DD141903A5 - Verfahren zur gewinnung eines enzymbakteriums mit antiviruseigenschaften - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Enzymbakteriums mit Antiviruseigenschaften« Es wird angewandt in pharmazeutischen Zubereitungen zur Behandlung von durch 'Viren verursachten Krankheiten· Insbesondere wird es angewandt als Grippeschutz- oder Heilmittel«

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits eine Reihe von N-Acetylmuraminat-glykohydrolasen oder von ÜTeuraminidasen bakteriellen oder viralen Ursprungs bekannt· So wurden bereits die Neuraminidase von Vibrio cholericum, Clostridium perfringens, Vibrio comma und von verschiedenen Influenzaviren beschrieben«

Diese Heuraminidasen besitzen verschiedene Glykoproteinstruktüren und unterschiedliche physikalische und chemische Eigenschaften«

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Ziel der Erfindimg .

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen und v/irtschaft liehen Verfahrens zur Herstellung eines Enzymbakteriuras mit verbesserten Antivirus·=·, Antineuraniinidasen- und iimnunostiaulierenden Eigenschaften»

Darlegung des WeSeHS₁ der _: Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen geeigneten Bakterienstamm zu finden und diesen so zu behandeln, daß ein Enzyinbakterium mit Antivirus eigenschaft en erhalten wird·

Erfindungsgemäß wird ein Enzymbakterium mit Antiviruseigen~ schäften in der V/eise hergestellt, daß man einen Stamm der Streptococcus pneumoniae in einem proteinreichen Medium anbaut, am Ende der Kultur ein eiweißspaltendes Enzym hinzu*- fügt, 3~mal nacheinander die H~Acetylmuramiiitglykohydrolase abscheidet, die durch das Aramoniurasulfat freigesetzt wird, das Enzym in lösung durch Dialyse, danach durch SäulenChromatographie von CarboxymethylZellulose reinigt auf pH 6,8 und das Eluat zum Trocknen durch Lyophilisierung (Gefriertrock« nen) führt und von neuem zur Säulenchromatographie mit Ionen*-» austausch-übergeht« · ' '

Der erfindungsgemäß verwendete Stamm Streptococcus pneumoniae ist im Institut Pasteur, Paris unter der Hr · 1-044 hinterlegt»

Erfindungsgemäß wird li-Acetylmuraminatglykohydrolase nach Chromatographie erhalten,, die einen speziellen Wert von ungefähr 20 000 U besitzt«

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Mit dem erfindungsgemäß hergestellten Enzymbakterium mit Antiviruseigenschaften werden pharmazeutische Zubereitungen hergestellt zur Behandlung von durch Viren verursachten Er~ krankungen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie als Wirkstoff die aus Kulturen von Streptococcus pneumoniae (der Familie der Micrococcaceae) gewonnene U-Acetylmuraminatglykohydrolase enthalten, welcher Wirkstoff neben üblichen, inerten, nichttozischen, pharmazeutisch verträglichen Bindemitteln, Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffen vorliegt·

Die in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen enthaltene U-Acetylmuraminat-glykohydrolase ist ein Enzym, das dann, wenn es am nichtreduzierenden Ende einer Polysaocharidkette gebunden ist, dazu in der Lage ist, die U-Acetylmuraininsäure von Glykoproteinen abzuspalten*

So hat sich bei der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen IT-Acetylmuraminatglykohydrolase gezeigt, daß das mit Hilfe der nachstehenden Verfahrensweisen gebildete Produkt physikalische Eigenschaften besitzt, die sich von denen der bislang bekannten anderen STeuraminidasen unterscheiden»

In der Tat besitzt dieses Enzym keine Galactosidase-, Protease-, N-Acetyl-glucosaminidase-, Pucosidase- oder Arylsulfatase-Wirkung, wodurch sie sich von den anderen Neuraminidasen unterscheidetβ

Weiterhin besitzt die bei Verwendung von Bronchienglykopeptiden als Substrat ermittelte Michaelis-Konstante Κ,τ einen Wert von 2,3 x 10"* , was die sehr starke Affinität dieses Substrates belegto

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Der durch Isoelektrofokussierung bestimmte isoelektrische Punkt weist auf zwei Aktivitätsmaxima dieses Enzyms hin, was auf die Anwesenheit von zwei Isoenzymen mit pHi-Werten von 4,2 und' 3,7 schließen läßto Aufgrund dieser Eigenschaft unterscheidet sich das erfindungsgeinäß verwendete Enzym von der aus Clostridium perfringens isolierten lieuraminidase, die homogen ist und deren isoelektrischer Punkt bei einem pH-Wert von 4,7 liegt*

Das Enzym des Streptococcus pneumoniae setzt die N-Acetylaeu« raminsäure der menschlichen dO..~Glykoproteinsäure im Verlaufe von 7 Stunden zu 82 % und praktisch die Gesamtmenge (90 %) der H-Acetylneurarninsäure eines Bronchiensialomucins in einer Einwirkungsdauer von β Stunden frei«

Die chemische Struktur der aus Streptococcus pneumoniae ge~ \70WiQiien H-Acetylmuraminat-glykohydrolase wurde bereits von P._: Bienvenu, C« Gaget, C_e B.ottex und R. Fontanges (CR* Acad, Sei· (Paris) 285 (Section D) 837 (1977)) beschrieben, ebenso wie ihr Gehalt an verschiedenen Aminosäuren« Sie unterscheidet sich in dieser Hinsicht von der Heuraminidase, die man durch enzymatisch^ Hydrolyse des Grippevirus A (Hong-Kong) 1/68 erhält.

Die erfindungsgeinäßen pharmazeutischen Zubereitungen könnenin galenischen Formen vorliegen, die ihre Verabreichung auf parenteralemj, permukalem (über die Schleimhäute), perkutanem, perlingualem oder rektalem Wege ermöglichen« Sie liegen insbesondere in Form von injizierbaren Lösungen oder Suspensionen^ die in Ampullen, Melirf achdos enf las chchen oder Wegwerf injektionsspritzen enthalten sind, Sublingualtabletten, Aero·^ solpräparaten zum Besprühen der Hasen- oder Halsschleiinhäute_s

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von lösungen in einem die Haut durchdringenden Lösungsmittel zur perkutanen Verabreichung oder von Tabletten oder Suppositorien vor*

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen enthalten weiterhin eines oder mehrere Produkte aus der Bindemittel, Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffe umfassenden Gruppe, die inert, nichttoxisch, pharmazeutisch verträglich und für.die Verabreichung auf parenteralem, permukalem, perkutanem, perlingualem oder rektalem Wege geeignet sind«

Man kann sie weiterhin mit.Haftmitteln, Füllstoffen, Verdünnungsmitteln, Dispergiermitteln, oberflächenaktiven Mitteln, Duftstoffen, Aromastoffen, Emulgiermitteln oder ihre Verteilung im Organismus verzögernden Mitteln versetzen« In Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg kann die Einzeldosis innerhalb weiter Grenzen variieren« Die Einzelverabreichung erstreckt sich beim Erwachsenen insbesondere von 300 Einheiten bis 5000 Einheiteno Die tägliche Dosis für den Erwachsenen umfaßt insbesondere die ein- bis viermalige Verabreichung der angesprochenen EinzeldosiSe

Insbesondere im Pail der Verabreichung über die Schleimhäute, die Nase oder den Mund-Rachenraum bewirkt man während zwei Tagen drei Sprlihbehandlungen mit einer Lösung oder Suspension in einem wäßrigen Trägermaterial«, Im Pail der Verabreichung auf parenteralem Wege kann man während 1 Woche'eine Injektion täglich und dann während 2 Monaten eine Verabreichung wöch-ent· lieh bewirken«

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Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen sind für die Behandlung von durch Viren und Bakterien verursachten Erkrankungen geeignete Sie .wirken insbesondere gegen Myxovirus influensae, Rhinovirus und sämtliche Virenstämme, die auf Heuraminidase ansprechen« Diese Wirkung kann entweder einer direkten Wirkung auf die Glykoproteinhülle des Virus zugesprochen werden, wodurch die Anzahl der Zellschädigungen, die mit der Reproduktion der Virenelemente verrknüpft sind, vermindert wird. Sie können auch über einen spezifischen immunostimulierenden Effekt auf die Keime wirken, deren pathogene Wirkung über eine Heuraminidase ähnlicher Antigenstruktur vermittelt wird (beispielsweise Erysipelotrix bei Tieren), Schließlich kann man den erfindungsgemäß eingesetzten Wirkstoffen eine unspezifische immunostimu« lierende Wirkung zuschreiben, die ihre Verwendung bei der Behandlung von Rhinitis, Rhinopharyngitis, Sinusitis, Angina, Amygdalitis, Laryngitis, Tracheitis, akute Bronchitis,, Bronchiolotis, Bronchopneumonien oder chronischer Bronchitis ergänzt e

