FI104974B - Glykogeenipolysakkaridit - Google Patents

Description

χ 104974

Glykogeenipolysakkaridit Tämä keksintö koskee glykogeenipolysakkarideja, menetelmää niiden valmistamiseksi ja niiden käyttöä. Tar-5 kemmin sanottuna tämä keksintö koskee glykogeenipolysakkarideja, jotka eivät sisällä oleellisesti typpiyhdisteitä ja pelkistäviä sokereita.

Termiä "glykogeeni" käytetään yleisesti tarkoittamaan ryhmää, joka koostuu samanlaisista, mutta ei identti-10 sistä proteoglykaaneista, jotka ovat laajalle levinneitä eläinkunnassa.

Tutkituin glykogeeni on kaniinin maksasta uutettu glykogeeni ja sen uskotaan olevan proteiini (glykogenii-ni), jonka molekyylipaino on noin 37 000 daltonia ja joka 15 on sitoutunut tyrosiinin glykosidisen sidoksen kautta erittäin haaroittuneeseen glukoosin polysakkaridiin, jonka molekyylipaino on 10 000 000 daltonia (beetahiukkanen). Monet beetahiukkaset, jopa 50 beetahiukkasta, voivat kasautua yhteen tuottaen yhdisteen (alfahiukkaset), jonka 20 molekyylipaino on 500 000 000 daltonia ja joka on luontaisen glykogeenin yksikkö [D. J. Manners, Carbohydrate Polymers, 16, sivut 37 - 82 (1991)].

Eri eläinlajien erilaiset glykogeenit, mikäli tun-netaan, osoittavat eroja polysakkaridin haaroittumisas- e 25 teessä. Siten esimerkiksi julkaisussa Stuart, A. S., Craig t>*{* et ai., Carbohydrate Research, 179, sivut 327 - 340 (1988) :***: raportoidaan merkitseviä eroja nisäkkäistä ja selkärangat- • · · • tornista uutettujen glykogeeninäytteiden polysakkaridin • · · · .·;·. haaroittumisessa.

• · » * 30 Vaikka kirjallisuudessa on kuvattu useita erilaisia - ... menetelmiä glykogeenin uuttamiseksi eläinkudoksista, niil- • · "I lä on todellakin pääasiassa kaksi erilaista tavoitetta: (i) glykogeenin kvantitatiivinen uutto biokemian analyyttisellä alueella; so. uutto, joka tähtää tietyssä < 4 I 4 2 104974 kudoksessa olevan glykogeenln pitoisuuden myöhemmin tapahtuvaan kvantitatiiviseen määrittämiseen; (ii) glykogeeninäytteiden uutto minimoiden alkuperäisen polymeerin denaturoituminen myöhempiä biokemialli-5 siä tutkimuksia ja konformaatiotutkimuksia varten.

Siten kaikissa kaupallisesti saatavissa olevissa glykogeenityypeissä huolimatta niiden alkuperästä on aina hiukan typpeä (500 - 600 ppm) vastaten ainakin määrää, joka on laskettu proteoglykaanille (D. J. Manners et ai., 10 kuten edellä on viitattu).

Kirjallisuustutkimuksesta havaitaan huomattava ero eri kirjoittajien näkökantojen välillä, jolloin jotkut kirjoittajat pitävät mainittua typen määrää pienenä epäpuhtautena ja toiset pitävät sitä glykogeenin vähäisenä 15 aineosana. Toisaalta eri kaupalliset lähteet eivät mainitse erikseen mitään eroa proteoglykaaniglykogeenin ja sen polysakkaridin välillä.

Vaikka glykogeenin uutto on perusteellisesti tutkittu, tähän mennessä vähän huomiota on omistettu glyko-20 geenipolysakkaridin uutolle. Vain yhdessä vanhassa julkaisussa kuvataan menetelmä "typpeä sisältämättömien" glykogeeninäytteiden valmistamiseksi rotan maksasta [M. Somo-gyi, J. Biol. Chem., 104, 245 (1934)]. Kuitenkin pitäisi huomata, että tässä valmistuksessa glykogeeni joutuu hap-25 pokäsittelyn kohteeksi yöksi, nimittäin glykogeenipolysak- t#1:1 karidin hydrolyysiolosuhteissa. Lisäksi kirjoittajien käyttämän analyyttisen menetelmän herkkyys typpipitoisuu- • · · • den tutkimiseksi ei ole tunnettu.

