RO117970B1

RO117970B1 - Polizaharida de glicogen si procedeu de preparare a acesteia

Info

Publication number: RO117970B1
Application number: RO95-00184A
Authority: RO
Inventors: Rosario Nicoletti; Leandro Baiocchi
Original assignee: Angelini Francesco Ist Ricerca
Priority date: 1992-08-04
Filing date: 1993-07-28
Publication date: 2002-11-29
Also published as: WO1994003502A1; FI950436A0; US5734045A; CZ25495A3; AU4703493A; CA2141040A1; SK11495A3; AU680200B2; JPH07509519A; NO950405L; DE69307897T2; SK280066B6; ITMI921927A1; GEP20001941B; RU95106640A; HU213908B; JP3204321B2; BG62259B1; FI104974B; NZ254777A

Abstract

Prezenta inventie se refera la o polizaharida de glicogen si la un procedeu de preparare a acesteia. Polizaharida de glicogen are un continut de azot mai mic de 60 ppm, determinat prin metoda Kjeldahl, si un continut in zaharuri reducatoare mai mic de 0,25%, determinat prin metoda lui F.D. Snell si Snell. Procedeul de preparare a polizaharidei de glicogen consta in aceea ca pH-ul solutiei apoase, rezultate prin dizolvarea precipitatului in apa, este ajustat la neutru, apoi solutia este tratata cu o rasina cationica, filtrata pentru a separa rasina cationica, tratata cu un solvent neacid, volatil, miscibil cu apa, pentru a precipita polizaharida fara compusi cu azot si zaharuri reducatoare si, in final, este filtrata pentru a recupera precipitatul format.

Description

Prezenta invenție se referă la o polizaharidă de glicogen și la un procedeu de preparare a acesteia. Polizaharida de glicogen este o polizaharidă practic lipsită de compuși azotați și de zaharuri reducătoare, utilizată în industria farmaceutică.

Termenul “glicogen” este utilizat în mod comun, pentru a desemna un grup de proteoglucani similari, dar nu identici, larg răspândiți în regnul animal.

Cel mai investigat glicogen este cel extras din ficat de iepure și este considerat ca fiind o proteină (glicogenin) având o greutate moleculară de aproximativ 37 000 daltoni, legată printr-o legătură glicozidică a unei tirozine la o polizaharidă puternic ramificată de glucoză având o greutate moleculară de 10 000 000 daltoni (particule beta). Mai multe particule beta, până la 50, se pot agrega împreună pentru a duce la obținerea unui compus (particule alfa) având o greutate moleculară de 500 000 000 daltoni, care este unitatea de glicogen nativ (D. J. Manners, Carbohydrate Polymers, 16, pag. 37-82 (1991)).

Diferiții glicogeni de la diferite specii animale prezintă, din câte se cunoaște, diferențe în gradul de ramificare a polizaharidei. Astfel, de exemplu, Stuart A. S. Craig ș.a., Carbohydrate Research 179, pag. 327-340 (1998)) a raportat diferențe semnificative în ceea ce privește ramificarea polizaharidei din probele de glicogen extrase de la mamifere și nevertebrate.

Deși în literatura de specialitate sunt descrise mai multe procedee diferite pentru extragerea glicogenului din țesutul animal, acestea au două obiective principale:

(i) o extragere cantitativă a glicogenului pentru un scop analitic, pentru studii biochimice, adică o extracție cu scopul determinării ulterioare a nivelului de glicogen în anumite țesuturi;

(ii) o extragere a probelor de glicogen care să minimalizeze denaturarea polimerului original, pentru studii ulterioare biochimice și conformaționale.

Ca o consecință, independent de originea lor, în toate tipurile de glicogen accesibile comercial există întotdeauna o cantitate de azot (500-600 ppm) care corespunde cel puțin celei calculate pentru proteoglucan (D. J. Manners ș.a.).

Punctele de vedere ale diverșilor autori sunt diferite: unii consideră că respectiva cantitate de azot este o urmă de impuritate, iar alții consideră această cantitate ca fiind un constituent minor al glicogenului. Pe de altă parte, diversele surse comerciale nu specifică nici o diferență între proteoglucan și polizaharida sa.

în timp ce extragerea glicogenului a fost investigată în amănunt, până în prezent a fost acordată puțină atenție extragerii polizaharidei de glicogen. într-o lucrare veche, este descris un procedeu de preparare a probelor de glicogen “fără azot”, din ficați de șobolan (M. Somogy, J. Biol. Chem., 104, 245 (1934)). Totuși, trebuie notat că în această preparare glicogenul este supus unui tratament acid timp de o noapte, adică în condiții de hidroliză pentru polizaharida de glicogen. Mai mult, sensibilitatea metodei analitice utilizate de autori pentru a testa conținutul de azot nu este cunoscută.