Man kann den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung gen auch eine Antitumorwirkung durch Beseitigung der Sialinsäure von der Oberfläche der Zellmembranen, wodurch deren Immunogenität gesteigert wird, zuschreiben_e

a) Wenn man die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zuberei» tungen vo£beug^d v/ährend der ersten beiden Tage des Mo<~ nats im Verlaufe der 6 Wintermonate an Personen, die der Grippe ausgesetzt.sind, oder bevor die Symptome in der Umgebung der von Grippe befallenen Person auftreten, verabreicht, verhindern sie die Phase, der VirusVerbreitung nach dem Befall der Zelle, verhindern das, Auftreten von

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. klinischen Anzeichen der Grippeinfektion, nämlich von Fieber, Schmerzen, Müdigkeit, Muskelkater, Kopfschmerzen etc· und verhindern zusätzliche Bakterieninfektionen*

b) Wenn man die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen nach dem Auftreten der ersten Anzeichen zum Zwekke der Heilung verabreicht, verursachen sie eine Verbesserung der Zellrückbildung, unabhängig davon, v/elcher Stamm für die Erkrankung verantwortlich ist, beschleunigen die klinische Heilung und verhindern Komplikationen, insbesondere pneumopathologische Krankheitsbilder·

Sie besitzen den großen Vorteil im Hinblick auf die Unschäd« lichkeit, da sie aufgrund der sehr ausgefeilten Herstellungsverfahren in ultrareinem Zustand vorliegen, einen neu«" tralen pH-Wert aufweisen, frei von Zellgiften sind und nicht die Nachteile von Stoffen besitzen, die ausgehend von abge« schwächten oder abgetöteten Viren hergestellt worden sind und deren Wirkung nur vorbeugend ist, deren antigenes Verhalten nicht stark ausgeprägt und deren Bildung von Antikörpern gering ist, deren Toxizität weit davon entfernt ist, vernachlässigt werden zu können, und deren gesamte Reinheit nicht stets gesichert ist«,

Die immunostimulierende Wirkung der erfindungsgemäßen 'pharmazeutischen Zubereitungen wurde experimentell nachgewiesen!

In__vitro zeigt sich eine Aktivierung der Mäkrophagen durch:

eine größere Verbreitung«, eine Steigerung der Phagozytose,

eine Erhöhung der Anzahl der Rosetten E und Rosetten EAC_;

ft U5S -8- Berlin, d. 21.6*1979

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νω.ά eine Steigerung der DNA-Synthese in Gegenwart von Lectinen» · \ ·

In vivo kann man . ...-...: eine Steigerung der humoralen Reaktion,

eine Stimulierung der verzögerten Hypersensibilität feststellen«

Man kann die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen somit dazu verwenden, die Bildung eines Autovakzins, ausgehend von Tumorzellen oder von Ketero-vakzinen, anzuregen·

Weiterhin verursacht die von Streptococcus pneumoniae Nr₉ 1-044 gebildete Bakterienneuraminidase aufgrund ihrer Wirkung auf die Glycoproteine der Bronchienschleimhaut eine beträchtliche Verminderung der Viskosität, die bis zu 40 % erreichen kajin« Aufgrund dieser Wirkung ist die erfindungsgemäß vervyendete Neuraminidase für die Behandlung von chronischen Bronchialerkrankungen geeignet»

Die immunostimulierende und antivirale Wirkung der erfindungsgemäßen Arzneimittel sind als überraschend und nicht vorhersehbar anzusehen, da experimentelle Untersuchungen durch intratumorale Injektionen, insbesondere in ein Malpighi* Karzinom (P_t Binder, C<,IU Acad« Sei« 481 (1975j Serie D) 1545) bei der Ratte eine erheblich erhöhte vorzeitige Mortalität durch Metastasenausbreitung gezeigt haben* Weiterhin haben TumorzeIlen _t die zuvor durch Bestrahlen mit Röntgenstrahlen abgetötet, dann mit Ueuraminidase behandelt und schließlich an Muse injiziert worden sind, bevor man denen Tumorzellen B^- implantiert hat, das Wachstum der implantierten Tumoren stimuliert«,

2 1 1 053 - 9 - Berlin,d.21.6.1979

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Weiterhin haben die Arbeiten von Ρ· Bienvenu et al·. (loc# cit·) gezeigt, daß die Bakterien-ITeuraminidase offenbar frei ist von einer Schutzwirkung gegen durch den Grippevirus verursachte Infektionen·

Aus all diesen Gründen sind die antiviralen und inmiunostimulierenden Wirkungen, die in der Humantherapie oder der Vete·^ rinärmedizin angewandt werden können, aufgrund der vorbekannten Literatur als überraschend anzusehen und ermöglichen die erstmalige therapeutische Anwendung von pharmazeutischen Zubereitungen, die als Wirkstoff die U-Acetylmuraminat-glykohydrolase von Streptococcus pneumoniae enthalten·

Ausführun^sb eispiel

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung«

Beispiel 1_

Gewinnung von H-Acetylmuraminat-glykohydrolase aus Streptococcus pneumoniae

Der zur Gewinnung der lleuraminidase verwendete Stamm ist ein Streptokokkus, der der Pamilie der Micrococcaceae angehört und vüD.ler der Ur· 1-044 in der Sammlung des Instituts Pasteur, Paris, Frankreich, hinterlegt worden ist₀

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Eisenschaften '

Es handelt sich um einen gram-positiven, gepaarten Kokkus mit in gewissen Pällen sehr kurzen Ketten, der (manchmal) eingekapselt ist und gegebenenfalls ein aerobes Verhalten zeigte Die optimale Kulturtemperatur liegt bei 37 ⁰C₀

Aufbewahrung

Dieser Stamm wird auf mit Malidixinsäure versetztem Agar aufbewahrt (Institut Pasteur)₀

I₁₁C₁₁ Herstellung; dieses Mediums

Man suspendiert 29 g des entwässerten Mediums in 1 1 destil~ liertem Wasser, v/artet 5 Minuten und mischt dann durch, bis man eine homogene Suspension erhält* Man erhitzt dann langsam unter Rühren und läßt bis zur vollständigen Auflösung kochen* Dann stellt man den pH-Wert erforderlichenfalls auf 7,2 ein und verteilt in Röhrchen, die man während 20 Minuten bei 120 ⁰C im Autoklaven sterilisierte Nach dem Sterilisier ren läßt man auf etwa 50 ⁰C abkühlen und gibt 10 % steriles Pferdeblut zu, Man homogenisiert vorsichtig, um keine Luftblasen zu verursachen, und läßt dann in geneigter Stellung abkühlen© "

Das Animpfen erfolgt in Streifen auf der geneigten Agarober« fläche© Das Inkubieren dieser angeimpften Agarmedien erfolgt während 18 bis 24 Stunden bei 37 °C im Wärmeschrank© Das inokulierte -Material wird anschließend zur Aufbewahrung auf . 20 %±gQT Magermilch gefriergetrocknet«

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II,, Herstellung der Impfkultür

suspendiert den Inhalt eines gefriergetrockneten Röhr~ chens in etwa 2 ml eines Mediums, der folgenden Zusammensetzung:

Gehirn-Herz-Brühe (Difco) 25 g/l

Heopepton (Difco) 1 g/l

Destilliertes Wasser ad 1 1

pH^-Wert mit Natriumhydroxid auf 7,8 eingestellt Sterilisation '30 Minuten bei 120 ⁰O

pH-Wert nach dem Sterilisieren . 7»6

Man verwendet diese Suspension zum Animpfen eines Kolbens, der 4 1 des gleichen Mediums enthält·

Die anaerobe Inkubierung erfolgt ohne Rühren und ohne Belüften während 24 Stunden in einer bei einer konstanten Temperatur von 37 ⁰C gehaltenen Umgebung«

