DE69307897T2

DE69307897T2 - Polysaccharide aus glykogen

Info

Publication number: DE69307897T2
Application number: DE69307897T
Authority: DE
Inventors: Leandro I-00161 Roma Baiocchi; Rosario I-00197 Roma Nicoletti
Original assignee: Angelini Ricerche SpA
Current assignee: Angelini Ricerche SpA
Priority date: 1992-08-04
Filing date: 1993-07-28
Publication date: 1997-05-22
Anticipated expiration: 2013-07-29
Also published as: HU213908B; HU9500317D0; NZ254777A; CZ282276B6; AU680200B2; RU2104287C1; FI104974B; NO307788B1; HUT71961A; IT1255488B; SK11495A3; DK0654048T3; KR100277301B1; AU4703493A; BG99421A; EP0654048B1; NO950405L; DE69307897D1; GR3023249T3; EP0654048A1

Description

Die Erfindung betrifft Glykogenpolysaccharide, ein Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung. Insbesondere betrifft die Erfindung Glykogenpolysaccharide, die im wesentlichen frei von stickstoffhaltigen Verbindungen und reduzierenden Zuckern sind.
Der Ausdruck "Glykogen" wird allgemein zur Bezeichnung einer Gruppe ähnlicher aber nicht identischer, im Tierreich weit verbreiteter Proteoglykane verwendet.
Am besten wurde aus der Rattenleber extrahiertes Glykogen untersucht und man glaubt, daß es ein Protein (Glykogenin) mit einem Molekulargewicht von ungefähr 37 000 Dalton ist, welches über eine glykosidische Bindung eines Tyrosins an ein stark verzweigtes Glucosepolysaccharid mit einem Molekulargewicht von 10 000 000 Dalton (ß-Teilchen) gebunden ist. Viele beta- Teilchen - bis zu 50 - können zusammen ein Aggregat bilden, so daß sich eine Verbindung (α-Teilchen) mit einem Molekulargewicht von 500 000 000 Dalton ergibt, welche die Einheit von nativem Glykogen darstellt (D.J. Manners, Carbohydrate Polymers, 16, Seiten 37-82 (1991)).
Die mannigfaltigen Glykogene verschiedener Tierarten zeigen - soweit bekannt - Unterschiede im Polysaccharidverzweigungsgrad. So berichteten beispielsweise Stuart A.S. Craig et al. (Carbohydrate Research 179, Seiten 327-340 (1988)) über signifikante Unterschiede in der Polysaccharidverzweigung von aus Säugetieren und Invertebraten extrahierten Glykogenproben.
Obwohl mehrere verschiedene Verfahren zur Glykogenextraktion aus Tiergeweben in der Literatur beschrieben sind, verfolgen sie tatsächlich in der Hauptsache zwei verschiedene Ziele:
(i) eine quantitative Extraktion von Glykogen im analytischbiochemischen Bereich; nämlich eine Extraktion mit dem Ziel der nachfolgenden quantitativen Bestimmung des Glykogenspiegels in einem bestimmten Gewebe;
(ii) die Extraktion von Glykogenproben bei Minimierung der Denaturierung des ursprünglichen Polymers für nachfolgende biochemische und die Konformation betreffende Untersuchungen.
Infolgedessen gibt es in allen Typen käuflich erwerbbaren Glykogens ungeachtet deren Ursprungs immer eine gewisse Menge an Stickstoff (500-600 ppm), welche wenigstens der für Proteoglykan errechneten entspricht (D.J. Manners et al., wie oben zitiert).
Bei einer Prüfung der Literatur findet man einen bemerkenswerten Unterschied in den Standpunkten verschiedener Autoren; die einen betrachten diese Menge an Stickstoff als Spurenverunreinigung, die anderen betrachten ihn als Nebenbestandteil des Glykogens. Andererseits spezifizieren die verschiedenen käuflichen Quellen keinen Unterschied zwischen Proteoglykan-Glykogen und dessen Polysacchariden.
Während die Extraktion von Glykogen gründlich untersucht worden ist, hat man der Extraktion von Glykogenpolysacchariden bis jetzt nur wenig Aufmerksamkeit zukommen lassen. Lediglich eine alte Publikation beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von "Stickstoff-freien" Glykogenproben aus Rattenlebern (M. Somogyi, J. Biol. Chem., 104, 245 (1934)). Es soll allerdings bemerkt werden, daß Glykogen bei dieser Herstellung während einer Nacht eine Säurebehandlung erfährt, d.h. unter für das Glykogenpolysaccharid hydrolysierenden Bedingungen. Darüber hinaus ist die Sensitivität der von den Autoren zur Messung des Stickstoffgehaltes verwendeten Analysemethode nicht bekannt.
