1

Man überführt die in diesem Kolben erhaltenen 4 1 der Impfkultur zum Zwecke des Animpfens in einen Produktionsvermenter, der 1
setzung enthält:

vermenter, der 1 m des Mediums der folgenden Zusammen-

Pastose (Institut Pasteur) Ιο,ο g/l

Cerebrin l,o g/l

Fleischextrakt (Merieux) 3,ο g/l

Hefeautolysat (Fould-Springer) 3,ο g/l

Bikaliumphosphat l,o g/l

Natriumchlorid 5,o g/l

Leitungswasser ad looo 1

Spontaner pH-Wert 6,8 bis 7,ο Mit Natriumhydroxid eingestellter pHWert: 7,8 bis 8, ο

35 Sterilisation 2o Minuten bei 12o°C

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pH-Wert nach dem Sterilisieren 8,ο bis 8,2

Fermentationsbedingungen:

Belüftung: Keine

Rühren: 2o min"

Temperatur: 37°C

Dauer: 29 Stunden.

Nach Beendigung der Fermentation gibt man o,l g/l Lysozym zu, um das Platzen der Zellen zu begünstigen und die Io Diffusion der Neuraminidase in das Medium zu ermöglichen. Man rührt während 3 Stunden bei 37°C und läßt anschließend auf etwa 2o°C abkühlen.

Man verfolgt den Ablauf der Fermentation durch:

Mikroskopische Untersuchungen zur Verfolgung der Entwicklung des Streptococcus pneumoniae,

pH-Wert-Messungen, da das Medium schwach sauer wird und beim Ende des Fermentationsvorgangs einen pH-Wert von etwa 6,5 erreicht, und

durch Bestimmung der Neuraminidaseaktivität.

Durch fraktionierte Ausfällung

1. Man gibt 5oo g/l Ammoniumsulfat zu der Fermentations brühe in Gegenwart von 3 g/l eines Filterhilfsmittels (Hyflosupercel) zu. Man rührt während 1 Stunde, filtriert mit einer Filterpresse, wäscht den Filterkuchen mit einer

3o wäßrigen 4o %-igen Ammoniumsulfatlösung und nimmt den Filterkuchen bei +4⁰C mit dreimal 5 1 destilliertem Wasser auf.

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2. Filtrat 25

Zu 15 1 der in der obigen Verfahrensstufe 1 erhaltenen Flüssigkeiten gibt man nach der Bestimmung der Sulfationenkonzentration in Gegenwart von 4o g/l des Filterhilfsmittels (Hyflosupercel) Ammoniumsulfat in einer solchen Menge zu, daß sich eine Ammoniumsulfatkonzentration von 25o g/l ergibt. Man rührt während 1 Stunde und filtriert dann über einen Büchner-Filter. Io

3. Filterkuchen 4o %

Zu dem in der obigen Stufe 2 erhaltenen Filtrat gibt man 25o g/l Ammoniumsulfat in Gegenwart von Io g/l des Filterhilfsmittels (Hyflosupercel). Man rührt während 1 Stunde, filtriert über einen Büchner-Filter, wäscht den Filterkuchen mit einer wäßrigen Ammoniumsulfatlösung mit einer Konzentration von 4oo g/l, vereinigt die Extrakte und dialysiert sie bei +4⁰C während 15 Stunden bei einem Durch-

2o satz von 2o l/h gegen einen Leitungswasserstrom.

4. Chromatographie über Carboxymethylcellulose (CM 23)

Vorbereitung der Säule (die einen Durchmesser von 15 cm und eine Länge von loo cm besitzt) : Man führt durch die Säule, die 1,6 kg Carboxymethylcellulose (CM 23) enthält, 55 1 einer o,oo25 m Phosphatpufferlösung (mit einem pH-Wert von 6,8).

3o Fixierung an der Säule:

Die dialysierten Extrakte werden durch Filtration geklärt, worauf man ihren pH-Wert mit 1 m Zitronensäure auf 6,8 einstellt. Dann trägt man sie mit Io bis 15 1 eines o,oo25 m Phosphatpuffers (pH = 6,8) auf die Säule auf.

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Totvolumen: 6 1

Volumen der Abströme und der Waschflüssigkeiten: 12 1

Elution:

5 Die fixierte Neuraminidase wird mit einer o,2 m Phosphat/-Citrat/Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,8 in einer Menge von Io bis 15 1 eluiert, wobei man bei einem Durchsatz von 4 l/h arbeitet.

Totvolumen: 6 bis 8 1

Volumen des "Kern"-Eluats: 5 1

Die "Kernfraktion" wird während 16 Stunden bei +4⁰C mit einem Durchsatz von 4 l/h gegen eine 1 %-ige Natriumchloridlösung dialysiert.

Nach dem Gefriertrocknen erhält man die rohe Neuraminidase mit einer spezifischen Aktivität von etwa 5oo.

Reinigung über Sephadex G 5o:

Man führt die Lösung von Io g Proteinen (bestimmt nach Lowry) in 15o ml eines o, 1 m Phosphat/Citrat-Puffers mit einem pH-Wert von 6,8 durch eine mit Sephadex G 5o beschickte Säule (mit einem Durchmesser von 6 cm und einer Länge von 9o cm), die man mit einem o,l m Phosphat/Citrat-Puf fer mit einem pH-Wert von 6,8 äquilibriert hat. Man entwickelt mit dem gleichen Puffer und fängt 2o ml-Fraktionen auf. Man vereinigt die Neuraminidase enthaltenden Fraktionen, dialysiert sie während 24 Stunden gegen eine 1 %-ige wäßrige Natriumchloridlösung und trocknet sie durch Gefriertrocknen. Die spezifische Aktivität des erhaltenen Pulvers beträgt etwa 2oooo. Diese in nMol angegebene Aktivität wird dadurch gemessen, daß man die Menge der Sialinsäure bestimmt, die bei 37°C im Verlaufe

35 von 1 Minute unter Verwendung von N-Acetylneuraminyllactose (NANL) als Substrat, das 1 mg Protein enthält, freige-

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setzt wird.