III« Produktion

Man überführt die in diesem Kolben erhaltenen 4 1 der Impf« kultur zum Zwecke des Animpfens in einen Produktionsvermenter,

3

der 1 nr des Mediums der- folgenden Zusammensetzung enthält:

Pastose (Institut Pasteur) 10,0 g/l

Cerebrin 1,0 g/l

Fleischextrakt (Merieux) 3,0 g/l

HefeautoIysat (Pould-Springer) 3,0 g/l

Bikaliumphosphat 1,0 g/l

natriumchlorid 5,0 g/l Leitungswasser ad 1000 1

\ \ 051 - 12 - -Berlin,d·21.6.1979

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Spontaner pH-Wert ;........ .-.. - '

mit Natriumhydroxid eingestellter pH-Wert Sterilisation

pH-Wert nach dem Sterilisieren

6j	7,	8,	0
7,	8S	0
>8 bis	20 Minuten	,bei
,8 bis	120 0C
8j	2
,0 bis

Fermentationsbedingungen: -:

Belüftung keine

Rühren- 20 min"¹

Temperatur . - 37 ⁰C

Dauer 29 Stunden

Hach Beendigung der Fermentation gibt man 0,1 g/l lysozym zu, um das Platzen der Zellen zu begünstigen und die Diffusion der Heüraminidase in das Medium zu ermöglichen« Man rührt während 3 Stunden bei 37 ⁰C und läßt anschließend auf etwa 20 ⁰C abkühlen, ·

Man verfolgt den Ablauf der'Fermentation durch:

mikroskopische Untersuchungen zur Verfolgung der Entwicklung des Streptococcus pneumoniaej . ...

pH-Wert-Messungen, da das Medium schwach sauer'wird und beim Ende des Fennentatiönsvorganges einen pH-Wert von etwa.6,5 erreicht, -und . . .. .. durch Bestimmung der Neuraminidaseaktivität«

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TV> Extraktion Durch fraktionierte Ausfällung

1· Man gibt 500 g/l Ammoniumsulfat zu der Fermentationsbrühe in Gegenwart von 3 g/l eines Filterhilfsmittels (Hyflosuper~ eel) su_e Man rührt während 1 Stunde, filtriert mit einer Filterpresse, wäscht den Filterkuchen mit einer wäßrigen 40 ?£igen Aramoniumsulfatlb'sung und nimmt den Filterkuchen bei + 4 ⁰C mit dreimal 5 1 destilliertem Wasser auf*

Zu 15 1 der in der obigen Verfahrensstufe 1 erhaltenen Flüssigkeit gibt man nach der Bestimmung der Sulfationenkonaentration in Gegenwart von 40 g/l des Filterhilfsmittels (Hyflosupercel) Ammoniumsulfat in einer solchen Menge zu, daß sich eine Ammoniumsulfatkonzentration von 250 g/l ergibt· Man rührt während 1 Stunde und filtriert dann über einen Büchner-Filter·

?« Filterkuchen 40 %

Zu dem in der obigen Stufe 2 erhaltenen Filtrat gibt man 250 g/l Ammoniuiüsulfat in Gegenwart von 10 g/l des Filterhilfsmittels (Hyflosupercel)· Man rührt während 1 Stunde«, filtriert über einen Büchner-Filter, wäscht den Filterkuchen mit einer wäßrigen Aramoniumsulfatlösung mit einer Konzentration von 400 g/l, vereinigt die Extrakte und dialysiert sie bei + 4 ⁰G während 15 Stunden bei einem Durchsatz von 20 l/h gegen einen Leitungswasserstrom«

ί 1 058 -14- Berlin, de 21.6.1979

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4,e Chromatographie, über Carboxymethylcellulose (CII.23)

Vorbereitung der_ιSäule (die einen Durchmesser von 15 cm und eine Länge von 100 cm besitzt): Man führt durch die Säule, die. 1,6'kg Carboxymethylcellulose (CM 23) enthält, 55 1 einer Ο,0025 m Phosphatpufferlösung (mit einem pH-Wert von 6,8),

!Fixierung an der Säule;

Die dialysierten Extrakte werden durch Filtration geklärt, worauf man ihren pH-Wert mit 1 m Zitronensäure auf 6,8 einstellt. Dann trägt man sie mit 10 bis 15 1 eines 0,0025 m Phosphatpuffers (pH = 6,8) auf die Säule auf* Totvolumen ί ... 6 1

Volumen der Abströme und der Waschflüssigkeiten: 12 1

Elutioni

Die fixierte Heuraminidase wird mit einer 0,2 m Phosphat/-Citrat/Puff er lösung mit einem pH-Wert von 6,8 in einer Menge von 10 bis 15 1 eluiert, wobei man bei einem Durchsatz von 4 l/h arbeitete

iotvolumen: 6 bis 8 1

Volumen des "Kern"~Eluats: 5 1

Die "Kernfraktion" wird während 16 Stunden bei + 4 ⁰C mit einem Durchsatz von 4 l/h gegen eine 1 %ige ITatriumchloridlösung dialysiert*

!Jach dem Gefriertrocknen erhält man die rohe Heuraminidase mit einer spezifischen Aktivität von etwa 500*

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Reinigung über Sphadex G 50:

Man.führt die Lösung von 10 g Proteinen (bestimmt nach Lowry) in 150 ml eines 0,1 m Phosphat/Citrat-Puffers mit einem pH-Wert von 6,8 durch eine mit Sephadex G50 beschickte Säule (mit einem Durchmesser von 6 cm und einer Länge von 90 cm), die man mit einem 0,1 m Phosphat/Citrat-Puffer mit einem pH-Wert von 6,8 äquilibriert hat_e Man entwickelt mit dem gleichen Puffer und fängt 20-ml-Fraktionen auf«, ..Man vereinigt die Heuraminidase enthaltenden Fraktionen, dialysiert sie während 24 Stunden gegen eine 1 %±ße wäßrige Uatriumchloridlösung und trocknet sie durch Gefriertrocknen* Die spezifische Aktivität des erhaltenen Pulvers beträgt etwa 20 000· Diese in nMol angegebene Aktivität wird dadurch gemessen, daß man die Menge der Sialinsäurc bestimmt, die bei 37 ⁰C im Verlaufe von 1 Minute unter Verwendung von H-Acetylneuraminy!lactose (IiAl¹IL) als Substrat, das 1 mg Protein enthält, freigesetzt wird«

Die enzymatischen Eigenschaften der aus Kulturen von Streptococcus pneumoniae extrahierten und gereinigten H-Acetylneuraminat-glykohydrolase sind in der nachstehenden Tabelle angegeben·

ti ο

~ 16 -

Berlin,d.21.6.1979 AP A61K/211 058 55 051 18

Tabelle	Rohes Heura- minidase- präparat	0	Gereinigte Neuraminidase nach der Chro matographie über Carboxy methylcellulose
Untersuchte Aktivität (pro mg Protein)	3,1	0	500
ETeuraminidase		0
IT~Acetyl-glu~	1,6	0	0
cosaminidase	ß-Galactosidase 0,3		0
	Z-Galactosidase 0,3	0
oC~Pucosidase	0
ß-Fucosidase	0
Arylsulfatase	0
Protease	0

Gereinigte

II e uraminidas e nach der Chromatographie über Sephadex G 50

20 000

0 .0 0 0 0 0 0

Beispiel 2

Dieses Beispiel verdeutlicht die nicht vorhandene antigene Gemeinsamkeit zwischen der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Ueuraminidase und Heuraminidasen viralen Ursprungs.

a) Die Versuchte der neutralisation der Aktivität der aus Streptococcus pneumoniae (Stamm Hr. 1-044) gewonnenen Neu« raminidase durch Seren von Kaninchen, die gegen Neuraminidasen viralen Ursprungs immunisiert wurden, verliefen völlig negativ*· -

\\ OSS --17- Berlin,d.21.6.1979

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Untersuchte Viren: ,

Myxovirus influenzae Menschen: Typ A-ITg

Singapour 57

Hong-Kong 68

England 72

Typ B .

