BG62259B1

BG62259B1 - Гликогенови полизахариди и метод за тяхното получаване

Info

Publication number: BG62259B1
Application number: BG99421A
Authority: BG
Inventors: Rosario Nicoletti; Leandro Baiocchi
Original assignee: Angelini Ricerche S.P.A. Societa'consortile
Priority date: 1992-08-04
Filing date: 1995-02-13
Publication date: 1999-06-30
Also published as: AU680200B2; DK0654048T3; HU9500317D0; WO1994003502A1; HU213908B; ATE148471T1; RO117970B1; KR950702581A; US5597913A; IT1255488B; FI950436A0; GEP20001941B; JPH07509519A; HUT71961A; SK280066B6; CA2141040A1; NZ254777A; EP0654048B1; BR9306833A; NO307788B1

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до гликогенови полизахариди, до метод за тяхното получаване и използването им. По-специално изобретението се отнася до гликогенови полизахариди, в основата си свободни от азотни съединения и редуциращи ги захари.

Предшестващо състояние на техниката

Обикновено терминът “гликоген” се използва за означаване на групата от подобни, но не идентични протеогликани, широко разпространени в животинския свят.

Най-изследваният гликоген е този, екстрахиран от черния дроб на заек, и се предполага, че той е протеин (гликогенин) с молекулно тегло около 37 000 D, свързан чрез тирозинова гликозидна връзка в силно разклонен глюкозен полизахарид с молекулно тегло 10 000 000 D (β-частичка). Множество от βчастички - до 50, могат да агрегират съвместно, при което се образува съединение (а-частичка) с молекулно тегло 500 000 000 D, която е съставна единица на естествения гликоген (D.J. Manners, Carbohydrate Polymers, 16, рр 37-82 (1991)).

Както е известно, редицата гликогени от различни животински видове показват различия в степента на разклоненост на полизахарида. Така например Stuart A.S. Craig et al. (Carbohydrate Research 179, pp 327-340 (1988) съобщават за съществени различия в разклонеността на полизахарида на гликогенови образци, изолирани от бозайници и безгръбначни.

Действително, въпреки че в литературата са описани редица различни методи за екстрахиране на гликогена от животински тъкани, те имат главно две различни цели:

(i) количествено екстрахиране на гликогена по някой от аналитичните методи за биохимично изследване, което означава екстрахиране с цел следващо количествено определяне на съдържанието на гликоген в дадена тъкан;

(ii) екстрахиране на гликогенови образци при намаляване на денатурацията на ори гиналния полимер за следващо биохимично и конформационно изследване.

Следователно независимо от произхода им всички типове търговски продукти гликоген винаги съдържат известно количество азот (500-600 ppm), което отговаря най-малко на изчисленото по отношение на протеогликана (D.J. Manners et al. според цитираното по-горе).

При проучване на литературата се открива забележима разлика между гледните точки на отделните автори, някои от които считат споменатото количество азот за следи от онечиствания, докато други го приемат като второстепенна съставна част на гликогена. От друга страна, различните доставчици не специфицират никаква разлика между протеогликановия гликоген и неговия полизахарид.

Докато изолирането на гликогена е изцяло изследвано, досега е обръщано малко внимание на изолирането на гликогеновия полизахарид. Единствено една статия описва метод за получаване на образци от гликоген “свободен от азот” от черен дроб на плъхове (М. Somogyi, J. Biol. Chem., 104, 245 (1934)). Трябва да се отбележи обаче, че при получаването му по този метод гликогенът преминава през една киселинна обработка в продължение на една нощ, необходима за хидролизирането на гликогеновия полизахарид. Освен това не е известна чувствителността на използвания от авторите аналитичен метод за определяне на съдържанието на азот.

При опит да се приложи цитираният метод, той се оказа със слаба възпроизводимост и полученият продукт има малко, но променливо съдържание на азот и/или забележимо съдържание на редуциращи се захари (повече от 0,15%) като последица от хидролизното разлагане.

Предлагани са редица фармацевтични приложения на гликогена, особено като успокоително средство (JP-A-87-178 505), като ексципиент - поради хидратиращите му свойства (JP-A-88-290 809) и в дерматологични състави против стареене на кожата (US-5 093 109).

Освен това е предложено той да се използва като хранителна среда за бацили, произвеждащи млечна киселина, във фармацевтични състави за регулиране на вагиналното pH (ЕР-А-0 257 007). Гликогенът обаче не е достатъчно стабилен и е вероятно следите от протеини, нуклеинови киселини и техни фраг62259 менти да увеличават чувствителността му. Възможно е дори наличието на замърсявания от хранителна среда.

Техническа същност на изобретението

По тези причини целта на изобретението е получаването на съединение, което в основната си част повтаря структурата на гликогеновия полизахарид и същевременно осигурява максимална безвредност и безопасност. Това ще рече, съединение, което е свободно от азот и редуциращи се захари.

След редица неуспешни опити неочаквано е установено, че воден разтвор на суров гликоген, обработен достатъчно продължително с катионна смола, освобождава в разтвора желания полизахарид. Впоследствие полизахаридът може лесно да се утаи чрез добавяне на съвместим с вода разтворител.