Atunci când s-a încercat punerea în practică a respectivei metode, s-a constatat că această este puțin reproductibilă, și produsul obținut avea o cantitate mică, dar variabilă, de azot, și/sau o cantitatea notabilă de zaharuri reducătoare (mai mult de 0,15%) ca o consecință a degradării hidrolitice.

Pentru glicogen au fost propuse diverse utilizăti farmaceutice, în special drept emolient (JP-A-178505) și drept excipient pentru proprietățile sale hidratante (JP-A-88-290809), și în produse dermatologice împotriva îmbătrânirii pielii (US 5093109).

Mai mult, s-a propus utilizarea sa drept mediu nutritiv pentru bacilii care produc acid lactic, într-o formă farmaceutică care permite reglarea pH-ului vaginal (EP 257007). Totuși, nu este destul de stabil și este posibil ca urmele de proteine, acizi nucleici și fragmente ale acestora să dea naștere unor fenomene de sensibilitate. Mai pot fi încă prezenți contaminanți remanenți.

RO 117970 Β1

Prin urmare, a fost vizată prepararea unui compus care menține în cea mai mare parte structura polizharidei de glicogen și care îi asigură, de asemenea, caracterul inofensiv și siguranța maximă, adică a unui compus care este lipsit de compuși cu azot și zaharuri reducătoare.

După mai multe încercări lipsite de succes, în mod neașteptat s-a constatat că o 55 soluție apoasă de glicogen brut, tratată pentru un timp suficient de lung cu o rășină cationică, lasă în soluție polizaharida dorită. Polizaharida poate fi precipitată cu ușurință, prin adăugarea unui solvent miscibil în apă.

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția este asigurarea unei polizaharide de glicogen practic lipsită de compuși cu azot și zaharuri reducătoare, și stabilirea parametrilor 60 procedeului de preparare a acesteia.

Așa cum se utilizează în descriere și în revendicări, expresia “practic lipsit de compuși cu azot și zaharuri reducătoare” sugerează faptul că, respectiv, conținutul de azot este mai mic de 60 ppm, determinat prin metoda Kjeldahl, și conținutul în zaharuri reducătoare, determinat prin metoda lui F.D. Snell și Snell (Colorimetric Methods of Analysis, New York, 65 1954, voi. III, pag 204), este mai mic de 0,25 %.

Mytilus Edulis și Mytilus Gallus Provincialis sunt surse deosebit de interesante de glicogen; de fapt, aceste moluște se găsesc în cantități mari la un preț de cost moderat și au un conținut de glicogen destul de mare. Astfel, polizaharida de glicogen preferată, conform acestei invenții, este cea obținută din Mytilus Edulis și Mytilus Gallus Provincialis. 70

Totuși, această invenție nu se limitează la polizaharida de glicogen din Mytilus Edulis și Mytilus Gallus Provincialis. Alte surse adecvate de glicogen pentru prepararea polizaharidei corespunzătoare, conform acestei invenții, includ alte moluște cum ar fi stridiile și Credipula Fornicata, sau organe de animale vertebrate bogate în glicogen, de exemplu, ficatul și mușchii. 75

Polizaharida de glicogen, conform invenției, are un conținut de azot mai mic de 60 ppm, determinat prin metoda Kjeldahl, și un conținut în zaharuri reducătoare, determinat prin metoda lui F.D. Snell și Snell, mai mic de 0,25 %.

De preferință, polizaharida de glicogen are un conținut de carbon de 44...45 %.

Greutatea moleculară de (2,5±0,1)x10⁶ daltoni, iar puterea de rotație [<*ζ²⁰ IR-120 de 80 197±2,0, la o concentrație c=1 kg/l în apă.

Procedeul conform invenției, de preparare a polizaharidei de glicogen, care are un conținut de azot mai mic de 60 ppm, determinat prin metoda Kjeldahl, și un conținut în zaharuri reducătoare mai mic de 0,25 %, determinat prin metoda lui F.D. Snell și Snell, prin fierberea unui țesut animal bogat în glicogen, într-o soluție apoasă de bază tare, urmată de 85 răcirea bulionului obținut, adăugarea unui solvent neacid, volatil, miscibil cu apa, separarea precipitatului format prin filtrare și dizolvarea precipitatului în apă, constă în aceea că pH-ul soluției apoase rezultate prin dizolvarea precipitatului în apă este ajustat la neutru, apoi soluția este tratată cu o rășină cationică, filtrată pentru a separa rășina cationică, tratată cu un solvent neacid, volatil, miscibil cu apa pentru a precipita polizaharida fără compuși cu azot 90 și zaharuri reducăroare, și în final, este filtrată pentru a recupera precipitatul format.