Tiere: A equi 1

A equi

Myxovirus para influenzae ·

Menschen: Typ 1, 2, 3

. Mumps Tiere: Sendai SV 5

b) Die Versuche der neutralisation der aus Viren gewonnenen Neuraminidasen mit einem Kaninchenseruin mit Antineuraminidasewirkung auf der Grundlage von Streptococcus pneu~ moniae sind negativ verlaufen«

Beispiel 3

Wirkung der bakteriellen Heuraminidase auf die Vermehrung des Grippe-Virus A Port Chalmers 1/73 HoIi₂·

Ea wurden verschiedene Gruppen von Bakterien-Heuraininidasen auf Eierschalenfragmenten + MCA untersucht, die in Vertiefungen von Kunststoffplatten aus Polymethylmethacrylat (Perspex) am Leben gehalten werden (Eierschalentest nach Pazekas)· Die« se beiden Zellarten v/erden mit dein Virus A, Port Chalmers angeiinpft (0,1 ml der Verdünnung + 0_?9 ml des Mediums bei

dem Inkubieren während 6 Stunden bei 33 ⁰C gibt man die

einem Infekt ions tit er des Virus von 10""·⁵ ID,.-q/0,1 ml)_e iNfach

1 053 - 18 « Berlin,d.21 «6.1979

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Bakterien-Neuraminidase zu (0,1 ml, Verdünnung 10*" bei einem spezifischen Heuraminidasetiter von 8000 und einer Konzentration von 1 mg Proteine/ml)·

Die ¥/irkung dieses Enzyms auf die Vermehrung des Virus erfolgt im Verlaufe von 72 Stunden· Uach Ablauf dieser Zeit bestimmt man den Infektionstiter des gebildeten Virus durch Ermittlung des hämagglutinierenden Titers HA (an Eierschalen) mit Hilfe von direkt in das Medium eingebrachten roten Blutkörperchen von Hühnern» Die in der Bakterien-Neuraminidase beobachteten Ergebnisse sind in der Tabelle I zusammenge-' stellte Das Inokulieren bei sämtlichen Versuchen erfolgte bei der gleichen Verdünnung, bei dem gleichen Titer und bei der gleichen Proteinkonzentration« * -

Die Wirkung der Bakterien-lTeuraminidase auf die Vermehrung des Virus wurde auch dadurch untersucht, daß man alle 6 Stunden die gleiche Dosis Heuraminidase inokulierte Der Virus entwickelt sich während der ersten 6 Stunden auf den "Eierschalen" (egg bit), die bei 33 ⁰C am Leben erhalten und inkubiert werden«

In der 6e Stunde gibt man eine Dosis der Bakterien-Heuraminidase zu. Man läßt die Vermehrung der Viren 72 Stunden ablaufen» Dann bestimmt man den Infektionstiter durch Hämag— glutinatioH mit 2 % roten Blutkörperchen von Hühnern«

Die nachstehende Tabelle I verdeutlicht die Kinetik der Vermehrung des Grippe-Virus in Gegenwart bzw· in Abwesenheit der Bakterien-lleuraminidase· Es läßt sich eine deutliche Einwirkung der aus Streptococcus pneuinoniae gewonnenen Bakte« rien-Iieuraminidase auf die Vermehrung des Grippe-Virus -feststellen«

1 058 - 19 - Berlin,d.21·6.1979

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Beispiel 4 '

Bestimmung der Wirkung der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Neuraminidase gegen den Vermehrungsgrad von Myxovirus (wilde Stämme) in Abhängigkeit von dem EinführungsZeitpunkt. . .

1_» Untersuchung

Die Neuraminidase wird im Verlaufe der Vermehrung des Myxovirus in einer Eierschalenkultur in einer Dosis von 2,7 Einheiten/ml/Reaktionsnäpfchen inokuliert·

Man beobachtet die Vermehrung der Viren während 72 Stunden bei 33 ⁰C in Abwesenheit der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Neuraminidase,, Nach Ablauf dieser Zeit bewirkt man auf einem Teil der Kultur direkt in den Näpfchen eine Hämagglutination unter Verwendung von 2 % roten Blutkörperchen von Hühnern (PIA/MCA-Titer)« Der andere Teil wird gesammelt, mit anderen Proben vereinigt, bezüglich seiner hämagglutinierenden Wirkung, seiner Neuraminidasewirkung und seines Infektionstiters auf Embryoeier (EID 50) untersucht, bevor er erneut auf. den Eierschalen reinokuliert wird*

. In gleicher Weise verfolgt man diese zweite VirusVermehrung während 72 Stunden bei 33 ⁰C, wonach man das Material sammelt, die hämagglutinierende Wirkung, die ITeuraminidasewirkung und den Infektionstiter bestimmt, das Material erneut auf frischen Eierschalen inokulierte

Der Ablauf der dritten VirusVermehrung erfolgt identisch mit den beiden vorhergehenden«

-20« Berlin,d.21.6.1979 AP A61K/211 058 55 051 18

Parallel dazu verfolgt man die VirusVermehrung in Gegenwart von Beuraminidase, die bei sämtlichen drei Vermehrungsvorgängen in der 6« Stunde des Viruszyklus zugegeben wird·

Der Rest der vereinigten Materialien einer jeden Vermehrung, der nach 72 Stunden gewonnen worden ist, wird aufkonzentriert und gereinigt, um die Morphologie des in Abwesenheit bzw* in Anwesenheit von ITeuraminidase gebildeten Virus zu ermitteln·

Die mit einem fragment der Allant ο chorionmembran (MCA) bedeckten Eierschalen werden bei sämtlichen drei Durchgängen jeweils nach 26 Stunden der Vermehrung entnommen» Einige werden in 2 %igem Glutaraldehyd fixiert, um. mit Hilfe des Elektronenmikroskops das Austreten des Virus aus dem Bereich der Membran festzustellen» Andere werden in 1 %igem Glutaraldehyd fixiert und einer Gefrierätzung unterworfen, um die Unterschiede der Morphologie der infizierten und der nichtinfizierten Membranen zu untersuchen, die mit lieuraminidase behandelt bzw· damit nicht behandelt worden sind·

2, Untersuchung

Man gibt die Neuraminidase im Verlaufe der Vermehrung des Myxovirus A₂ PG/73 und A₂ VlC/3/75 in einer Konzentration von 0,5 Einheiten/ml/Reaktionsnäpfchen "zu.

A₂ V.IC/3/75 der Allantoinflüssigkeit; Eigenschaften: HA-Titer 200

. NA-Titer: 80 . EID 50; _1O7,5

HA ß/MCA; · 1O⁴*⁵

1 058 - 21 - Berlin,d«21.6.1979

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Bakterien-Ueurarainidase: .

Spezifische Aktivität = 27 000 .

Mutterlauge mit 0,1 mg Protein/ml: 27 000 Einheiten/ml Inokulierung: 0,1 ml auf 1/100 ν erdünnt: 2,7 Einheiten/ml/

, . . Näpfchen

Mutterlauge 1/5 verdünnt: 540" Einheiten/ml Inokulierung: 0,1 ml auf 1/100 verdünnt: 0,54 Einheiten/ml/

Häpfchen

Man v/endet die üblichen Methoden an zur Kultur auf Eierschalen,

Hämagglut±nbestimmung,

ITeuraminidasebestimmung und der Bestimmung des EIDj-Q-Werts an embryonalen Eiern»

Man bev/irkt anschließend die Fixierung der Membranen zum Zwecke der Elektronenmikroskopie und der Gefrierätzung»

Ergebnisse

Die erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Histrogrammen I, II und III zusammengestellt:

Hieraus ist zu entnehmen, daß nach der Zugabe der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen ITeurominidase 6 Stunden bzw· 24 Stunden nach dem Beginn der Kultur des Grippe-Virus auf Eierschalen der Vormehrungsgrad des Virus mindestens um 2 log 10 geringer ist als dor der Kontroll-Viren* Die Zugabe nach einer Kulturdauer von 30 Stunden führt ebenfalls noch zu einem positiven Effekt« Die Zugabe nach 48 Stunden bzw» 54 Stunden ergibt einen_geringen Effekt, der jedoch großer ist als Nulle

~ 22 - Berlin,d·21.6·1979

AP A61K/211 058 55 051 18

Beispiel 5

Untersuchung des Vermehrungsgrades der Grippe-Viren in Anwesenheit von variablen Mengen der aus Streptococcus pneumoniae gewonnen UTeuraminidase·

Man bereitet eine Reihe von Lösungen der Bakterien-ÜTeuramini· dase mit unterschiedlichen Proteinkonzentrationen von 0,1, 0,2j 0,4-j 0,6, 0,8 bzw. 1 mg Protein/ml.