Die enzymatischen Eigenschaften der aus Kulturen von Streptococcus pneumoniae extrahierten und gereinigten N-Acetylneuraminat-glykohydrolase sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

TABELLE

Untersuchte Aktivität (pro mg Pro tein)	Rohes Neu- raminidase- präparat	Gereinigte Neuraminidase nach der Chro matographie über Carboxy methylcellu lose	Gereinigte Neuraminidase nach der Chro matographie über Sephadex G 5o
Neuraminidase	3,1	5oo	2o ooo
N-Acetyl-glu- cosaminidase	1,6	O	O
ß-Galactosidase	o,3	O	O
»(-Galactosidase	0,3	O	O
ot-Fucosidase	O	O	O
ß-Fucosidase	O	O	O
Arylsulfatase	O	O	O
Protease	O	O	O

Beispiel

Dieses Beispiel verdeutlicht die nicht vorhandene antigene Gemeinsamkeit zwischen der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Neuraminidase und Neuraminidasen viralen Ursprungs.

a) Die Versuche der Neutralisation der Aktivität der aus Streptococcus pneumoniae (Stamm Nr. I-o44) gewonnenen Neuraminidase durch Seren von Kaninchen, die gegen

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Neuraminidasen viralen Ursprungs immunisiert wurden, verliefen völlig negativ.

Untersuchte Viren: 5 Myxovirus influenzae Menschen: Typ A - N„

Singapour 57 Hong-Kong 68 England 72 Io . Typ B

Tiere: A equi 1 A equi

Myxovirus para influenzae 15 Menschen: Typ 1, 2, 3

Mumps Tiere: Sendai SV 5

b) Die Versuche der Neutralisation der aus Viren gewonnenen Neuraminidasen mit einem Kaninchenserum mit Antineuraminidasewirkung auf der Grundlage von Streptococcus pneumoniae sind negativ verlaufen.

Beispiel 3 25

Wirkung der bakteriellen Neuraminidase auf die Vermehrung des Grippe-Virus A Port Chalmers 1/73 H₃N₃.

Es wurden verschiedene Gruppen von Bakterien-Neuraminidasen auf Eierschalenfragmenten + MCA untersucht, die in Vertiefungen von Kunststoffplatten aus Polymethylmethacrylat (Perspex) am Leben gehalten werden (Eierschalentest nach Fazekas). Diese beiden Zellarten werden mit dem Virus A, Port Chalmers angeimpft (o,l ml der Verdünnung + o,9 ml des Mediums bei einem Infektionstiter des Virus von lo~ ID^ /o,l ml). Nach dem Inkubieren während 6 Stunden bei

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33°C gibt man die Bakterien-Neuraminidase zu (o,l ml,

_2
Verdünnung Io bei einem spezifischen Neuraminidasetiter von 8000 und einer Konzentration von 1 mg Proteine/ml) .

Die Wirkung dieses Enzyms auf die Vermehrung des Virus erfolgt im Verlaufe von 72 Stunden. Nach Ablauf dieser Zeit bestimmt man den Infektionstiter des gebildeten Virus durch Ermittlung des hämagglutinierenden Titers HA (an Eierschalen) mit Hilfe von direkt in das Medium eingebrachten roten Blutkörperchen von Hühnern. Die in der Bakterien-Neuraminidase beobachteten Ergebnisse sind in der Tabelle I zusammengestellt. Das Inokulieren bei sämtlichen Versuchen erfolgte bei der gleichen Verdünnung, bei dem gleichen Titer und bei der gleichen Proteinkonzentration .

Die Wirkung der Bakterien-Neuraminidase auf die Vermehrung des Virus wurde auch dadurch untersucht, daß man alle 6 Stunden die gleiche Dosis Neuraminidase inokuliert. Der Virus entwickelt sich während der ersten 6 Stunden auf den "Eierschalen" (egg bit), die bei 33°C am Leben erhalten und inkubiert werden.

In der 6. Stunde gibt man eine Dosis der Bakterien-Neuraminidase zu. Man läßt die Vermehrung der Viren 72 Stunden ablaufen. Dann bestimmt man den Infektionstiter durch Hamagglutination mit 2 % roten Blutkörperchen von Hühnern.

Die nachstehende Tabelle I verdeutlicht die Kinetik der Vermehrung des Grippe-Virus in Gegenwart bzw. in Abwesenheit der Bakterien-Neuraminidase. Es läßt sich eine deutliche Einwirkung der aus Streoptococcus pneumoniae gewonnenen Bakterien-Neuraminidase auf die Vermehrung des

35 Grippe-Virus feststellen.

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Beispiel

Bestimmung der Wirkung der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Neuraminidase gegen den Vermehrungsgrad von Myxovirus (wilde Stämme) in Abhängigkeit von dem Einführungszeitpunkt .

1. Untersuchung

Die Neuraminidase wird im Verlaufe der Vermehrung des Myxovirus in einer Eierschalenkultur in einer Dosis von 2,7 Einheiten/ml/Reaktionsnäpfchen inokuliert.

Man beobachtet die Vermehrung der Viren während 72 Stunden bei 33°C in Abwesenheit der aus Streptococcus pneu-

15 moniae gewonnenen Neuraminidase. Nach Ablauf dieser Zeit bewirkt man auf einem Teil der Kultur direkt in den Näpfchen eine Hämagglutination unter Verwendung von 2 % roten Blutkörperchen von Hühnern (HA/MCA-Titer). Der andere Teil wird gesammelt, mit anderen Proben vereinigt, bezüglich

2o seiner hämagglutinierenden Wirkung, seiner Neuraminidasewirkung und seines Infektionstiters auf Embryoeier (EID 5o) untersucht, bevor er erneut auf den Eierschalen reinokuliert wird.

25 In gleicher Weise verfolgt man diese zweite Virusvermehrung während 72 Stunden bei 33°C, wonach man das Material sammelt, die hämagglutinierende Wirkung, die Neuraminidasewirkung und den Infektionstiter bestimmt, das Material erneut auf frischen Eierschalen inokuliert.