« « « .·;·. Kun yritimme harjoittaa käytännössä mainittua mene- j 30 telmää, sen havaittiin olevan huonosti toistettavissa ja | ... saadulla näytteellä oli pieni, mutta vaihteleva määrä typ- peä ja/tai huomattava määrä pelkistäviä sokereita (enemmän ; ; kuin 0,15 %) hydrolyyttisen hajoamisen seurauksena.

: Glykogeenille on ehdotettu erilaisia farmaseuttisia ! f f f : : 35 käyttökohteita, erityisesti pehmittävänä aineena (julkaisu I « f t · · 3 104974 JP-A-87-178 505) ja täyteaineena sen hydratoivien ominaisuuksien vuoksi (julkaisu JP-A-88-290 809) ja ihonhoitotuotteissa ihon vanhenemista vastaan (julkaisu US-5 093 109).

5 Lisäksi on ehdotettu sen käyttöä ravintoalustana basilleille, jotka tuottavat maitohappoa, farmaseuttisessa muodossa vaginan pH:n säätelemiseksi (EP-hakemusjulkaisu 0 257 007). Kuitenkaan se ei ole riittävän stabiili ja on todennäköistä, että sen proteiinien ja nukleiinihappojen 10 ja niiden fragmenttien jäämät saavat aikaan herkkyysil-miöitä. Läsnä voisi olla myös eläviä kontaminantteja.

Sen vuoksi tähtäsimme sellaisen yhdisteen valmistamiseen, joka säilyttää suurimmaksi osaksi glykogeenipoly-sakkaridin rakenteen ja varmistaa myös maksimaalisen vaa-15 rattomuuden ja turvallisuuden. Tämä tarkoittaa yhdistettä, joka ei sisällä typpiyhdisteitä eikä pelkistäviä sokereita.

Monien turhien yritysten jälkeen havaittiin yllättäen, että raa'an glykogeenin vesiliuos, jota käsitellään 20 riittävän pitkän aikaa kationiaktiivisella hartsilla, jättää liuokseen halutun polysakkaridin. Polysakkaridi voidaan sitten helposti saostaa lisäämällä liuotin, joka on veteen sekoittuva.

Siten tämän keksinnön ensimmäinen kohde on tuottaa 25 glykogeenipolysakkaridi, joka ei sisällä oleellisesti typ-...l piyhdisteitä ja pelkistäviä sokereita.

Ml ·...· Tässä patenttiselityksessä ja sen liitteenä olevis- * · ·.· · sa patenttivaatimuksessa käytettynä ilmaisu "ei sisällä oleellisesti typpiyhdisteitä ja pelkistäviä sokereita" 30 tarkoittaa, että typpipitoisuus on vähemmän kuin 60 ppm - .·**. mitattuna Kjeldahl-menetelmällä ja pelkistävien sokereiden #···. pitoisuus on vähemmän kuin 0,25 % mitattuna menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa F. D. Snell ja Snell, Colorimetric Methods of Analysis New York, 1954, vol. Ill, sivu 35 204.

«e *

«II

104974 4

Mytilus Edulis ja Mytilus Gallus Provincialis ovat erityisen kiinnostavia glykogeenilähteitä; itse asiassa näitä nilviäisiä löytyy suuria määriä kohtalaisin matalin kustannuksin ja niillä on melko suuri glykogeenipitoisuus.

5 Siten edullinen glykogeenipolysakkaridi tämän keksinnön mukaisesti on Mytilus Eduliksesta ja Mytilus Gallus Provincial iksesta saatu glykogeenipolysakkaridi.

Tätä keksintöä ei kuitenkaan rajoiteta Mytilus Eduliksesta ja Mytilus Gallus Provincialiksesta saatuun gly-10 kogeenipolysakkaridiin. Muihin sopiviin glykogeenilähtei siin vastaavan polysakkaridin valmistamiseksi tämän keksinnön mukaisesti sisältyvät muut nilviäiset, kuten osterit ja Credipula Fornicata, tai selkärankaisten eläinten elimet, joissa on runsaasti glykogeeniä, kuten maksa ja 15 lihas.