De preferință, pH-ul soluției apoase, rezultată prin dizolvarea precipitatului în apă, este ajustat la neutru cu un acid organic slab.

Tratamentul cu rășină cationică este realizat la temperatura camerei, de preferință pe parcursul a 8 până la 48 h, cel mai preferat pe parcursul a 24 h. 95

Rășina cationică este Amberlite IR-120 în formă acidă.

Solventul este alcool etilic sau acetonă.

RO 117970 Β1

Prezenta invenție prezintă următoarele avantaje:

- polizaharida obținută poate substitui glicogenul în toate utilizările sale cunoscute, fără a prezenta dezavantajele pe care le implică conținutul de proteine, acizi nucleici, sau ale unor fragmente ale acestora și/sau zaharuri reducătoare;

- costul de producție pentru polizaharidă este practic același cu costul de extragere a glicogenului.

După cum se știe, cantitatea de glicogen conținută de diferite țesuturi variază foarte mult, nu numai în funcție de țesut și de specia animală, ci, de asemenea, pentru același țesut animal, de la aceeași specie, în funcție de alți diverși factori cum ar fi starea nutrițională și momentul din an.

Astfel, cantitatea de glicogen extrasă conform tratamentului menționat mai sus depinde foarte mult de cantitatea conținută în țesutul animal tratat.

Noua etapă a procedeului din această invenție constă în ajustarea până la neutru a pH-ului soluției obținute prin dizolvarea precipitatului respectiv în apă și apoi tratarea soluției cu o rășină cationică.

Etapa de neutralizare este realizată, de preferință, cu un acid organic slab, solubil în apă, cum ar fi acidul acetic.

Tratamentul cu o rășină cationică este condus, de preferință, timp de 8 până la 48 h, sub agitare la temperatura camerei.

Un exemplu de rășină cationică corespunzătoare este Amberlite IR-120 în fomă acidă; pot fi, de asemenea, utilizate și alte rășini cationice având proprietăți similare.

Rășina cationică este separată apoi prin filtrare și se adaugă un solvent miscibil cu apa.

Exemple de solvenți preferați sunt alcoolii inferiori și cetonele, cum ar fi alcoolul etilic și acetona.

Astfel, se formează un precipitat, care este polizaharida de glicogen fără compuși cu azot și zaharuri reducătoare, și acesta este separat prin filtrare. Nu este necesară purificarea suplimentară în afară de îndepărtarea solventului.

Randamentul, față de glicogenul precipitat din bulion, este aproximativ cantitativ.

Se dau în continuare exemple de realizare a invenției, exemple care nu intenționează să limiteze în vreun fel invenția.

Exemplul 1.

A) Extragerea glicogenului într-un vas de oțel se introduc 1000 g masă de Mytilus Gallus Provincialis, împreună cu 1,0 I KOH 30%, și se încălzesc la 100°C timp de 1 h.

Soluția astfel obținută se răcește la temperatura camerei și se adaugă 1,5 I alcool etilic 95 %. Precipitatul solid format (62 g) se separă prin filtrare.

După uscare, acest produs prezintă următoarele caracteristici: C 44,44%, N 0,18...0,34%.

B) Prepararea polizaharidei de glicogen

Solidul separat în etapa A) se dizolvă în 1 I apă, se ajustează pH-ul soluției rezultate la neutru cu acid acetic glacial și apoi se filtrează pentru a fi complet limpede.

La soluția astfel obținută se adaugă 60 g Amberlite IR-120, în formă acidă, și amestecul se menține sub agitare la temperatura camerei timp de 24 h.

Rășina se separă din soluție prin filtrare, și polizaharida de glicogen se precipită prin adăugarea unui volum egal de alcool etilic 95% și apoi se separă prin filtrare.