Der Ablauf der dritten Virusvermehrung erfolgt identisch mit den beiden vorhergehenden.

Parallel dazu verfolgt man die Virusvermehrung in Gegen-35 wart von Neuraminidase, die bei sämtlichen drei Vermehrungs-

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vorgängen in der 6. Stunde des Viruszyklus zugegeben wird.

Der Rest der vereinigten Materialien einer jeden Vermehrung, der nach 72 Stunden gewonnen worden ist, wird aufkonzentriert und gereinigt, um die Morphologie des in Abwesenheit bzw. in Anwesenheit von Neuraminidase gebildeten Virus zu ermitteln.

Die mit einem Fragment der Allantochorionmembran (MCA) bedeckten Eierschalen werden bei sämtlichen drei Durchgängen jeweils nach 26 Stunden der Vermehrung entnommen. Einige werden in 2 %-igem Glutaraldehyd fixiert, um mit Hilfe des Elektronenmikroskops das Austreten des Virus aus dem Bereich der Membran festzustellen. Andere werden in 1 %-igem Glutaraldehyd fixiert und einer Gefrierätzung unterworfen, um die Unterschiede der Morphologie der infizierten und der nichtinfizierten Membranen zu untersuchen, die mit Neuraminidase behandelt bzw. damit nicht behandelt worden sind.
2o

2._Untersuchung

Man gibt die Neuraminidase im Verlaufe der Vermehrung des Myxovirus A„ PC/73 und A₂ VIC/3/75 in einer Konzentration von o,5 Einheiten/ml/Reaktionsnäpfchen zu. 25

A VIC/3/75 der Allantoinflüssigkeit: Eigenschaften: HA-Titer: 2oo NA-Titer: 8o EID 5o: lo⁷'⁵ 3o HA s/MCA: lo⁴'⁵.

Bakterien-Neuraminidase: Spezifische Aktivität = 27 ooo

Mutterlauge mit o,1 mg Protein/ml: 27 ooo Einheiten/ml Inokulierung: o,1 ml auf l/loo verdünnt: 2,7 Einheiten/ml/

Näpfchen

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Mutterlauge 1/5 verdünnt: 54o Einheiten/ml Inokulierung: 0,1 ml auf l/loo verdünnt: o,54 Einheiten/

ml/Näpfchen.

Man wendet die üblichen Methoden an zur Kultur auf Eierschalen,
Hämagglutinbestimmung,
Neuraminidasebestimmung und der

Bestimmung des EID₁- -Werts an embryonalen Eiern. Io

Man·bewirkt anschließend die Fixierung der Membranen zum Zwecke der Elektronenmikroskopie und der Gefrierätzung.

Ergebnisse

Die erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Histogrammen I, II und III zusammengestellt:

Hieraus ist zu entnehmen, daß nach der Zugabe der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Neuraminidase 6 Stun-

2o den bzw. 24 Stunden nach dem Beginn der Kultur des Grippe-Virus auf Eierschalen der Vermehrungsgrad des Virus mindestens um 2 log Io geringer ist als der der Kontroll-Viren. Die Zugabe nach einer Kulturdauer von 3o Stunden führt ebenfalls noch zu einem positiven Effekt. Die Zugabe nach

25 48 Stunden bzw. 54 Stunden ergibt einen geringen Effekt, der jedoch größer ist als Null.

Beispiel 5

Untersuchung des Vermehrungsgrads der Grippe-Viren in Anwesenheit von variablen Mengen der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Neuraminidase.

Man bereitet eine Reihe von Lösungen der Batkerien-Neura-35 minidase mit unterschiedlichen Proteinkonzentrationen von

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o,l, ο, 2, ο, 4, ο, 6, 0,8 bzw. 1 mg Protein/ml.

Man inokuliert eine Dosis (ο,1 ml Io ) dieser verschiedenen Lösungen in Kulturen verschiedener Grippe-Viren in Eierschalenmedien (MCA-Kulturen), um die Wirkung auf die Vermehrung der Viren zu beobachten.

Material und Methoden

Grippe-Virus influenzae A: Hong-Kong 1/68 Io Port Chalmers 1/73

Victoria 3/75 Embryoeier mit einem Alter von 11 Tagen.

Die Kulturmethode ist die von Fazekas (1958) beschriebene, Die Eierschalen werden in Näpfchen von Kunststoffplatten (Polymcthylmethacrylat, OMS Perspex) mit 0,6 ml eines Überlebensmediums am Leben gehalten. Man infiziert sie

— 1 —8

mit o,l ml Virusverdünnungen, die sich von Io bis Io erstrecken. Nach einer Inkubationszeit von 6 Stunden bei 33 c inokuliert man eine Dosis der Lösung der Bakterien-Neuraminidase mit unterschiedlichen Konzentrationen. Man läßt die Vermehrung während 72 Stunden bei 33°C ablaufen. Nach Ablauf dieser Zeit entnimmt man o,l ml des Mediums aus jedem Näpfchen, um den Vermehrungsgrad des Virus in Abhängigkeit von den unterschiedlichen Konzentrationen der Bakterien-Neuraminidase (bestimmt über den Hämagglutinationstiter HA und den Neuraminidase-Titer des Virus) zu vergleichen. Man bewirkt weiterhin eine Hämagglutination direkt in den Näpfchen mit o,1 ml einer o,2 %-igen Suspension von roten Blutkörperchen von Hühnern, was es ermöglicht, den Infektionstiter des Virus in Gegenwart der Neuraminidase im Vergleich zu den Kontrolle ohne die Anwesenheit der Bakterien-Neuraminidase zu untersuchen.

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Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen II bis
IV zusammengestellt.

Beispiel 6

In vivo— Untersuchung der Bakterien-Neuraminidase.

A) Die in vitro beobachtete inhibierende Wirkung der Bakterien-Neuraminidase auf die Vermehrung von Grippe-Viren wurde auch in vivo untersucht. Hierzu wurden Gruppen von Frettchen auf intranasalem Wege eine bestimmte Dosis des Grippe-Virus (MRC 11) verabreicht, worauf man 6 Stunden oder 18 Stunden später eine Dosis der Bakterien-Neuraminidase (2 mg Proteine/ml) verabreichte.