Tämän keksinnön glykogeenipolysakkaridi on lisäksi tunnettu hiilipitoisuudesta, joka on noin 44 - 45 %, mole-kyylipainosta, joka on noin (2,5 ± 0,1) x 106 daltonia, ja rotaatiovoimasta (alfa)™, joka on 197 ± 2,0 (c = 1 vedes-20 sä).

Menetelmässä ensimmäinen vaihe tämän keksinnön gly-kogeenipolysakkaridin valmistamiseksi toteutetaan tavanomaisen tekniikan mukaisesti, joka käsittää valittujen kudosten keittämisen vahvan emäksen vesiliuoksessa, näin 25 saadun lihaliemen jäähdyttämisen ja sitten glykogeenin ...: saostamisen lisäämällä ei-hapanta, haihtuvaa liuotinta, • · · joka on veteen sekoittuva.

• tj j Kuten on jo hyvin tunnettua, eri kudoksiin sisälty- vän glykogeenin määrä vaihtelee laajasti, ei vain koskien 30 kudosta ja eläinlajia, vaan myös saman lajin saman eläin- .*··. kudoksen osalta, johtuen erilaisista muista tekijöistä, · · .···. kuten ravitsemustilasta ja vuodenajasta.

Siten edellä mainitun käsittelyn mukaisesti uutetun glykogeenin määrä riippuu suuresti käsiteltyihin eläinku-35 doksiin sisältyvästä määrästä.

5 104974 Tämän keksinnön menetelmän uusi vaihe käsittää liuoksen pH-arvon säätämisen neutraaliksi, kun liuos on saatu liuottamalla mainittu sakka veteen, ja sitten liuoksen käsittelemisen kationiaktiivisella hartsilla.

5 Siten tämän keksinnön muu kohde on tuottaa menetel mä oleellisesti typpiyhdisteitä ja pelkistäviä sokereita sisältämättömän glykogeenipolysakkaridin valmistamiseksi, jolloin menetelmässä runsaasti glykogeeniä sisältävä eläinkudos keitetään vahvan emäksen vesiliuoksessa, näin 10 saatu lihaliemi jäähdytetään, lisätään ei-hapan, haihtuva liuotin, joka on veteen sekoittuva, erotetaan muodostunut sakka suodattamalla ja liuotetaan mainittu sakka veteen, menetelmän ollessa tunnettu siitä, että sakan vesiliuoksen pH-arvo säädetään neutraaliksi ja liuos käsitellään katio-15 niaktiivisella hartsilla, suodatetaan kationiaktiivisen hartsin erottamiseksi, käsitellään ei-happamalla, haihtuvalla liuottimena, joka on veteen sekoittuva, typpiyhdisteitä ja pelkistäviä sokereita sisältämättömän polysakkaridin saostamiseksi ja suodatetaan muodostuneen sakan tal-20 teenottamiseksi.

Neutralointivaihe toteutetaan edullisesti käyttäen heikkoa orgaanista happoa, joka on vesiliuokoinen, kuten etikkahappoa.

Käsittely kationiaktiivisella hartsilla toteutetaan 25 edullisesti 8-48 tunnin kuluessa sekoittaen ja huoneen- l»k lämpötilassa.

• · · *...· Esimerkki sopivasta kationiaktiivisesta hartsista • · :.· · on Amberlite™ IR-120 happomuodossa; voidaan myös käyttää • » * J muita kationiaktiivisia hartseja, joilla on samanlaiset 30 ominaisuudet.

- :***; Kationiaktiivinen hartsi erotetaan sitten suodatta- • · .*··. maila ja veteen sekoittuva liuotin lisätään.

Esimerkkejä edullisista liuottimista ovat alemmat alkoholit ja ketonit, kuten etyylialkoholi ja asetoni.

« · 104974 6 Näin muodostuu sakka, joka on glykogeenipolysakka-ridia, joka ei sisällä typpiyhdisteitä ja pelkistäviä sokereita, ja se erotetaan suodattamalla. Ei tarvita lisä-puhdistusta lukuunottamatta liuottimen poistamista.