Man inokuliert eine Dosis (0,1 ml 10 ) dieser verschiedenen Lösungen in Kulturen verschiedener Grippe-Viren in Eierschalenmedien (MC A-KuI tür en), um die Wirkung·'auf die Vermehrung der Viren zu beobachten.

Material „und Methoden

Grippe-Virus influenzae A: Hong-Kong 1/68

Port Chalmers 1/73

..'.,..: . Victoria 3/75

.Embryoeier mit einem Alter von 11 Tagen·

Die Kulturmethode ist die von Fazekas (1958) beschriebene. Die Eierschalen werden in Zäpfchen von Kunststoffplatten (Polymethylmethacrylat, OMS Perspex) mit 0,6 ml eines Überlebensmediums am Leben gehalten^, Man infiziert sie mit 0,1 ml

— 1 —P,

VirusVerdünnungen, die sich von 10 . bis 10 erstrecken* lach einer Inkubationszeit von 6 Stunden bei 33 ⁰C inokuliert man eine Dosis der Lösung der Bakterien-Heuraminidase mit unterschiedlichen Konzentrationen« Man läßt die Vermehrung während 72 Stunden bei 33 ⁰C ablaufen« Nach Ablauf dieser Zeit entnimmt man 0_f1 ml des Mediums aus jedem Häpfchen, um

11 O

κη

-23 ~ Berlin,d·21.6.1979 AP A61K/211 058 55 051 18

den Vermehrungsgrad des Virus in Abhängigkeit von den unterschiedlichen Konzentrationen der Bakterien-Neuraminidase (bestimmt über den Hämagglutinationstiter HA und den Neuraminidase-Titer des Virus) zu vergleichen. Man bewirkt weiterhin eine Hämagglutination direkt in den Näpfchen mit 0,1 ml einer 0,2 %igen Suspension von roten Blutkörperchen von Hühnern, was es ermöglicht, den Infektionstiter des Virus in Gegenwart der Neuraminidase im Vergleich zu der Kontrolle ohne die Anwesenheit der Bakterien-Ueuraminidase zu untersuchen«

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen II bis XV zusammengestellt.

Beispiel 6

In vivo-Untersuchung der Bakterien-Neuraminidase

A) Die in vitro beobachtete inhibierende Wirkung der Bakterien-Heuraminidase auf die Vermehrung von Grippe-Viren wurde auch in vivo untersucht. Hierzu.wurden Gruppen von Frettchen auf intranasalem Wege, eine bestimmte Dosis des Grippe-Virus (IvIRC 11) verabreicht, worauf man 6 Stunden oder 18 Stunden später eine Dosis der Bakterien-Feuraminidase (2 mg Proteine/ml) verabreichte.

Die Wirkung der Neuraminidase auf die Vermehrung des Virus wird dadurch bestimmt, daß man in Abhängigkeit von der Zeit und durch Vergleich mit den Kontroll-Frettchen, die lediglich mit der Virus-Dosis behandelt worden sind, folgendes bestimmt:

1 05$' . - 24 -. Berlin,ά.21.6.1979

AP A61K/211 058 55 051 18

Das Verschwinden des inokulierten Virus durch Bestimmung des Hämagglutinationstiters, des Ueuramiiiidase-Titers und

des Infektionstiters an Halsabstrichen, die man nach verschiedenen Zeitpunkten (5 -Tagen, β Tagen, 9 Tagen bzw·

.15 Tagen) nach der Inokulation abstreicht»

Die Einschränkung der Bildung von Antihämagglutin und Antineuraminidase-Virusantikörpern

in Halsabstrichen durch Untersuchung der lokalen Antikörper und

in dem Serum durch Untersuchung der im Kreislauf vorliegenden Antikörper« .

Die Frettchen der Gruppen, die lediglich mit dem Grippe-Virus behandelt worden sind, zeigen deutliche Anaeichen der Grippe,d«h«, sie niesen und haben 6 Tage später eine stark laufende Hase, während die Frettchen, denen die Bakterien-lTeuraminidase verabreicht wurde, diese Wirkungen nicht ze igen«.

B) Drei Gruppen von Frettchen werden auf intranasalem Wege mit einer Dosis des Virus IvTRO 11 (1 ml der Allantöinmischung) angeimpft*

Die Bakterien-ITeuraminidase wird auf dem gleichen Wege 6 Stunden nach der Injektion des Virus in einer Dosis zugeführt (1 mg Proteine, die mit 0,5 ml physiologischem Wasser verdünnt sind),,

Man nimmt alle drei Tage nach der Inokulation Halsabstriche, um eine Kinetik der Absorption und der Vermehrung des Virus im Bereich der Luftröhre in Gegenwart und in Abwesenheit der Bakterien-lieuraminidase festzustellen»

an

- 25 - Berlin,d.21.6.1979 AP A61K/211 058 55 051 18

Material und Methoden

Grippe Virus: Recorabinante MRC 1.1 (Al lant ο inmis chung) Bakterien-lTeuraminidase des Streptococcus pneumoniae:

Frettchen: .- . .

Kontrollgruppe, die nur mit dem Virus behandelt wird, Gruppe, die mit dem Virus und 6 Stunden später mit der Bakterien-Iieuraminidase behandelt wird und Gruppe, die mit dem Virus und 6 Stunden vorher mit der Bak~ terien-Neuraminidase behandelt wird«,

Die alle drei Tage erfolgenden Abstriche v/erden in 1,5 ml Überlebensmedium (Parker) suspendiert und im Hinblick auf den viralen Hämagglutinationstiter (HA-Titer) und die Hämagglutinin-lnhibierung (IHA~Titer in bezug auf das Virus MRC 11) untersucht· .. . .

Man bewirkt eine schwache Herzpunktur am 15« und am 21. Tag nach der Inokulation, um den Spiegel der zirkulierenden Antikörper festzustellen·

Ergebnisse

Kontrollgruppe: Die Prettchen wurden sum Zeitpunkt Hull mit einer Dosis des Virus MRC angeimpft. 6 Stunden später wurden sie mit 0,5 ml physiologischem Wasser behandelt.

Drei der Frettchengruppen haben ihr Inokulum sehr gut absorbiert «Im Gegensatz dazu zeigt eine Gruppe der Prettchen nach dem Inokulieren ein starkes Niesen©

11 CmÖ '.-.26-., Berlin,d.21.6.1979

AP A61K/211 058 55 051 18

Alle Erettönen- leiden nach dem β« Tage nach der Inokulierung an starken GrippeSymptomen:

Sehr rote Augen, laufende Nasen, mattes und struppiges Pell, Zittern, Niesen, apathisches Verhalten und Appetitlosigkeit«

Es ist eine erhebliche Mortalität der Kontrolltiere zu beobachten«. Demgegenüber zeigen die anderen Kontrollfrettchen vom Sc Tage an einen verbesserten Gesundheitszustand»

Der HA-Titer, der die Anwesenheit des Virus anzeigt, nimmt bis zum 6« Tage zu (wobei er sein Maximum vom 3« bis zum 6« Tage durchläuft) und nimmt dann wieder ab, um am 15· Tage völlig zu v-erschwinden.

Im Gegensatz dazu erscheinen die Anti-HA-Antikörper am 6* Tagvund nehmen progressiv bis zum 21« Tag zu.

Behandelte Gruppen, 6 Stunden nach der Inokulation des Virus:

Die Frettchen wurden mit einer Dosis des Virus MRC 11 zum Zeitpunkt Hull behandelt und dann 6 Stunden später mit einer

Dosis der Bakterien-Neuraminidase,,

Insgesamt zeigten die in dieser Weise behandelten Frettchen ein gewisses -Niesen nach der Inokulation des Virus: sie haben jedoch sämtlich die Bakterien-Neuraminidase sehr gut absorbiert«,

211 058 - 27 ~ Berlin,d.21.6.1979

. AP A61K/211 058 55 051 18

Ergebnisse

Die im. Verlaufe der verschiedenen Untersuchungen der Verabreichung der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Neuraminidase sind in den nachstehenden Tabelle V bis VII zusammengestellt·

Beispiel 7 .