Die Wirkung der Neuraminidase auf die Vermehrung des
Virus wird dadurch bestimmt, daß man in Abhängigkeit
von der Zeit und durch Vergleich mit den Kontroll-Frettchen, die lediglich mit der Virus-Dosis behandelt worden sind, folgendes bestimmt:

Das Verschwinden des inokulierten Virus

durch
Bestimmung des Hämagglutinationstiters,

des Neuraminidase-Titers und

des Infektionstiters an Halsabstrichen, die

man nach verschiedenen Zeitpunkten (5

Tagen, 6 Tagen, 9 Tagen bzw. 15 Tagen) nach der Inokulation.abstreicht.

- Die Einschränkung der Bildung von Antihämagglutin und
Antineuraminidase-Virusantikörpern

in Halsabstrichen durch Untersuchung der lokalen Antikörper und

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in dem Serum durch Untersuchung der im Kreislauf vorliegenden Antikörper.

Die Frettchen der Gruppen, die lediglich mit dem Grippe-Virus behandelt worden sind, zeigen deutliche Anzeichen der Grippe, d. h. sie niesen und haben 6 Tage später eine stark laufende Nase, während die Frettchen, denen die Bakterien-Neuraminidase verabreicht wurde, diese Wirkungen nicht zeigen.
Io

b) Drei Gruppen von Frettchen werden auf intranasalem Wege mit einer Dosis des Virus MRC 11 (1 ml der Allantoinmischung) angeimpft.

Die Bakterien-Neuraminidase wird auf dem gleichen Wege 6 Stunden nach der Injektion des Virus in einer Dosis zugeführt (1 mg Proteine, die mit o,5 ml physiologischem Wasser verdünnt sind).

Man nimmt alle drei Tage nach der Inokulation Halsabstriche, um eine Kinetik der Absorption und der Vermehrung des Virus im Bereich der Luftröhre in Gegenwart und in Abwesenheit der Bakterien-Neuraminidase festzustellen.

Material und_Methoden

Grippe Virus: Recombinante MRC 11 (Allantoinmischung) Bakterien-Neuraminidase des Streptococcus pneumoniae: Frettchen:

Kontrollgruppe, die nur mit dem Virus behandelt wird, Gruppe, die mit dem Virus und 6 Stunden später mit der Bakterien-Neuraminidase behandelt wird und Gruppe, die mit dem Virus und 6 Stunden vorher mit der Bakterien-Neuraminidase behandelt wird.

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Die alle drei Tage erfolgenden Abstriche werden in 1,5 ml Überlebensmedium (Parker) suspendiert und im Hinblick auf den viralen Hämagglutinationstiter (HA-Titer) und die Hämagglutinin-Inhibierung (IHA-Titer in bezug auf das Virus MRC 11) untersucht.

Man bewirkt eine schwache Herzpunktur am 15. und am 21. Tag nach der Inokulation, um den Spiegel der zirkulierenden Antikörper festzustellen. Io

Ergebnisse

Kontrollgruppe: Die Frettchen wurden zum Zeitpunkt Null mit einer Dosis des Virus MRC angeimpft. 6 Stunden später wurden sie mit o,5 ml physiologischem Wasser behan-15 delt.

Drei der Frettchengruppen haben ihr Inokulum sehr gut absorbiert. Im Gegensatz dazu zeigt eine Gruppe der Frettchen nach dem Inokulieren ein starkes Niesen.

Alle Frettchen leiden nach dem 6. Tage nach der Inokulierung an starken Grippesymptomen:

Sehr rote Augen, laufende Nasen, mattes und struppiges Fell, Zittern, Niesen, apathisches Verhalten und Appe-

titlosigkeit.

Es ist eine erhebliche Mortalität der Kontrolltiere zu beobachten. Demgegenüber zeigen die anderen Kontrollfrettchen vom 9. Tage an einen verbesserten Gesundheits-3o zustand.

Der HA-Titer, der die Anwesenheit des Virus anzeigt,

nimmt bis zum 6. Tage zu (wobei er sein Maximum vom

3. bis zum 6. Tage durchläuft) und nimmt dann wieder

ab, um am 15. Tage völlig zu verschwinden.

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Im Gegensatz dazu erscheinen die Anti-HA-Antikörper am 6. Tag und nehmen progressiv bis zum 21. Tag zu.

Behandelte Gruppen, 6 Stunden nach der Inokulation des Virus:

Die Frettchen wurden mit einer Dosis des Virus MRC 11 zum Zeitpunkt Null behandelt und dann 6 Stunden später mit einer Dosis der Bakterien-Neuraminidase.

Insgsamt zeigten die in dieser Weise behandelten Frettchen ein gewisses Niesen nach der Inokulation des Virus; sie haben jedoch sämtlich die Bakterien-Neuraminidase sehr gut absorbiert.

15 Ergebnisse

Die im Verlaufe der verschiedenen Untersuchungen der Verabreichung der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Neuraminidase sind in den nachstehenden Tabellen V bis VII zusammengestellt.
2o

Beispiel 7

Klinische Untersuchung der Antigrippe-Wirkung der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Neuraminidase. 25

A) Untersuchte Patienten:

Für die Untersuchung wurden neun Familien herangezogen: 19 Erwachsene, d. h. 7 Männer mit einem Alter von 38 bis 66 Jahren und 12 Frauen mit einem Alter von 35 bis 8o Jahren und

8 Kinder, d. h. 3 Mädchen mit einem Alter von Io bis 14 Jahren und 5 Knaben mit einem Alter von 7 bis 14 Jahren.

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B) Dosierung:

Es wurden dreimal täglich eine wäßrige Lösung in die Nase eingesprüht, die pro Versuch 33o Einheiten der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Neuraminidase enthielt. Da die Behandlung an zwei aufeinanderfolgenden Tagen erfolgte, wurden insgesamt 4ooo Einheiten der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Neuraminidase verabreicht.