5 Saanto koskien lihaliemestä saostettua glykogeeniä on likimäärin kvantitatiivinen.

Siten yksi tämän keksinnön menetelmän muista eduista on, että keksinnön polysakkaridin tuotantokustannus on olennaisilta osin sama kuin glykogeenin uuttokustannus. 10 Toisin sanoen oleellisesti samoilla kustannuksilla tämä keksintö tuottaa tuotteen, joka voi korvata glykogeenin sen kaikissa tunnetuissa käyttökohteissa ilman siihen sisältyvien proteiinien, nukleiinihappojen tai niiden fragmenttien ja/tai pelkistävien sokereiden muodostamia hait-15 toja.

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu tämän keksinnön kuvaamiseksi rajoittamatta sitä kuitenkaan millään tavoin.

Esimerkki 1 A) Glykogeenin uuttaminen 20 1 000 g Mytilus Gallus Provincialis -nilviäismassaa pantiin teräastiaan 1,0 l:n kanssa 30-%:ista K0H:a ja seosta kuumennettiin 100 °C:n lämpötilassa yhden tunnin ajan.

Näin saatu liuos jäähdytettiin huoneenlämpötilaan 25 ja siihen lisättiin 1,5 1 95-%:ista etyylialkoholia. Muo- ···· dostunut kiinteä sakka (62 g) erotettiin suodattamalla.

*·.·1 Kuivaamisen jälkeen tällä tuotteella oli seuraavat • · ·.: : tunnusmerkit: :T: C: 44,44 % 30 N: 0,18 - 0,34 %.

B) Glykogeenipolysakkaridin valmistus • · · .··1. Vaiheessa A erotettu kiinteä aine liuotettiin 1 l:aan vettä, tulokseksi saadun liuoksen pH-arvo säädet-tiin neutraaliksi jääetikan avulla ja sitten liuos suoda-35 tettiin täydellisesti läpikuultavaksi.

· · i · 7 104974 Näin saatuun liuokseen lisättiin 60 g Amberlite™ 15-120 -hartsia happomuodossa ja seosta pidettiin sekoittaen huoneenlämpötilassa 24 tunnin ajan.

Hartsi erotettiin liuoksesta suodattamalla ja gly-5 kogeenipolysakkaridi seostettiin lisäämällä yhtä suuri tilavuus 95-%:ista etyylialkoholia ja sitten sakka erotettiin suodattamalla.

Kuivaamisen jälkeen näin valmistettu glykogeenipo-lysakkaridi (61 g) osoitti seuraavia fysikokemiallisia 10 tunnusmerkkejä: C: 44,44 % N: poissa*

Pelkistävät sokerit: poissa**

Molekyylipaino: (2,5 ± 0,1) x io6*** 15 (alfa)o°: 198 ± 1,0 (c « 1 vedessä).

Hydrolyysi 1 N H2S04:n avulla (3 tuntia 100 eC:ssa) tuottaa vain glykoosia [tutkittu kaasukromatografialla menetelmän mukaan, joka on kuvattu julkaisussa M. Ochiai, J. Crom., 194, 224, (1980)].

20 * (menetelmän herkkyys 60 ppm) ** (tutkittu menetelmän mukaan, joka on kuvattu julkaisussa F. D. Snell ja Snell, Colorimetric Methods of Analysis New York, 1954, vol. Ill, sivu 204, menetelmän herkkyys 0,25 %) 25 *** (laskettu (etan) arvosta Flory'n yhtälön avulla käyttäen seuraavia arvoja, k - 1,80 χ 10'4, a = 0,70, L. P.

· *··’ YU'n ja J. E. Rolling'in saama arvo glykogeenille [J. App- : lied Pol. Sei., 33, 1909 (1987)].

· Esimerkki 2 30 Glykogeenipolysakkaridi Mytilus Gallus Provincialis -nilviäisestä valmistettiin, kuten on kuvattu esimerkin 1 · · osassa B paitsi, että saostamisvaihe toteutettiin käyttäen asetonia etyylialkoholin sijasta.