Klinische Untersuchung der Antigrippe-Wirkung der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Keuraminidase.

A) Untersuchte Patienten: . ...

Pur die Untersuchung wurden neun-Familien herangezogen: 19 Erwachsene, d_eh» 7 Männer mit einem Alter von 38 bis 66 Jahren und 12 Frauen mit einem Alter von 35 bis 80 Jahren und ...

8 Kinder, d_eh· 3 Mädchen mit einem Alter von 10 bis 14 Jahren und 5 Knaben mit einem Alter von 7 bis 14 Jahren.

B) Dosierung:

Es wurde dreimal täglich eine wäßrige Lösung in die Nase eingesprüht, die pro Versuch 330 Einheiten der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Üeuraminidase enthielt« Da die.Behandlung an zwei aufeinanderfolgenden Tagen erfolgte, wurden insgesamt 4000 Einheiten der aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Ueuraminidase verabreichte

C) Ergebnisse:

1. Heilbehandlung (17 Patienten)

Die Wirkung wurde· subjektiv als sehr günstig bezeichnet« Es ergab sich in allen .Fällen ein glatter unkomplizierter Verlauf ei ei" Erkrankung.

\ V--058 . - 28 - Berlin,d.21.6.1979

AP A61K/211 058 .55 051 18

2« Vorbeugende Behandlung (18 Patienten)

- Frühzeitige Behandlung: Lediglich ein einziger von 12 in "Kontakt" stehenden Personen erkrankte.

- Verzögerte Behandlung: Es erkrankten 3 Personen von 6 in "Kontakt" stehenden Personen«

D) Verträglichkeit:

Die Verträglichkeit v/arin allen lallen ausgezeichnet»

Beispiel 8

Ermittlung der Reinheit der .aus Streptococcus pneumoniae gewonnenen Bakterien-Meuraminidase durch Elektro-Pokussierungo .

Verfahrensweise

Herstellung der Platten nach CU Karlsson, H_e Davies, J· Ohamn und U_eB· Anderson (IiKB Laboratories Application No, 75) und

O»--Vesterberg (science Tools, LICB Instrument Journal

Vol_e 20, Ho. 2-3, 1973)ο "

Pur die Herstellung einer Platte mit den Abmessungen 26 χ 12,5 cm vermischt man die folgenden Lösungen in der angegebenen Reihenfolge:

Eine Lösung von 2.27 g"Acrylamid und O_sO73 g N_?N'-Methylen-bi3-acrylainid

in destilliertem V/asser ad 20 ml

Eine Lösung von 7,5. g Harnstoff in

destilliertem Wasser ad 36 ml

211 053 - 29 - Berlin,d.21.6.1979

AP A6IK/211 058 55 051 18

Ampholin-Lösung 3,5-10 3 »2 ml

0,004 #ige Riboflavin-Lösung in . . .

destilliertem Wasser 0,8 ml

Anschließend bewirkt man die 'Photopolymerisation.

Herstellung der aufzutragenden Lösungen

Die Neuraminidase muß einen Gehalt von Mineralsalzen von

^ 75 % besitzen· Die Auftragungen erfolgen für den nachweis der Proteine in einer Menge von etwa 350/ug (als Proteine nach Lowry gerechnet) und für die Bestimmung der Heu·™ raminidaseaktivität in einer Menge von etwa 10 000 ITeuraminidase-Einheiten (UAIJL-Einheiten). Sie entsprechen Lösungsvolumina zwischen 10 und 20/ul·

Pur diese Untersuchung verv/endet man eine neuraminidase bakteriellen Ursprungs mit einem Titer von 3700 Einheiten/mg, die pro Milligramm 257/Ug Proteine enthält« Man löst 13 des Produkts in 0,1 ml destilliertem Wasser·

Zum Nachweis der. Neuraminidase-Aktivität entnimmt man für die Auftragimg 20/ul (etwa 9620 lieuraminidase-Einheiten),. Zum Nachweis der Proteine entnimmt man. 10/Ul für den Auftrag (etwa 334/Ug).

Erforderlichenfalls bereitet man sum nachweis der Proteine und der nouraminidase-Aktivität zwei getrennte.Lösungen*

.Auftrag

Man imprägniert zwei Papierbändchen (Whatman ITr· 1) mit den Abmessungen 10 χ 5 mm, und zwar eines mit der Lösung sum Nachweis der Proteine und das andere mit der* Lösung zürn nachweis der neuraminidaae-Alctivität«

- 30 - Berlin,d.21.6*1979 AP A61K/211 058 55 051 13

Man legt die Bändchen in der Zone mit saurem pH-Wert (4 bis 5) auf das Gel auf* -

Blektrofokussierung . .

Die Elektrofokussierung erfolgt, bei + 4 ⁰C in einem Kühlschrank (IjKB)₈ Bei konstanter Stromstärke (40 mA) läßt man die Spannung einen Wert von 1000 V erreichen (Dauer etwa 1 Stunde), Dann schaltet man auf konstante Spannung (1000 V) um, bis sich eine konstante Stromstärke (15 mA) ergibt* Man entnimmt die Bändchen von dem Gel und hält während 2 Stunden bei 1000 V und 15 mA« Die Gesamtdauer der Untersuchung beträgt etwa 5 Stunden« . .

Bestimmimg des pH-Gradienten

Diese Bestimmung erfolgt mit Hilfe einer planen Mikroelektrode (des Typs Ingold)·

Entwicklung

Proteine .

Die Entwicklung der Proteine erfolgt mit Coomassie-Blau (nach der Methode von Graesslin et al* J.Chromatoge 63 (1971) 475 und 0· Vesterberg, Biochim, Biophys_e Acta 257 (1972) 11)«

Heuraßiinidase-Aktivität .

Man gießt eine 1 % Agar enthaltende 0,1 m SFatriumphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,4? die 1 mg/ml Methoxyphenylneuraminsäure und 1 mg/ml 4-Amino-2,5-=d.imethoxy"4^fnitro-asobenzol-diazoniumchlorid enthält, auf das Gel«

Man dispergiert die Methoxyphenylneuraminsäure und das Dia«

zoniumsalz in 1 bis 2 ml des Puffers, gibt die bei 30 ⁰C

gehaltene Agarlösung au und hält einige Minuten in feuchter Atmosphäre bei 40 ⁰C*

- 31 - Berlin',d.21.6.1979

AP A61K/211 058 55 051 18

Die braunen Banden auf dem maronenfarbenen Untergrund entsprechen den Proteinen, die eine Neuraminidaseaktivität besitzen·

Nach der Elektr©fokussierung entwickelt man auf einer gleichartigen Platte, auf die zwei ITeuraminidase-Abscheidungen erfolgt sind, die Gesamtproteine einer der Abscheidungen mit Coomassie-BlaUo Die Ueuraminidaseaktivität bestimmter Proteine wird an dem zweiten Auftrag mit Hilfe der Methoxyphenylneuraminsäure entwickelt.

Man beobachtet in dieser Weise eine Vielzahl von Proteinbanden, von denen gewisse eine Ueuraminidase-Aktivität besitzen, wobei die drei Hauptbanden in dem Medium zwischen pH-Werten von 6,5 und 9 liegen·

Die beiden Isoenzyme erscheinen in dem pH-Bereich zwischen 3,7 und 4,2.