C) Ergebnisse:

1. Heilbehandlung (17 Patienten)

Die Wirkung wurde subjektiv als sehr günstig bezeichnet. Es ergab sich in allen Fällen ein glatter unkomplizierter Verlauf der Erkrankung. 15

2. Vorbeugende Behandlung (18 Patienten) Frühzeitige Behandlung: Lediglich ein einziger von 12 in "Kontakt" stehenden Personen erkrankte. Verzögerte Behandlung: Es erkrankten 3 Personen von 6 in "Kontakt" stehenden Personen.

D) Verträglichkeit:

Die Verträglichkeit war in allen Fällen ausgezeichnet.

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2905578

Beispiel 8

Ermittlung der Reinheit der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Bakterien-Neuraminidase durch Elektro-5 Fokussierung.

Verfahrensweise

Herstellung der Platten nach

C.Karlsson, H. Davies, J.Ohamn und U.B.Anderson (LKB Laboratories Application No. 75) und O.Vesterberg (Science Tools, LKB Instrument Journal Vol. 20, No. 2-3, 1973).

Für die Herstellung einer Platte mit den Abmessungen 26 χ 12,5 cm vermischt man die folgenden Lösungen in der angegebenen Reihenfolge:

Eine Lösung von 2,27 g Acrylamid

und 0,073 g N,N'-Methylen-bis-

acrylamid in destilliertem Wasser ad 20 ml Eine Lösungvon 7,5 g Harnstoff in

destilliertem Wasser ad 36 ml

Ampholin-Lösung 3,5-10 3,2 ml

0,004%ige Riboflavin-Lösung in

destilliertem Wasser 0,8 ml

Anschließend bewirkt man die Photopolymerisation.

Herstellung der aufzutragenden Lösungen

, Die Neuraminidase muß einen Gehalt von Mineralsalzen

von ^ 75% besitzen. Die Auftragungen erfolgen für den Nachweis der Proteine in einer Menge von etwa 350 μg (als Proteine nach Lowry gerechnet) und für die Bestimmung der Neuraminidaseaktivität in einer Menge von etwa 10 000 Neuraminidase-Einheiten (NANL-Einheiten). Sie entsprechen Lösungsvolumina zwischen 10 und 20 μ1·

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Für diese Untersuchung verwendet man eine Neuraminidase bakteriellen Ursprungs mit einem Titer von 3700 Einheiten/mg, die pro Milligramm 257 μg Proteine enthält. Man löst 13 μg des Produkts in 0,1 ml destilliertem 5 Wasser.

Zum Nachweis der Neuraminidase-Aktivität entnimmt man für die Auftragung 20 μΐ (etwa 9620 Neuraminidase-Einheiten). Zum Nachweis der Proteine entnimmt man 10 μΐ für den Auftrag (etwa 334 μg).

Erforderlichenfalls bereitet man zum Nachweis der Proteine und der Neuraminidase-Aktivität zwei getrennte Lösungen.

Auftrag

Man imprägniert zwei Papierbändchen (Whatman Nr. 1) mit den Abmessungen 10 χ 5 mm, und zwar eines mit der Lösung zum Nachweis der Proteine und das andere mit der Lösung zum Nachweis der Neuraminidase-Aktivität.

Man legt die Bändchen in der Zone mit saurem pH-Wert (4 bis 5) auf das Gel auf.

Elektrofokussierung

Die Elektrofokussierung erfolgt bei +4⁰C in einem Kühlschrank (LKB). Bei konstanter Stromstärke (40 mA) läßt man die Spannung einen Wert von 1000 V erreichen (Dauer etwa 1 Stunde). Dann schaltet man auf konstante Spannung (1000 V) um, bis sich eine konstante Stromstärke (15 mA) ergibt. Man entnimmt die Bändchen von dem Gel und hält während 2 Stunden bei 1000 V und 15 mA. Die Gesamtdauer der Untersuchung beträgt etwa 5 Stunden.

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Bestimmung des pH-Gradienten Diese Bestimmung erfolgt mit Hilfe einer planen Mikroelektrode (des Typs Ingold).

5 Entwicklung
Proteine

Die Entwicklung der Proteine erfolgt mit Coomassie-Blau (nach der Methode von Graesslin et al, J.Chromatog, 63 (1971) 475 und O. Vesterberg, Biochim. Biophys. Acta 257 (1972) 11) .

Neuraminidase-Aktivität

Man gießt eine 1% Agar enthaltende 0,1m Natriumphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,4, die 1 mg/ml Methoxyphenylneuraminsäure und 1 mg/ml 4-Amino-2,5-dimethoxy-4'-nitro-azobenzol-diazoniumchlorid enthält, auf das Gel.

Man dispergiert die Methoxyphenylneuraminsäure und das Diazoniumsalz in 1 bis 2 ml des Puffers, gibt die bei 30°C gehaltene Agarlösung zu und hält einige Minuten in feuchter Atmosphäre bei 40°C.

Die braunen Banden auf dem maronenfarbenen Untergrund entsprechen den Proteinen, die eine Neuraminidaseaktivität besitzen.

Nach der Elektrofokussierung entwickelt man auf einer gleichartigen Platte, auf die zwei Neuraminidase-Abscheidungen erfolgt sind, die Gesamtproteine einer der Abscheidungen mit Coomassie-Blau. Die Neuraminidase-Aktivität bestimmter Proteine wird an dem zweiten Auftrag mit Hilfe der Methoxyphenylneuraminsäure entwickelt.

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Man beobachtet in dieser Weise eine Vielzahl von Proteinbanden, von denen gewisse eine Neuraminidase-Aktivität besitzen, wobei die drei Hauptbanden in dem Medium zwischen pH-Werten von 6,5 und 9 liegen.

Die beiden Isoenzyme erscheinen in dem pH-Bereich zwischen 3,7 und 4,2.

Beispiel 9

Dieses Beispiel verdeutlicht die Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen auf der Grundlage von aus Streptococcus pneumoniae gewonnener Neuraminidase und die Untersuchung ihrer Stabilität.