И така, първата задача на изобретението е създаването на гликогенов полизахарид, в основата си свободен от азотни съединения и редуциращи се захари.

Според смисъла, в който се използва в спецификацията и в приложените към нея претенции, “в основата си свободен от азотни съединения и редуциращи се захари” означава, че съдържанието на азот, измерено по метода на Kjeldahl, е по-малко от 60 ppm, а съдържанието на захари, измерено по метода на F.D. Snell и Snell, “Colorimetric Methods of Analysis, New York, 1954, Vol. Ill, 204), е по-малко от 0,25%.

Практически интерес като източници на гликоген представляват Mytilus Edulis и Mytilus Gallus Provincialis. Ha практика тези мекотели могат да се намерят в големи количества и на умерено ниска цена и имат достатъчно голямо съдържание на гликоген. И така предпочитаният гликогенов полизахарид съгласно изобретението е този, получен от Mytilus Edulis и Mytilus Gallus Provincialis.

Изобретението обаче не се ограничава до използването само на гликогенов полизахарид, получен от Mytilus Edulis и Mytilus Gallus Provincialis. Подходящите източници на гликоген за получаването на съответния полизахарид съгласно изобретението включват и други мекотели като Ostrea и Credipula Fornicataq или богати на гликоген органи на гръбначни животни като черен дроб и мускули.

Гликогеновият полизахарид от изобретението освен това се характеризира с въглеродно съдържание от около 44 до около 45 %, молекулно тегло от около (2,5 ±0,1) х 10⁶ D и ротационна способност (a)_D“ 197 ± 2,0 (с = 1 във вода).

Първият етап на този метод за получаване на гликогеновия полизахарид от изобретението е изпълнен съгласно общоприетата методика, състояща се във варене на избраната тъкан във воден разтвор на силна основа, охлаждане на получения бульон и утаяване на гликогена чрез прибавяне на некисел летлив, съвместим с вода, разтворител.

Както вече е известно, количеството на съдържащия се в различните тъкани гликоген варира в широки граници, не само в зависимост от тъканта и от животинския вид, но също и при еднакви животински тъкани и видове в зависимост от редица фактори като условията на хранене и годишното време. И така, количеството на гликогена, изолиран съгласно гореописаната обработка, зависи силно от количеството, съдържащо се в обработваната животинска тъкан.

Новият етап на процеса от изобретението се състои в настройване на неутрално pH на получения разтвор след разтваряне на цитираната утайка във вода и следващо обработване на разтвора с катионна смола.

Следващата задача на изобретението е да предостави метод за получаване на гликогенов полизахарид, в основата си свободен от азотни съединения и редуциращи се захари, състоящ се във варене на животинска тъкан във воден разтвор на силна основа, охлаждане на получения бульон и утаяване на гликогена чрез прибавяне на некисел, летлив, съвместим с вода разтворител, отделяне на получената утайка чрез филтриране и разтварянето й във вода, характеризиращ се с това, че pH на водния разтвор на утайката се настройва до неутрално, обработва се с катионна смола, филтрира се за отделяне на катионната смола, обработва се с некисел летлив съвместим с вода разтворител за утаяване на полизахарида, свободен от азотни съединения и редуциращи се захари, и се филтрира за освобождаване на получената утайка.

Процесът на неутрализация се провежда за предпочитане със слаба, разтворима във вода органична киселина, например оцетна киселина.

Предпочита се обработката с катионна смола да се проведе в продължение на 8 до 48 h, при разбъркване и при стайна температура. За предпочитане е обработката с катионна смола да се извърши за 24 h.

Пример за подходяща смола е Amberlite™ IR-120 в киселата й форма. Могат да се използват също така и други катионни смоли с аналогични свойства.

След това катионната смола се отделя чрез филтриране и се добавя съвместим с вода разтворител.

Примери за подходящи разтворители са нисшите алкохоли и кетони, например етилалкохол и ацетон.

При този метод се получава утайка, която представлява гликогенов полизахарид, свободен от азотни съединения и редуциращи се захари и който се изолира чрез филтриране. Освен отстраняването на разтворителя не се налага допълнително пречистване.

Добивът по отношение на утаения от бульона гликоген е приблизително количествен.

Оттук и едно от следващите предимства на метода от изобретението се състои в това, че производствената цена на полизахарида от него е практически същата като стойността на екстрахиране на гликогена. С други думи, за същата цена с изобретението се осигурява получаването на съединение, което може да замести гликогена във всичките му познати приложения, без да има недостатъците от съдържание на протеини, нуклеинови киселини или фрагменти от тях и/или редуциращи се захари.

Следващите примери поясняват изобретението, без да го ограничават.

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1.

А) Екстрахиране на гликоген. 1000 g пулпа от Mytilus Gallus Provincialis се поставят в стоманен съд заедно с 1,0 1 30% КОН и сместа се загрява за 1 h до 100°С.