Beispiel 9

Dieses Beispiel verdeutlicht die Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen auf der Grundlage von aus Streptococcus pneumoniae gewonnener Ueursjninida.se und die Untersuchung ihrer Stabilität«

Man bewirkt eine Bestimmung der Stabilität der Bakterien-Neuraminidase bei verschiedenen Temperaturen, beim Versprühen und beim Dispergieren mit verschiedenen Aerosoltreibmittelrio

I 1 05® - 32 - Berlln,d.21.6.1979

AP A61K/211 058 55 051 18

Die Heuraminidase-Aktivität wurde nach der Methode von Aminoff (BiO₀ Jour. Vol. 81 (1961) 384) ermittelt, während die Proteinbestiramung nach der Methode von Lowry durchgeführt wurde*

1» Stabilität bei verschiedenen Temperaturen

a) wäßrige Lösung mit einem Titer von 900 Einheiten/ml Bakterien-Ueuraminidase 250 mg physiologisches Serum, das . . . . ' 1 Promille Thiomersal enthält ad 100ml

Die bei der Untersuchung der Temperaturstabilität dieser Lösung erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle VII zusammengestellte . '

Aus der Tabelle VII ist zu erkennen, daß die Lösung eine gute Stabilität bei den normalen Anwendungsbedingungen (5 bis 6 Tage) besitzt«

b) wäßrige Lösung mit einem Titer von 1700 Einheiten/ml Bakterien-lTeuraminidase 32 mg physiologisches Serum, das -

1 Promille Thiomersal enthält ad 55 ml«

Die bei der Untersuchung der Temperaturbeständigkeit erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle VIII zusammengestellt»

Aus'der Tabelle VIII ist zu erkennen, daß die Lösung bei den üblichen Anwendungsbedingungen (5 bis 6 Tage) eine gute Stabilität besitzt«

1 1 O ζ 8 - 33 - Berl±Q,d.21.6;i979

^f ^^j? *%?

* ' .AP A61K/211 058

55 051 18

c) wäßrige Lösung mit einem Titer von 2000 Einheiten/ml " Bakterien-Iieuraminidase 100 mg

physiologisches Serum, das ..

V25 000 Thiomersal enthält ad 100 ml·

Die bei der Untersuchung der Temperaturbeständigkeit dieser Lösung erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle IX zusammengestellt· · , ';.·

Aus der Tabelle IX ist zu erkennen, daß die Lösung bei den angestrebten Anwendungsbedingungen (5 bis 6 Tage) eine gute Stabilität besitzt. · . 0 ;

2· Sprühbeständigkeit

Man bereitet eine Lösung aus folgenden Bestandteilen: Bakterien-lieuraminidase \. 100 mg

physiologisches Serum ad 10 ml·

Man untersucht die S-prühbeständigkeit der Lösung in 18. Versuchenc Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle X zusammengestellt«

Aus der Tabelle X ist zu erkennen, daß die Ueuraminidase das Versprühen mit Hilfe einer mit einer Pumpe ausgerüsteten Sprühflasche gut verträgt«

3* Stabilität gegen das Dispergieren mit Hilfe verschiedener Aerosol-Sprühgeräte

a) Vaast-Sprühgerät

I 1 OSS -34- Berlin,d.21.6.1979

AP A61K/211 058 55 051 18

Eingesetzte Lösung:

Bakterien-Neuraminidase · -·· 200 mg Physiologisches Serum ad 20 ml»

Die bei 12 Untersuchungen ermittelten Ergebnisse sind in der Tabelle XI zusammengestellt·

b) Sprühvorgang bei einem Druck von 0,4 kg/cm unter Verwendung einer Lösung mit einem Titer von 2700 Einheiten/ml

Verwendete Lösung: .

Ueuraminidase 20 mg

Physiologisches Serum · 20 ml·

Die bei dieser Untersuchung erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle XII zusammengestellte

Zu der Tabelle XII ist zu bemerken, daß die Kontrolluntersuchungen mit einer wäßrigen Hatriumchloridlösung mit einer Konzentration von 10 mg/ml und einer wäßrigen Serumalbumin^, lösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml durchgeführt wurden·Mach einer Betriebsdauer von 2 Stunden betragen die Konzentrationen der noch vorhandenen Lösungen (10 ml) im Fall der latriumchloridlösung 20 mg/ml und im Pail der Serumalbuminlösung 2 mg/ml«

c) Sprühvorgang unter Anwendung eines Druckes von 1 kg/cm

unter Verwendung einer Lösung mit einem Titer von 3600 Einheiten/ml

Eingesetzte Lösung:

Neuraminidase 60 mg

Physiologisches Serum 20 ml«

211 OSS - 35 - Berlin,d.21.6.1979

AP A61K/211 058 55 051 18 -

Nach Ende dieser Untersuchung wurde die Ueuraminidase-Aktivi~ tat und der Proteingehalt der noch vorhandenen Lösung ermittelt· Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle XIII zusammengestellte

d) Jouan-Säulensprüheinrichtung . .

Bei diesen Untersuchungen wurde die Heuraminidase-Aktivität und der Proteingehalt der restlichen Lösung bestimmt·

1) Sprühvorgang unter Anwendung eines Druckes von 1 kg/cm

Verwendung einer Lösung mit einem Titer von 3700 Einheiten/ml« .

Eingesetzte Lösung:

Bakterien-lTeuraminidase 60 mg

Physiologisches Serum 20 ml*

Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle JTV zusammengestellt·

2« Sprühvorgang bei Anwendung eines Druckes von 0,5 kg/cm"

V-erwendung einer Lösung mit einem Titer von 3700 Einheiten/ml«

Eingesetzte Lösung:

Bakterien-rTeuraminidase 60 mg

Physiologisches Serum 20 ml·

1 OSS - 36 - Berlin,cU21.6.1979

AP A61K/211 058 55 051 18

Bei dieser Untersuchung wurde das Aerosol, durch sechs hintereinandergeschaltete Waschflaschen geführt, die jeweils 40 ml Wasser enthielten« Es wurden drei Versuche durchgeführt; die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle XY zusammengestellte

Beispiel 3 Tabelle I

Kinetik der Vermehrung des Influenza-Virus Port Chalmers in Gegenwart der Sfeuraminidase

Virus A Port 6 h 12 h 24 h 3Oh 36 h 48 h 54 h 60 h 72 h Chalmers ;/73 ·'

Kontroll-Virus HA-Titer

Virus +3,5 Einheiten Neuraminidase sur Stunde gegeben, HA-Titer

Zugabe der Neuraminidase

·1Π⁴ Δ.* Λ C^ β·1Π^ «·1θ5

2·10^ 4*10-' 8·10

8·10"

0 0 0 2·10³ 4·10³

VJI VJI

VJl OD

Beispiel 5

Tabelle II A/Victoi'ia 3/75

Virus (Kontrolle)

Virus -f- UFeuraminidase

S -5

s-

-P

OJ C-	a
	CQ
ro	Φ
CtJ
	O
	ta
U	•Η
-P	-ρ
•Η
et
ι	ο
ä	φ

-1

Bakterien-lTeuraminidase β Ii nach der Virusinikulation angegeben

-4

-3

-2

03 1

VJl VJl

0,07 Einheiten 0,35 Einheiten 0,7 Einheiten Vermehrungsgrad des Virus in Abhängigkeit von der Enzymdosis

C\5 C-

ω -ρ -ρ

co

ei . .

^ Ή

4Λ .ρ

E^

η ο

0)

Tabelle IH A/Hong-Kong 1/68

L3 Virus (Kontrolle) S Virus + Hauraminidase

Bakferien-1-Ieuraminidase 0,07 Einheiten 0,35 Einheiten 0,7 Einheiten

h nach der Virusinokulation zugegeben

Vermehrungsgrad dea Virus in Abhängigkeit von der Enzymdosis

VjJ

VJi |s» VJi Pd

VJl O¹N

Tabelle IV

A/Port Chalmers 1/73

LU Virus (Kontrolle)

Virus + Neuraminidase

cvj c

bQ

0)

•H Q)

Bakt erien-Heuraminidase β h nach der Virusinokulation zugegeben

0,07 Einheiten 0,35 Einheiten 0,7 Einheiten Vermehrungsgrad des Virus in AbhängigReit von der Enzymdosis

O 1

CO !V)

. Berlin,d.21,6.1979

9.. 11058 -41- AP A61K/211 058

55 051 18

Tabelle V

Therapeutische Wirkung der JJeuraminidase an Frettchen, die mit dem Grippe-Virus MCR 11 infiziert worden sind·

Kontrolle . Behandelte Tiere

Kranke Tiere Gesunde Tiere Kranke Tiere Gesunde T. <!