Man bewirkt eine Bestimmung der Stabilität der Bakterien-Neuraminidase bei verschiedenen Temperaturen, beim Versprühen und beim Dispergieren mit verschiedenen Aerosoltreibmitteln.

Die Neuraminidase-Aktivität wurde nach der Methode von Aminoff (Bio.Jour.Vol. 81 (1961) 384) ermittelt, während die Proteinbestimmung nach der Methode von Lowry durchgeführt wurde.

1. Stabilität bei verschiedenen Temperaturen

a) Wäßrige Lösung mit einem Titer von 900 Einheiten/ml

, Bakterien-Neuraminidase 2 50 mg

Physiologisches Serum, das

1 Promille Thiomersal enthält ad 100 ml

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Die bei der Untersuchung der Temperaturstabilität dieser Lösung erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle VII zusammengestellt.

5 Aus der Tabelle VII ist zu erkennen, daß die Lösung eine gute Stabilität bei den normalen Anwendungsbedingungen (5 bis 6 Tage) besitzt.

b) Wäßrige Lösung mit einem Titer von 1700 Einheiten/ml Bakterien-Neuraminidase 32 mg

Physiologisches Serum, das 1

PromilleThiomersal enthält ad 55 ml.

Die bei der Untersuchung der Temperaturbeständigkeit erhaltenen Ergebn
zusammengestellt.

erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle VIII

Aus der Tabelle VIII ist zu erkennen, daß die Lösung bei den üblichen Anwendungsbedingungen (5 bis 6 Tage) ^ eine gute Stabilität besitzt.

c) Wäßrige Lösung mit einem Titer von 2000 Einheiten/ml

Bakterien-Neuraminidase 100 mg

Physiologisches Serum, das

λ ι m^ · -ι τ.·.-, ad 100 ml.

'25 0OO ^Tniomersal enthalt

Die bei der Untersuchung der Temperaturbeständigkeit dieser Lösung erhaltenen Ergebnisse sind in der 30 Tabelle IX zusammengestellt.

Aus der Tabelle IX ist zu erkennen, daß die Lösung

bei den angestrebten Anwendungsbedingungen (5 bis 6 Tage)

eine gute Stabilität besitzt.

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2.) Sprühbeständigkeit

Man bereitet eine Lösung aus folgenden Bestandteilen:

Bakterien-Neuraminidase 100 mg

Physiologisches Serum ad 10 ml.

Man untersucht die Sprühbeständigkeit der Lösung in 18 Versuchen. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle X zusammengestellt. 10

Aus der Tabelle X ist zu erkennen, daß die Neuraminidase das Versprühen mit Hilfe einer mit einer Pumpe ausgerüsteten Sprühflasche gut verträgt.

3.) Stabilität gegen das Dispergieren mit Hilfe verschiedener Aerosol-Sprühgeräte

a) Vaast-Sprühgerät
Eingesetzte Lösung:

Bakterien-Neuraminidase 200 mg

Physiologisches Serum ad 20 ml.

Die bei 12 Untersuchungen ermittelten Ergebnisse sind in der Tabelle XI zusammengestellt. 25

b) Sprühvorgang bei einem Druck von 0,4 kg/cm² unter Verwendung einer Lösung mit einem Titer von 2700 Einheiten/ml

Verwendete Lösung:

Neuraminidase 20 mg

Physiologisches Serum 20 ml.

Die bei dieser Untersuchung erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle XII zusammengestellt.

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Zu der Tabelle XII ist zu bemerken, daß die Kontrolluntersuchungen mit einer wäßrigen Natriumchloridlösung mit einer Konzentration von 10 mg/ml und einer wäßrigen Serumalbuminlösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml durchgeführt wurden. Nach einer Betriebsdauer von

2 Stunden betragen die Konzentrationen der noch vorhandenen Lösungen (10 ml) im Fall der Natriumchloridlösung 20 mg/ml und im Fall der Serumalbuminlösung 2 mg/ml.
10

c) Sprühvorgang unter Anwendung eines Druckes von 1 kg/cm² unter Verwendung einer Lösung mit einem Titer von 3600 Einheiten/ml.

15 Eingesetzte Lösung:

Neuraminidase 60 mg

Physiologisches Serum 20 ml.

Nach Ende dieser Untersuchung wurde die Neuraminidase-Aktivität und der Proteingehalt der noch vorhandenen Lösung ermittelt. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle XIII zusammengestellt.

d) Jouan-Säulensprüheinrichtung

Bei diesen Untersuchungen wurde die Neuraminidase-Aktivität und der Proteingehalt der restlichen Lösung bestimmt.

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1.) Sprühvorgang unter Anwendung eines Druckes von 1 kg/cm²

Verwendung einer Lösung mit einem Titer von 3700 Einheiten/ml.

Eingesetzte Lösung:

Bakterien-Neuraminidase 60 mg

Physiologisches Serum 20 ml.

Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle XIV zusammengestellt.

2.) Sprühvorgang bei Anwendung eines Druckes von 0,5 kg/cm²

Verwendung einer Lösung mit einem Titer von 3700 Einheiten/ml.

Eingesetzte Lösung:

Bakterien-Neuraminidase 60 mg

Physiologisches Serum 20 ml.

Bei dieser Untersuchung wurde das Aerosol durch sechs hintereinandergeschaltete Waschflaschen geführt, die

jeweils 40 ml Wasser enthielten. Es wurden drei Versuche

durchgeführt; die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle XV zusammengestellt.