Bei dem Versuch, diese Methode auszuführen, wurde gefunden, daß sie wenig reproduzierbar war und das erhaltene Produkt eine geringe aber variable Menge an Stickstoff und/oder eine bemerkenswerte Menge reduzierender Zucker (mehr als 0,15 %) infolge der hydrolytischen Zersetzung besaß.
Verschiedene pharmazeutische Verwendungen sind für Glykogen, insbesondere als Weichmacher (JP-A-87-178 505) und als Exzipient aufgrund dessen hydratisierenden Eigenschaften (JP-A-88-290 809) und in dermatologischen Produkten gegen Hautalterung (US-5 093 109), vorgeschlagen worden.
Darüber hinaus ist vorgeschlagen worden, es als Nährmedium für Milchsäure-produzierende Bazillen in einer pharmazeutischen Form zur Regulierung des vaginalen pH-Wertes (EP-A-0 257 007) zu verwenden. Allerdings ist es nicht ausreichend stabil und es ist wahrscheinlich, daß Spuren von Proteinen, Nucleinsäuren und Fragmenten davon Sensitivitäts-Phänomene bedingen. Es können sogar lebende Verunreinigungen zugegen sein.
Unser Ziel war es daher, eine Verbindung herzustellen, welche zum größten Teil Glykogenpolysaccharid-Sruktur beibehält und auch die maximale Unschädlichkeit und Sicherheit garantiert. Nämlich eine Verbindung, welche frei von stickstoffhaltigen Verbindungen und reduzierenden Zuckern ist.
Nach vielen vergeblichen Versuchen wurde unerwarteterweise gefunden, daß eine wäßrige Lösung rohen Glykogens, welche ausreichend lang mit einem kationischen Harz behandelt worden war, das gewünschte Polysaccharid in Lösung zurückläßt Das Polysaccharid kann dann in einfacher Weise durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels präzipitiert werden.
Der erste Gegenstand dieser Erfindung ist daher ein Glykogenpolysaccharid, welches im wesentlichen frei von stickstoffhaltigen Verbindungen und reduzierenden Zuckern ist.
Der in dieser Beschreibung und den dazugehörenden Ansprüchen verwendete Ausdruck "im wesentlichen frei von stickstoffhaltigen Verbindungen und reduzierenden Zuckern" soll ausdrücken, daß der Stickstoffgehalt weniger als 60 ppm - wenn nach der Kjeldahl-Methode gemessen - und der Gehalt an reduzierenden Zuckern weniger als 0,25 % - wenn nach der Methode von F.D. Snell und Snell, "Colorimetric Methods of Analysis" New York, 1954, Vol III, Seite 204) gemessen - betragen.
Mytilus edulis und Mytilus gallus provincialis stellen eine besonders interessante Glykogenquelle dar; in der Tat werden diese Mollusken in großen Mengen bei verhältnismäßig geringen Kosten gefunden und sie weisen einen recht hohen Glykogengehalt auf. Somit ist das erfindungsgemäß bevorzugte Glykogenpolysaccharid dasjenige, das aus Mytilus edulis und Mytilus gallus provincialis erhalten wird.
Allerdings ist diese Erfindung nicht auf Glykogenpolysaccharide aus Mytilus edulis und Mytilus gallus provincialis beschränkt. Zu weiteren geeigneten Glykogenquellen zur erfindungsgemäßen Herstellung der entsprechenden Polysaccharide zählen andere Mollusken, wie Austern und Credipula fornicata oder die Organe tierischer Vertebraten, die reich an Glykogen sind, wie Leber und Muskel.
Das erfindungsgemäße Glykogenpolysaccharid ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß es einen Kohlenstoffgehalt von ungefähr 44 bis ungefähr 45 %, ein Molekulargewicht von ungefähr (2,5 ± 0,1) x 10&sup6; Dalton und ein Drehvermögen [α]20D von 197 ± 2,0 (c = 1 in Wasser) aufweist.