După uscare, polizaharida de glicogen preparată astfel (61 g) prezintă următoarele caracteristici fizico-chimice:

RO 117970 Β1

C: 44,44%,

N: absent* zaharuri reducătoare: absent** greutate moleculară: (2,5±0,1) x 10⁶“* [a]_D ²⁰: 198±1,0 (c=1 în apă). 150

Hidroliză cu H₂SO₄ (3 ore la 100°C) conduce la obținerea numai a glucozei (testată prin cromatografie gazoasă conform lui M. Ochiai, J. Crom. 194, 224 (1980)).

‘(sensibilitatea metodei 60 ppm) “(testat coform F.D. Snell și Snell, Colorimetric Methods ofAnalysis, New York, 1954, voi III, pag 204, sensibilitatea metodei 0,25%) 155 ‘“(calculat din valoarea lui (eta) aplicând ecuația lui Flory cu următoarele valori·. k=1,80 x W⁴, g=0,70, obținute de L.P.Yu și J.E.Rolling pentru glicogen (J. Applied Pol. Sci. 33,1099 (1987)).

Exemplul 2. Polizaharida de glicogen din Mytilus Gallus Provincialis se prepară așa cum este descris în etapa B) din exemplul 1, cu excepția faptului că etapa de precipitare se 160 realizează cu acetonă în loc de alcool etilic.

Randament: 60,5 g [a]_D ²⁰: 196±1,0 (c=1 în apă)

Zaharuri reducătoare: absente.

Exemplul 3. 5 g de glicogen din ficat de porc, extrase conform lui Beli ș.a., Biochem. 165

J., 28, 882 (1934), se dizolvă în 85 ml apă, se tratează cu 5 g Amberlite IR-120 și apoi se precipită cu 85 ml alcool etilic 95%, așa cum se descrie în etapa B) din exemplul 1.

Azotul și zaharurile reducătoare sunt absente; puterea rotatorie este similară celei a polizaharidei de glicogen din exemplele 1 și 2.

Claims

170 Revendicări

1. Polizaharidă de glicogen, caracterizată prin aceea că are un conținut de azot mai mic de 60 ppm, determinat prin metoda Kjeldahl, și un conținut în zaharuri reducătoare mai mic de 0,25 %, determinat prin metoda lui F.D. Snell și Snell. 175

2. Polizaharidă de glicogen, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că are un conținut de carbon de 44...45 %.

3. Polizaharidă de glicogen, conform revendicărilor 1 și 2, caracterizată prin aceea că are o greutate moleculară de (2,5±0,1)x10⁶ daltoni.

4. Polizaharidă de alicogen, conform revendicărilor 1 ...3, caracterizată prin aceea 180 că are o putere de rotație U^²⁰ IR-120 de 197±2,0, la o concentrație c=1 kg/l în apă.

5. Procedeu de preparare a polizaharidei de glicogen, care are un conținut de azot mai mic de 60 ppm, determinat prin metoda Kjeldahl, și un conținut în zaharuri reducătoare mai mic de 0,25 %, determinat prin metoda lui F.D. Snell și Snell, prin fierberea unui țesut animal bogat în glicogen, într-o soluție apoasă de bază tare, urmată de răcirea bulionului 185 obținut, adăugarea unui solvent neacid, volatil, miscibil cu apa, separarea precipitatului format prin filtrare și dizolvarea precipitatului în apă, caracterizat prin aceea că pH-ul soluției apoase, rezultată prin dizolvarea precipitatului în apă, este ajustat la neutru, apoi soluția este tratată cu o rășină cationică, filtrată pentru a separa rășina cationică, tratată cu un solvent neacid volatil miscibil cu apa, pentru a precipita polizaharida fără compuși cu azot și zaharuri 190 reducăroare, și în final, este filtrată pentru a recupera precipitatul format.

6. Procedeu conform revendicării 5, caracterizat prin aceea că pH-ul soluției apoase, rezultată prin dizolvarea precipitatului în apă, este ajustat la neutru cu un acid organic slab.

RO 117970 Β1

195

7. Procedeu conform revendicărilor 5 și 6, caracterizat prin aceea că tratamentul cu rășină cationică este realizat la temperatura camerei.

8. Procedeu conform revendicărilor 5...7, caracterizat prin aceea că tratamentul cu rășină cationică este realizat pe parcursul a 8 până la 48 h.

9. Procedeu conform revendicării 8, caracterizat prin aceea că tratamentul cu rășină 200 cationică este realizat pe parcursul a 24 h.

10. Procedeu conform revendicărilor 5...9, caracterizat prin aceea că rășina cationică este Amberlite IR-120 în formă acidă.

11. Procedeu conform revendicărilor 5...10, caracterizat prin aceea că solventul este alcool etilic sau acetonă.