Saanto: 60,5 g 35 (alfa)”: 196 ± 1,0 (c = 1 vedessä)

Pelkistävät sokerit: poissa.

« · « 104974 8

Esimerkki 3 5 g glykogeeniä, joka oli uutettu sian maksasta menetelmän mukaan, joka on kuvattu julkaisussa Bell et ai., Biochem. J., 28, 882 (1934), liuotettiin veteen (85 5 ml), liuos käsiteltiin Amberlite™ IR-120 -hartsilla (5 g) ja sitten seostettiin 95-%:isella etyylialkoholilla (85 ml), kuten on kuvattu esimerkin 1 osassa B.

Typpi ja pelkistävät sokerit olivat poissa; rotaa-tiovoima oli samanlainen kuin esimerkkien 1 ja 2 glykogee-10 nipolysakkarideilla.

i il

Zl Ί ] « « - I 1

! IIC

i ; V

1 f * 2 • · · · • · · • · • · ·· # • · ·

• · V

• · « · • « t • to t · · • • · · t · t · • · t • t · • · • · III I · I * I « ·

Claims (11)

104974

1. Glykogeenipolysakkaridi, tunnettu siitä, että siinä typpipitoisuus on vähemmän kuin 60 ppm mi- 5 tattuna Kjeldahl-menetelmällä ja pelkistävien sokereiden pitoisuus on vähemmän kuin 0,25 % mitattuna F. D. Snell’in ja Snell'in menetelmällä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polysakkaridi, tunnettu siitä, että sen hiilipitoisuus on noin 10 44 - 45 %.

3. Kumman tahansa patenttivaatimuksista 1 tai 2 mukainen polysakkaridi, tunnettu siitä, että sen molekyylipaino on noin (2,5 ± 0,1) x 106 daltonia.

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukai-15 nen polysakkaridi, tunnettu siitä, että sen ro- taatiovoima (alfa)^° on 197 ±2,0 (c = 1 vedessä).

5. Menetelmä glykogeenipolysakkaridin valmistamiseksi, jossa typpipitoisuus on vähemmän kuin 60 ppm mitattuna Kjeldahl-menetelmällä ja pelkistävien sokereiden pi- 20 toisuus on vähemmän kuin 0,25 % mitattuna F. D. Snell'in ja Snell'in menetelmällä, menetelmän käsittäessä runsaasti glykogeeniä sisältävän eläinkudoksen keittämisen vahvan emäksen vesiliuoksessa, näin saadun lihaliemen jäähdyttämisen, ei-happaman, haihtuvan, veteen sekoittuvan liuot-25 timen lisäämisen, muodostuneen sakan erottamisen suodat- **" tamalla ja mainitun sakan liuottamisen veteen, t u n - • · /·;* n e t t u siitä, että sakan vesiliuoksen pH-arvo sääde- :·; : tään neutraaliksi ja liuos käsitellään kationiaktiivisella · · • * * hartsilla, suodatetaan kationiaktiivisen hartsin erottami- 30 seksi, käsitellään ei-happamalla, haihtuvalla, veteen se-. koittuvalla liuottimelle typpiyhdisteitä ja pelkistäviä sokereita sisältämättömän polysakkaridin saostamiseksi ja suodatetaan muodostuneen sakan talteenottamiseksi.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että neutralointivaihe toteutetaan : käyttäen heikkoa orgaanista happoa. I » I 4 t 104974

7. Kumman tahansa patenttivaatimuksista 5 ja 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely kationiaktiivisella hartsilla toteutetaan huoneenlämpötilassa.

8. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 5-7 mukai nen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely kationiaktiivisella hartsilla toteutetaan 8-48 tunnin kuluessa.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että käsittely kationiaktiivisella hartsilla toteutetaan 24 tunnin kuluessa.

10. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 5-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kationiak-tiivinen hartsi on Amberlite™ IR-120 happomuodossa.

11. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 5-10 mu kainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuotin on etyylialkoholi tai asetoni. I f ·«·· • · · • · • · ·· · • * i « I • * * « · · • « · • I · • · · • · « • · • · • · · • · · • · • « ( f « I · 104974