Die erste Stufe des Verfahrens zur Herstellung des erfindungsgemäßen Glykogenpolysaccharids wird nach herkömmlichen Techniken durchgeführt, welche umfassen, daß man das ausgewählte Gewebe in einer wäßrigen Lösung einer starken Base kocht, die so erhaltene Brühe abkühlt und dann das Glykogen durch Zugabe eines nicht-sauren, flüchtigen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel präzipitiert.
Wie bereits bekannt ist, variiert die in den verschiedenen Geweben enthaltene Menge an Glykogen erheblich, nicht nur bezüglich des Gewebes und der Tierart, sondern auch für das gleiche Tiergewebe der gleichen Art bezüglich verschiedener anderer Faktoren, wie dem Ernährungszustand und der Jahreszeit.
Somit hängt die gemäß der oben erwähnten Behandlung extrahierte Menge an Glykogen stark von der in dem behandelten Tiergewebe vorhandenen Menge ab.
Die neue Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, den pH der durch Auflösung des Präzipitats in Wasser erhaltenen Lösung neutral einzustellen und dann die Lösung mit einem kationischen Harz zu behandeln.
Somit ist ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Glykogenpolysaccharids, das im wesentlichen frei von stickstoffhaltigen Verbindungen und reduzierenden Zuckern ist, welches umfaßt, daß man ein Tiergewebe, das reich an Glykogen ist, in einer wäßrigen Lösung einer starken Base kocht, die so erhaltene Brühe abkühlt, ein nicht-saures, flüchtiges und mit Wasser mischbares Lösungsmittel zusetzt, das gebildete Präzipitat durch Filtration abtrennt und dieses Präzipitat in Wasser auflöst, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der pH der wäßrigen Lösung des Präzipitats neutral eingestellt wird und mit einem kationischen Harz behandelt wird, filtriert wird, um das kationische Harz abzutrennen, mit einem nicht-sauren, flüssigen und mit Wasser mischbaren Lösungsmittel behandelt wird, um das Polysaccharid, das frei von stickstoffhaltigen Verbindungen und reduzierenden Zuckern ist, zu präzipitieren, und filtriert wird, um das gebildete Präzipitat wiederzugewinnen.
Der Neutralisierungsschritt wird vorzugsweise mit einer schwachen organischen, in Wasser löslichen Säure, wie Essigsäure, durchgeführt.
Die Behandlung mit einem kationischen Harz wird vorzugsweise 8 bis 48 Stunden unter Rühren und bei Raumtemperatur durchgeführt.
Ein Beispiel eines geeigneten kationischen Harzes ist Amberlite IR-120 in saurer Form; andere kationische Harze mit ähnlichen Eigenschaften können ebenfalls verwendet werden.
Die kationischen Harze werden dann durch Filtration abgetrennt und ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel wird zugesetzt.
Beispiele bevorzugter Lösungsmittel sind niedere Alkohole und Ketone, wie Ethylalkohol und Aceton.
So bildet sich ein Präzipitat, das Glykogenpolysaccharid, welches frei von stickstoffhaltigen Verbindungen und reduzierenden Zuckern ist, und es wird durch Filtration abgetrennt. Keine weitere Aufreinigung ist außer dem Entfernen des Lösungsmittels erforderlich.
Die Ausbeute, bezogen auf das aus der Brühe präzipitierte Glykogen, ist nahezu quantitativ.
Deshalb ist einer von weiteren Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß die Produktionskosten für das erfindungsgemäße Polysaccharid im wesentlichen den Extraktionkosten für Glykogen entsprechen. Mit anderen Worten, bei im wesentlichen gleichen Kosten liefert diese Erfindung ein Produkt, welches Glykogen bei all dessen bekannten Verwendungen ersetzen kann, ohne die Nachteile zu haben, Proteine, Nucleinsäure oder deren Fragmente und/oder reduzierende Zucker zu enthalten.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung, ohne sie zu begrenzen.