14/14 /014 . 0/18 18/18

Tabelle VI

Globale Ergebnisse der therapeutischen Wirkung der Bakterien-Ueuraminidase auf mit dem Virus MRC 11 infizierte Frettchen·

Sustand der Tiere

Kontroll-Frettchen,.die mit 1 ml I\iRC 11 (EID₅₀=IO⁷)

inokuliert worden sind Frettchen, denen 35 000 Einheiten Neureminidase entweder vor oder nach der Inokulation von 1 ml des Virus MRC 11 ⁷ verabreicht v/orden sind

Kranke Tiere Gesunde Tiere

22/33 11/33

20/60 40/60

P < 0,01

Beispiel β

Tabelle VI

Therapeutische Wirkung der Bakterien-Neuraminidase auf Frettchen, die mit dem

Grippe-Virus IvIRC 11 infiziert worden sind

Untersuchungs- Kontrolle Heuraminidase 6 h ITeuraminidase 6 h

reihe Kranke Gesunde später verabreicht zuvor verabreicht

Tiere Tiere Kranke Gesunde Kranke Gesunde

Tiere Tiere Tiere Tiere

Heuraminidase 18 h danach verabreicht Kranke Gesunde Tiere Tiere

1»' RQihe

(6 Frettchen) 3/3 . 0/3

0/3

3/3

2. Reihe ...

(12 Frettchen) 4/4 0/4 1 totes Tier.am 8. Tage

3ο Reihe

(9 Frettchen) 3/3 0/3

4·'Reihe

(8 Frettchen) 4/4 0/4

Insgesamt

(35 Frettchen) 14/14 0/14

0/4

0/3

4/4

2/3

1/10 9/10

0/4

0/3

0/7

4/4

3/3

7/7 2/2

2/2

2/2

2/2

VJl VJl

O i> VJI CTN

03 rv>

VJl 00

ρ 0,001

ρ 0,001

ρ 0,001 ρ 0,01 '

Beispiel 4

Histogramme

i ot or la 3/75 Virus (Kontrolle) Virus + Heuraminidase

O H

«Η

+» •ρ

D-

O G)

α ο

03

Pi ·Η

«D ^

•Η ω

επ ö

ι ο

Zugabe .der

Ueuraminidase

nach 6 h nach 24 h nach 30 h nach 48 h nach 54 h

Ul p> Ui ΐχ)

CD ro

Histogramm II A/Port Chalmers 1/73

Vixus (Kontrolle) Virus + Neuraminidase

r5

HS cü

-2

r1

Zugabe der Haxrramin idas e

VJI

nach β h nach 24 h nach 30 h nach 48 h nach 54 h .

Ve rmehrungs grad des Virus in Anwesenheit von 0,5 Einheiten Heuramini«- dase in Abhängigkeit von dem Zeitpunkt der Enzymzugabe

VJl

O >

vji σ

co

Histogramm III A/Hong-Kor_Ag 1/68

Π Virus (Kontrolle) Virus + Neuraminidase

a ο

ta

<α U

•Η 0)

ι ο

<ά G)

-3

. Zugabe der·.. Ueuraminidase

	1	1
I

nach 6 h nach 24 h nach 30 h nach 48 h nach 54 h

Vermehrungsgrad des Virus in Anwesenheit von 0,5 Einheiten Neuramini«* dase in Abhängigkeit von dem Zeitpunkt der Enzymzugabe

W)

•ρ ιη·Η

eh ω

CM-H t-EH

Φ 6OiH

cd φ

EH-P

•Η

cn eh

u φ

-P

to

•Η CQ ·Η ot> Eh ft

Φ H r-i

O)

d φ

•Η in Eh

aj φ &+>

•Η Cv)EH

cd Φ

•Η τ-ΕΗ

I -P

•Ρ Pi EQ d ·Η

φ:ο ·η οι χί t-3 ΐΑ _rcj

ta

3 φ ί-ΐ

ω φ ^ -ρ

47 -

55 051 18

	VO	C-
-5h CO	CJ co	cn
755	744	.448
in	-5j-	r
VO co	cn co	vh VO
779	805	577
93,7	89,6	78,5
844	2,08	ZOi,
in	VO	C-
.τ— co	C- CO
784	681	.664
V" cn	88,4	ω C-
VO τ ω	796	702
96,5	C- Ck CM cn	•vj- cn
869	835	845
89,6	co cn	92,4
807	880	CM ω

ο cn

	ι	O	O
ο		O	O
ο	O
	CM	CX!	C-
«φ		CM
	*h
		+

Tabelle VIII

Aufbetoahrungs« Titer der temperatur Lösung

Einheiten/ml Dosis nach 5 Tagen 9 Tagen Titer % Titer %

Untersuchung 20 -22 ⁰C

2ο Untersuchung

1750

1717 1473 84*5 1348 77

1460 85

1344 78,2

Tabelle IX

Aufbewahrungs- Titer der Lösung Dosis nach temperatiir Einheiten/ml 5 Tagen 11 Tagen 15 Tagen

Titer % Titer % Titer %

- 22 ⁰O 2138 1945 91 2004 93,7 1934 90,4

VJI to-

vji Fd

vji σ>

VJl 03

Tabelle X

Sprüheinrichtung Titer der Lösung Versprühtes Material

Einheiten/ml Titer %

2150 1630 76

* 2150 2056 96

Tabelle XI

Titer der. eingesetzten Lösung Einheiten/ml

Aerosol

Titer %

1950

97,2

O Je» M Ul CTv H-

Tabelle XII

Betriebsseit Lösung

Volumen Titer Gesamtaktivität

Einheiten/ml

O (Beginn) 19 ml 2765 52 535 ' · -

2-Stunden 10 ml. 4600 46 000 87,5

VJl VJI

ω ro «

Tabelle XIII

Betriebsdauer

Restliche Lösung Jtfeuraminidase-Aktivität Volumen Titer Gesamt- % (ml) Einheiten/ml aktivitätProteine ,u/ml Gesamtmenge (mg)

Spezifische Aktivität

0	(Beginn)	20	3600
20	Minuten	10	4167
40	Minuten	3	5037
60	Krauten	0	1188
		(Spülen der
		Vorrichtung
		mit 2 ml
		Wasser)

72 000

41 670 58

15 110 21

2 375 3

4,46 3,10 1,33 0,3

69,5 29,8

6,7

16 150

13 440

11 340

7 710

VJl VjJ

VJt VJI

Tabelle ZIV

Betriebs-' datier

Restliche Lösung Itfeuraminidase-Aktivität Volumen Titer Gesamt-»

(ml) . (Einheiten/ml) aktivität Proteine

% /Ug/ml Gesamtmenge (mg)

Spezifische Aktivität

0 (Beginn) 20

1 Stunde

8,5

3700

6470

74

55 000 225

351

4,5 2,99

16 400 66,4 18 400

vji σ\ ρ

^r C "α

οο ro ·

Betriebsdauer

TabelleJEV

Heuraminidase-Aktivität Volumen Titer Gesamt- $ (ml) (Einhei- aktivität ten/ml)

Proteine. Gesamtmenge (mg)

Spezifische 'Aktivität

0 (Beginn)	1	20	3700	74	000	-.	224	•4,	48	t
1 Stunde	2	11,3	5960	67	350	91	288	3,	25	t
Waschflasche	3	.. 40	68	2	720	5,9	Bestim mung un möglich		t
Waschflasche	4	It	13,5		540	tt	It	mm	*
Waschflasche	5	If	7,1		285	ti	ti	-mm	t
Waschflasche	6	ti	2,85		114	H	It	<m	I
Waschflasche	Il	2,6		106	If	It
Waschflasche	If	15		600	It	It	mm

72,6

16 500 20 700

Claims (3)

1β Verfahren zur Gewinnung eines Enzymbakteriums mit Antivirus eigenschaft en, gekennzeichnet dadurch, daß man einen Stamm der Streptococcus pneumoniae in einem proteinreichen Medium anbaut, am^Ende der Kultur ein eiweißspaltenäes Enzym hinzufügt, 3-mal, nacheinander die N-Acetylmuraminatglykohydrolase abscheidet, die durch das Ammoniumsulfat freigesetzt wird, das Enzym in Lösung durch Dialyse, danach durch Säulenchromatographie von Carboxymethylzellulose reinigt auf pH 6,8 und das Eluat zum Trock« nen.. durch Lyophilisierung (Gefriertrocknen) führt und von neuem zur SäulenChromatographie mit Ionenaustausch übergeht© ' · - " .

2« Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der*
Stamm Streptococcus pneumoniae im Institut Pasteur, Paris unter der Hummer 1-044 hinterlegt ist«

3* Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß

H-Acetylmuraminatglykohydrolase nach Chromatographie er-.-' halten wird und einen speziellen Wert von ungefähr
20 000 U besitzt· - -