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Beispiel 3 TABELLE I

Kinetik der Vermehrung des Influenza-Virus Port Chalmers in Gegenwart der Neuraminidase

Virus A Port Chalmers 1/73 H₃N₂

Kontroll-Virus
HA-Titer

Virus +

3,5 Einheiten Neuraminidase zur Stunde 6 gegeben, HA-Titer

6 h	12 h	-	24 h	3o h	36 h	48 h	54 h	6o h	72 h
-	O	O	O	2	2 1o⁴	4· lo⁵	8·1ο⁵	8· lo⁵
1 der Neu ramini dase	O	O	O	O	O	O	2· lo³	4 1o³

On

to

<O

=t CD

CO

Beispiel 5 TABELLE II

A/Victoria 3/75

[~] Virus (Kontrolle)

Virus + Neuraminidase

(D O CO CO CTI

T—i

CNI ·Η

χ. cn υ tu

C ο

.4

Bakterien-Neu-. raminidase 6 h nach der Virusinokulation zugegeben

o,o7 Einheiten

o,35 Einheiten

U)

0,7 Einheiten

TO CO

O OI

cn

Vermehrungsgrad des Virus in Abhängigkeit von der Enzymdosis

TABELLE III

A/Hong-Kong 1/68

bO O

4-1

υ οι

to si

C υ

>-ι ·Η

O) M

4-1 4-)

• Η OJ

η ε

I O

< O)

Bakterien-Neuraminidase 6 h nach der Virus Inokulation zugegeben.

□ Virus (Kontrolle)

^ Virus + Neuraminidase

ro

O Ul CT

OO

o,o7 Einheiten o,35 Einheiten o,7 Einheiten

Vermehrungsgrad des__Viru_s__in Abhängigkeit von der Enzymdosis

TABELLE IV

A/Port Chalmers 1/73

i-l

Q) JZ 4J

(NI ·Η

υ φ

ro jz

c υ to

u ·η

(U U

-P -μ

■Η (D

Η E

I O

<C Q)

3C J

J	1 \\ν\^:
-4
-3	S

■2
-1	i

Bakterien-Neuraminidase h nach der Virusinoku- o,o7 Einheiten lation zugegeben.

ο,35 Einheiten

□ Virus (Kontrolle)

S Virus + Neuraminidase

o,7 Einheiten

ro «ο

CO

Vermehrungsgrad des Virus in Abhängigkeit von der Enzymdosis

TABELLE V

Therapeutische Wirkung der Neuraminidase an Frettchen, die mit dem Grippe-Virus MCR 11 infiziert worden sind.

Kontrolle	Gesunde Tiere	Behandelte Tiere	Gesunde Tiere
Kranke Tiere	O/14	Kranke Tiere	18/18
14/14	o/18

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TABELLE VI

Globale Ergebnisse der therapeutischen Wirkung der Bakterien-Neuraminidase auf mit dem Virus MRC 11 infizierte Frettchen.

O CO OO

Zustand der Tiere	Kontroll-Frettchen, die 1 ml MRC 11 (EID₅₀=Io⁷) okuliert worden sind	mit in	Frettchen, denen 35ooo Einheiten Neureminidase entweder vor oder nach der Inokulation von 1 ml des Virus MRC 11 (EID₅₀ = lo⁷) verabreicht worden sind.
Kranke Tiere	22/33		20/60
Gesunde Tiere	11/33		4o/6o

ρ < o, öl

to α> ο

Beispiel 6 TABELLE VI

Therapeutische Wirkung der Bakterien-Neuraminidase auf Frettchen, die mit dem Grippe-Virus MRC 11 infiziert worden sind.

CD O CO CO

Untersuchungs- reihe	Kontrolle	Gesunde Tiere	Neuraminidase 6 h später verabreicht	Gesunde Tiere	Neuraminidase 6 h zuvor verabreicht	Gesunde Tiere	Neuraminidase 18 h da nach verabreicht	Gesunde Tiere
1. Reihe (6 Frettchen) 2. Reihe (12 Frettchen) 3. Reihe (9 Frettchen) 4. Reihe (8 Frettchen)	Kranke Tiere	0/3 o/4 o/3 o/4	Kranke Tiere	3/3 4/4 2/3	Kranke Tiere	4/4 3/3	Kranke Tiere	2/2
Insgesamt (35 Frettchen)	3/3 4/4 1 totes Tier am Tage 8 3/3 4/4	0/14	ro <}" ro OO O	l/lo 9/lo	o/4 o/3	o/7 7/7	2/2	2/2 2/2
14/14

ρ ζ ο,οοΐ

ρ 4. ο,οοΐ

ρ < ο,οοΐ

ρ < ο,οΐ

Beispiel 4

Histogramm I

A/Victoria 3/75

Cn O

0)

-P (M -H

U 1)

ro .C

C U

Li H

(D Li

ι I ι I

•H (D

e-< e

I O

< (D

Γ

-4

1-3

-2

-1

Zugabe der Neuraminidase

nach 6 h

nach 24 h

nach 3o h

nach 48 h

virus (Kontrolle) Virus + Neuraminidase

nach 54 h

Vermehrungsgrad des Virus in Anwesenheit von o,5 Einheiten Neuraminidase in Abhängigkeit

von dem Zeitpunkt der Enzymzugabe.

Histogramm II
A/Port Chalmers 1/73

□ Virus (Kontrolle)

Ε» Virus + Neuraminidase

r-5

CN rH

Γ- Q) -P

JZ -P Ü -H IO S C

(Λ

l-l (D 0) Ä -P U -H W tn -H I U < -P

ι ω ε ο ω υ

-3

_2

-1

Zugabe der Neuraminidase

nach 6 h

nach 24 h

nach 3o h

nach 48 h

nach 54 h

von dem Zeitpunkt der Enzymzugabe.

Histogramm III
Λ/Ilong-Kong 1/68

Virus (Kontrolle) Virus + Neuraminidase

IO O CO 00 CJl

CNl r-f

-P

,C +> U -H ro T, C

cn

■ρ υ ■Η CO

I S-I

< -P K (U

Q) O

Zugabe der Neuraminidase

nach 6 h

nach 2A h

nach 3o h

nach 48 h

nach 54 h

von dem Zeitpunkt der Enzymzugabe.