Beispiel 1

A) Extraktion von Glykogen

1000 g Mytilus gallus provincilis-Brei wurden in ein Stahlgefäß mit 1,0 l 30 % KOH gegeben und 1 Stunde auf 100ºC erhitzt.
Die so erhaltene Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und 1,5 l 95 %iger Ethylalkohol wurde zugesetzt. Der gebildete feste Niederschlag (62 g) wurde abfiltriert.
Nach Trocknung besaß dieses Produkt die folgenden Charakteristika:
C: 44,44 %
N: 0,18 - 0,34 % B) Herstellung des Glykogenpolysaccharids Der in Stufe A abgetrennte Feststoff wurde in 1 l Wasser aufgelöst, der pH der resultierenden Lösung wurde mit Eisessig neutral eingestellt und dann bis zur vollständigen Klarheit filtriert.
Zu der so erhaltenen Lösung wurden 60 g Amberlite IR-120 in saurer Form gegeben, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Das Harz wurde von der Lösung filtriert und das Glykogenpolysaccharid wurde durch Zugabe des gleichen Volumens an 95%igem Ethylalkohol präzipitiert und dann abfiltriert.
Nach Trocknung wies das so hergestellte Glykogenpolysaccharid (61 g) die folgenden physikalischchemischen Eigenschaften auf:
C: 44,44 %
N: abwesend*
reduzierende Zucker: abwesend**
Molekulargewicht: (2,5 ± 0,1) x 106***
[α]20D: 198 ± 1,0 (c=1 in Wasser)
Hydrolyse mit 1N H&sub2;SO&sub4; (3 Stunden bei 100ºC) liefert nur Glucose (mit Gaschromatographie nach M. Ochiai, J.Crom. 194, 224 (1980) getestet).
* (Sensitivität des Verfahrens: 60 ppm)
** (nach F.D. Snell und Snell, Colorimetric Methods of Analysis New York, 1954, Vol. III, S. 204, getestet; Sensitivität der Methode: 0,25 %)
*** (errechnet aus dem Wert für (eta) durch Anwendung der Flory-Gleichung mit den folgenden Werten k = 1,80 x 10&supmin;&sup4;, a = 0,70, erhalten von L.P. Yu und J.E. Rolling für Glykogen (J. Applied Pol. Sci. 33, 1909 (1987)).

Beispiel 2

Das Glykogenpolysaccharid von Mytilus gallus provincialis wurde, wie in Teil B von Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, außer daß der Präzipitationsschritt mit Aceton anstatt Ethylalkohol durchgeführt wurde.
Ausbeute: 60,5 g;
[α]20D: 196 ± 1,0 (c=1 in Wasser);
Reduzierende Zucker: abwesend.

Beispiel 3

5 g Glykogen, das nach Bell et al. "Biochem. J. 28, 882 (1934)" aus Schweineleber extrahiert worden war, wurde in Wasser (85 ml) aufgelöst, mit Amberlite IR-120 (5 g) behandelt und dann mit 95%igem Ethylalkohol (85 ml), wie in Teil B von Beispiel 1 beschrieben, präzipitiert.
Stickstoff und reduzierende Zucker waren nicht zugegen; das Drehvermögen war dem der Glykogenpolysaccharide aus den Beispielen 1 und 2 ähnlich.

Claims

1. Glykogenpolysaccharid, worin der nach der Kjeldahl-Methode bestimmte Stickstoffgehalt weniger als 60 ppm beträgt, und der nach der Methode von F.D. Snell und Snell bestimmte Gehalt an reduzierenden Zuckern weniger als 0,25 % beträgt.

2. Polysaccharid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Kohlenstoffgehalt von etwa 44 bis etwa 45 % aufweist.

3. Polysaccharid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Molekulargewicht von ungefähr (2,5 ± 0,1) x 10&sup6; Daton besitzt.

4. Polysaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Drehvermögen [α]20D von 197 ± 2,0 (c = 1 in Wasser) besitzt.

5. Verfahren zur Herstellung eines Glykogenpolysaccharids, dessen nach der Kjeldahl-Methode bestimmte Stickstoffgehalt weniger als 60 ppm beträgt, und dessen nach der Methode von F.D. Snell und Snell bestimmte Gehalt an reduzierenden Zuckern weniger als 0,25 % beträgt, wobei man ein tierisches Gewebe, das reich an Glykogen ist, in einer wäßrigen Lösung einer starken Base kocht, die so erhaltene Brühe abkühlt, ein nicht-saures flüchtiges und mit Wasser mischbares Lösungsmittel zusetzt, das gebildete Präzipitat durch Filtration abtrennt und dieses Präzipitat in Wasser auflöst, dadurch gekennzeichnet, daß der pH der wäßrigen Lösung des Präzipitats neutral eingestellt wird und die Lösung mit einem kationischen Harz behandelt wird, filtriert wird, um das katonische Harz abzutrennen, mit einem nicht-sauren, flüchtigen und mit Wasser mischbaren Lösungsmittel behandelt wird, um das Polysaccharid, das frei von stickstoffhaltigen Verbindungen und reduzierenden Zuckern ist, zu präzipitieren und filtriert wird, um das gebildete Präzipitat zurückzugewinnen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Neutralisationsschritt mit einer schwachen organischen Base durchgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung mit einem kationischen Harz bei Raumtemperatur durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung mit einem kationischen Harz 8 bis 48 Stunden durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung mit einem kationischen Harz 24 Stunden durchgeführt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das kationische Harz Amberlite IR- 120 in saurer Form ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel Ethylalkohol oder Aceton ist.