Полученият разтвор се охлажда до стайна температура и към него се прибавя 1,5 1 95% етилов алкохол. Образуваната твърда утайка (62 g) се отделя чрез филтриране.

След изсушаване това вещество има следната характеристика:

С: 44,44%

N: 0,18-0,34%

В) Получаване на гликогеновия полизахарид. Изолираното на етап А твърдо вещество се разтваря в 1 1 вода, с ледена оцетна киселина се настройва pH на получения разтвор до неутрално, след което се филтрира до пълно избистряне.

Към така получения разтвор се прибавят 60 g Amberlite™ IR-120 - кисела форма и сместа се оставя при разбъркване 24 h при стайна температура.

Смолата се отделя от разтвора чрез филтриране и гликогеновият полизахарид се утаява чрез прибавяне на равен обем 95% етилов алкохол, след което се изолира чрез филтриране.

След изсушаване полученият гликогенов полизахарид (61 g) има следните физикохимични характеристики:

С: 44,44%

N: отсъства*

Редуциращи се захари: отсъстват**

Молекулно тегло: (2,5 ± 0,1) х 10‘ D*** (a)_D“: 198 ± 1,0 (с = 1 във вода)

При хидролизирането с IN H₂SO₄ (3 h при 100°С) се получава само глюкоза (определена чрез газова хроматография съгласно М. Ohiai, J. Crom. 194, 224 (1980).

* точност на метода 60 ppm;

*♦ изпитване в съответствие с F.D. Snell и Snell, Colorimetric Methods of Analysis New York, 1954, vol. Ill, p 204, точност на метода 0,25%;

*♦* изчислено от стойността на η чрез прилагане на уравнението на Flory със следните стойности к = 1,80 х 10~*, а = 0,70, получени от L.p. Yu и J.E. Rolling за гликоген (J. Appl. Pol. Sci. 33, 1909 (1978).

Пример 2.

Получен е гликогенов полизахарид от Mytilus Gallus Provincialis, както е описано в част В на пример 1, с изключение на това, че утаяването се извършва с ацетон вместо с етилов алкохол.

Добив: 60,5 g;

(a)_D ^M: 196 ± 1,0 (с = 1 във вода); редуциращи се захари: отсъстват. Пример 3.

g гликоген от черен дроб на прасе, изолиран съгласно Bell et al. “Biochem. J., 28, 882 (1934)”, е разтворен във вода (85 ml), обработен с Amberlite™ IR-120 (5 g) и след това утаен с 95% етилов алкохол (85 ml) според описаното в част А на пример 1.

Отсъстват азот и редуциращи се захари, ротационната способност е аналогична на тази на гликогеновите полизахариди от примери 1 и 2.

Claims

Патентни претенции

1. Гликогенов полизахарид, при който съдържанието на азот, измерено по метода на Kjeldal, е по-малко от 60 ppm и съдържанието на редуциращи се захари, измерено по метода на F.D. Snell и Snell, е по-малко от 0,25%.
2. Полизахарид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че има съдържание на въглерод от около 44 до около 45 %.
3. Полизахарид съгласно всяка от претенции I и 2, характеризиращ се с това, че има молекулно тегло от около (2,5 ±0,1) х 10⁶ D.
4. Полизахарид съгласно всяка претенция от 1 до 3, характеризиращ се с това, че има ротационна способност (a)_D“ 197 ± 2,0 (с = 1 във вода).
5. Метод за получаване на гликогенов полизахарид, чието съдържание на азотни съединения, измерено по метода на Kjeldal, е по-малко от 60 ppm и съдържанието на редуциращи се захари, измерено по метода на F.D. Snell и Snell, е по-малко от 0,25%, състоящ се във варене на богата на гликоген животинска тъкан във воден разтвор на силна основа, охлаждане на така получения бульон, прибавя- не на некисел летлив, съвместим с вода разтворител, отделяне на получената утайка чрез филтриране и разтварянето й във вода, характеризиращ се с това, че pH на водния 5 разтвор на утайката се настройва до неутрално, обработва се с катионна смола, филтрира се за отделяне на катионната смола, обработва се с некисел летлив, съвместим с вода разтворител за утаяване на полизахарида, свободен 10 от азотни съединения и редуциращи се захари, и се филтрира за изолиране на получената утайка.
6. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че процесът на неутра-

15 лизация се провежда със слаба, разтворима във вода органична киселина.
7. Метод съгласно всяка от претенции 5 и 6, характеризиращ се с това, че обработката с катионна смола се провежда при стайна температура.
8. Метод съгласно всяка от претенции от 5 до 7, характеризиращ се с това, че обработката с катионна смола се провежда от 8 до 48 h.
9. Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че обработката с катионна смола се провежда 24 h.
10. Метод съгласно всяка от претенции от 5 до 9, характеризиращ се с това, че обработката с катионна смола се извършва с Amberlite™ IR-120 в кисела форма.
11. Метод съгласно всяка от претенции от 5 до 10, характеризиращ се с това, че некиселият, летлив, съвместим с вода разтворител е етилов алкохол или ацетон.