	I	OP	OO	VO	Γ-
				CN	(Τ\
	rö			OO
	Eh		in
	in	ft	in
					co
		•H	in
		EH	VD		^r
			00	•sr	^
	S			σι	«3*
	Oi		σι	OO	VD
	Eh		f—
	CN	-P	¹^	LT)	Γ-
	^—	-H	r~	O
		Eh	ro	OO	ιη
			σι	VD	ιη
				(Ti	OO
				OO
	S		•sr
		id	^r
	(Tl	4->	OO	ι--	Γ—
		-H	in
		Eh		oo
			OO	VD	Γ-
	S			Γ	ΓΟ
	o-			ΟΟ

		id	^r
		4-1	OO
		•Η		σι	^J*
X,		Eh		OO	VD
U				γ	VO
	I		σι
	I	a°		όο	OO
	in		VD	OO	Γ-
§			^—
		ter	oo	VD	(N
	S	•Η	in	σι	O
		Eh	σι	"""
	Eh			Γ-
			σι	'36!	•sr (Τι
	CN	q!	VD
		4-)	OO	in	in
		-H	VD	ro	■sr
		Eh	ι*	oo	OO
			ΟΛ		■sr
		*<>**	OO
				oo	CN
				σι	(Ti
		id	O
			oo	O	CN
	4-> U to •Η δ :Q Eh T) i-j	-H		oo	ro
U	to	Eh	s	oo	oo
Oi	ten/
	•Η QJ H


		U	O
		O	ο
QJ C		^r	CN	U
t9 E		⁺	CN	O
3		6	ro
I		CN	⁺

h !
< +J

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Tabelle VIII

to ο CO 00 Ol

O Ol

	Aufbevahrungs- tetnperatur	Titer der Lösung (Einheiten/ml)	Dosis nach	5 Tagen	%	9 Tagen	%
1. Untersuchung 2. Untersuchung	20 - 22 ⁰C 11	1750 1717	Titer	84,5 85	Titer	77 78,2
1473 1460	1348 1344

(Ti

cn ay

oo

	ι	k	igen	3	dP	8
			LO	< -P		'S" ro
			^-	ter I	σι
		-H
		E-I
υ
S
	S	<#>	ro
co
co	&
S	,_		Q
	1—	+J	Q
		•H	CN
	S		ι ^ I σι
	Cp	dP
	in		LD
		Ö
		-P	σι
	iten/ml)	•H
der	Ti (L)		oo
3-S		ro
(Eir		(N
		CJ
		ο
		<N
		(N

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ORiGlNAL INSPECTED

Tabelle X

co

CO 00 in

σ cn -j ο

Sprüheinrichtung	Titer der Lösung (Einheiten/ml)	Versprühtes Material	%
1 * 2 *	2150 Il	Titer*	76 96
1630 2056

ro co

cn

OO

Tabelle XI

co ο co 00 cn

ο cn

Titer der eingesetzten Lösung (Einheiten/ml)	Aerosol	Titer *	%
2006 *	1950	97,2

VO I

ro <o ο cn cn

00

Tabelle XII

Betriebszeit	Lösung	Volumen	Titer (Einheiten/ml)	Gesamt- % aktivität	87,5
0 (Beginn) 2 Stunden	19 ml 10 ml	2765 4600	52 535 46 000

Tabelle XIII

co ο to

Betriebs dauer	Restliche Lösung	Volumen (ml)	Titer (Einheiten/ml)	Gesamt- aktivität	%	Proteine	Mg/ml	Gesamt menge (mg)	%	Spezifische Aktivität
0 (Beginn) 20 Minuten 40 Minuten 60 Minuten	Neuraininidase-Aktivität	20 10 3 0 (Spülen der Vorrich tung mit 2 ml Wasser)	3600 4167 5037 1188	72 000 41 670 15 110 2 375	58 21 3	223 310 444 154	4,46 3,10 1,33 0,3	69,5 29,8 6,7	16 150 13 440 11 340 7 710 1

ro <o ο cn

Tabelle XIV

to
ο
to

I Betriebs dauer	Restliche Lösung	Neuraminidase-AJctivität	Volumen (ml)	Titer (Einheiten/ml)	Gesamt aktivität	%	Proteine	μg/ml	Gesamt menge (mg)	%	Spezifische Aktivität
I 0 (Beginn) 1 Stunde	20 8,5	3700 6470	74 000 55 000	73	225 351	4,5 2,99	66,4	16 400 18 400

Tabelle XV

Betriebs dauer	Restliche Lösung	Neuraminidase-Aktivität	Titer (Einhei ten/ml)	Gesamt- aktivität	%	Proteine	4,48 3,25	%	Spezifi sche Aktivität
0 (Beginn) 1 Stunde Waschflasche 1 Waschflasche 2 Waschflasche 3 Waschflasche 4 Waschflasche 5 Waschflasche 6	Volumen (ml)	3700 5960 68 13,5 "7,1 2,85 2,6 15 *	74 000 67 350 2 72O\ 540 285 114 106 6ooy	91 5,9	ι μg /ml Gesamt- Uenge (mg) I	72,6
20 11,3 40 Il It Il Il Il	224 288 Bestim mung unmög lich Il M Il ti ti	16 500 20 700

Claims

Patentansprüche

1. Pharmazeutische Zubereitungen zur Behandlung von durch Viren verursachten Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet , daß sie aus Kulturen von Streptococcus
pneumoniae (Micrococcaceae) gewonnene N-Acetylneuraninat-

glykohydrolase als Wirkstoff in Kombination mit inerten,

nichttoxischen, pharmazeutisch verträglichen Bindemitteln, Trägermaterialien und/oder Kilfsstoffen enthalten.

2. Pharmazeutische Zubereitungen nach Anspruch 1, da-

durch gekennzeichnet , daß sie als Wirkstoff die durch Züchten des beim Institut Pasteur, Paris, Frankreich unter der Nr. I-o44 hinterlegten Streptococcus pneu-

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" ² " -2405678

ff

NAOHOERBOHT

moniae gewonnene N-Acetylneuraminat -glykohydrolase enthalten.

3. Pharmazeutische Zubereitungen nach den Ansprüchen oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß die

enthaltenen Bindemittel, Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffe für eine Verabreichung der Zubereitungen auf parenteralem, percutanem, rektalem Wege oder über die Schleimhaut geeignet sind.
Io

4. Pharmazeutische Zubereitungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß sie N-Acetylneuraminat^glykohydrolase in Dosiseinheiten von 3oo bis 5ooo Einheiten enthalten.

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ORIGINAL INSPECTED