KR20030068215A

KR20030068215A - 연골형 프로테오글리칸의 정제방법

Info

Publication number: KR20030068215A
Application number: KR1020020007857A
Authority: KR
Inventors: 다카가키게이이치
Original assignee: 가쿠히로 컴파니 리미티드; 다카가키 게이이치
Priority date: 2002-02-14
Filing date: 2002-02-14
Publication date: 2003-08-21

Abstract

본 발명은 유해한 시약을 사용하지 않고 간단하고 비용이 적게 드는 연골형 프로테오글리칸의 정제방법을 제공한다.

또한 본 발명은 조 프로테오글리칸의 용출용매에 초산을 사용하는 것을 특징으로 하는 프로테오글리칸의 정제방법에 관한 것이다.

Description

연골형 프로테오글리칸의 정제방법{A method for extraction and purification of cartilage type proteoglycan}

본 발명은 연골형 프로테오글리칸의 신규한 정제방법에 관한 것이다.

복합당질로서의 연골형 프로테오글리칸 분자 1개는, 도1에 나타내는 바와 같은 구조를 가지고, 분자량 수 만에서 수십 만의 코어 단백질이라 불리는 골격의 단백질 1가닥에, 분자량 수 천에서 수십 만의 장대한 당사슬 글리코사미노글리칸(이하 GAG 당사슬이라고 한다)이 수 가닥에서 수십 가닥 결합한 생체고분자이다. GAG 당사슬은, 그 기본골격에 따라 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 데르마탄황산(dermatan sulfate) 등 몇 가지 종류로 나뉘고, 기본적으로는 아미노당과 우론산(uronic acid)의 2당 반복구조로 된 장쇄의 헤테로산성 다당으로, 히알루론산 이외의 GAG는 코어 단백질에 결합하여 프로테오글리칸을 형성하고 있다.

프로테오글리칸은, 콜라겐이나 히알루론산과 함께, 거의 모든 동물조직에 있어서, 세포와 세포 사이에 있는 세포외 매트릭스의 중요한 구성성분으로서 보편적으로 존재하고 있어(도2), 조직구축의 중요한 역할을 담당하고 있는 것 외에, 세포를 둘러싸는 물리적 환경을 만들어, 접착, 증식, 분화라는 여러 세포활동을 제어하고 있다. 세포외 매트릭스의 각 분자나 GAG는, 단독으로도 수분의 유지와 보충, 해독, 진통 등의 기능을 가지지만, 이들이 서로 결합하여, 거대한 구조로 되어 상호작용 했을 때에는, 보다 커다란 효과를 발휘한다.

본 발명의 대상으로 하고 있는 연골형 프로테오글리칸은, 콜라겐, 히알루론산, GAG 각각으로만 되어 있는 구조에 비해 거대한 분자량을 가지며, 또한 복잡한 구조이기 때문에, 프로테오글리칸 단독으로도 다른 것 보다 높은 수분 유지능력 및 수분 보충능력을 가지는 동시에, 그 GAG 당사슬부분의 생물학적 정보시그날구조에 의존한 다른 기능도 기대할 수 있다.

그러나, 현시점에서의 프로테오글리칸의 정제방법은, 주로 소나 고래의 연골을 원재료로 하여, 클로로포름, 메탄올, 구아니딘염산염 등과 같은 독성이나 유해성을 갖는 시약류를 사용하여, 복잡한 공정을 거쳐 정제하고 있지만, 산업상 이용할 수 있는 수준은 아니며, 실험용 시약으로서 극미량으로 정제된 것이, 1 g당 수천만엔이나 되는 가격으로 판매되고 있다.

본 출원인 등은, 이전 연어의 코연골을 원재료로 하여, 정제방법을 간략화 하여 산업상 이용할 수 있는 수준의 양산정제방법을 발명하여 특허출원했다(1999년 11월 22일 출원, 일본국 특원평11-331375호). 이 방법은 구체적으로는 연어의 코연골을 분쇄, 탈지처리, 용매추출, 투석 등의 수단을 행하는 것으로서, 이것에 의해 대량정제, 비용이 적게 드는 정제방법은 얻을 수 있었지만, 탈지처리, 또는 용매추출에 클로로포름, 메탄올, 구아니딘염산염 등 외에 단백질분해효소저해제 등의 유해시약도 사용했기 때문에, 인체내에 섭취하는 의약품의 의약재료, 건강보조식품의 첨가제로서의 응용은 어려워, 의약부외품, 화장품재료로서의 용도로 한정되어 있었다. 또한, 상기의 시약류의 판매가격도 상당히 고가였기 때문에, 정제비용을 줄이는데도 한계가 있었다.

또 다른 한편으로, 본 출원인 등은 낮은 가격의 프로테오글리칸을 발표했기 때문에, 화장품업계 뿐 아니라, 가공식품, 건강보조식품, 의약품업계에서도 프로테오글리칸 응용상품의 개발요구가 높아졌다. 그러나, 프로테오글리칸을 가공식품, 건강보조식품, 의약품 등으로 응용하기 위해서는, 프로테오글리칸의 정제방법에 특별한 주의가 필요하다. 프로테오글리칸의 정제에 있어서 구아니딘염산염을 사용하는 것이 일반적이지만, 그 구아니딘염산염은 물론, 클로로포름, 메탄올, 단백질분해효소저해제 등의 유독, 유해한 시약을 전혀 사용하지 않고 보다 간편하고 보다비용이 적게 드는 정제방법을 얻는 것이 강하게 요구되었다.

따라서, 본 발명자 등은 상술한 바와 같은 상황에 대응하여 프로테오글리칸의 정제과정에 있어서 유독, 유해한 시약을 전혀 사용하지 않고 보다 간편하고 보다 비용이 적게 드는 정제방법에 대해서 여러 가지로 검토한 결과, 본 발명을 완성한 것으로, 본 발명의 목적은, 유해한 시약을 사용하지 않고 간단하고 비용이 적게 드는 연골형 프로테오글리칸의 정제방법을 제공하는 것이다.

도1은, 프로테오글리칸의 구조모형도이다.

도2는, 세포외 매트릭스의 모식도이다.

도3은 4% 초산처리에 의한 용출 프로테오글리칸의 경시적 변화그래프이다.

부호의 설명

1코어 단백질(core protein)

2글루코사미노글리칸(glucosaminoglycan)당사슬

3히알루론산(hyaluronic acid)

4콜라겐(collagen)

5프로테오글리칸(proteoglycan)

본원의 청구항1의 발명은, 조 프로테오글리칸의 용출용매에 초산을 사용하는 것을 특징으로 하는 프로테오글리칸의 정제방법이고, 청구항2의 발명은, 조 프로테오글리칸의 용출용매에 초산을 사용하여, 얻어진 용출액을 여과후 원심분리하고, 상등액에 식염포화 에탄올을 가하여 재차 원심분리하여 조 프로테오글리칸을 농축시킨 것을 특징으로 하는 프로테오글리칸의 정제방법이다. 그리고, 청구항3의 발명은, 조 프로테오글리칸의 용출용매에 초산을 사용하여, 얻어진 용출액을 여과후 원심분리하고, 상등액에 식염포화 에탄올을 가하여 원심분리함으로써 얻어진 조 프로테오글리칸을 포함하는 반고형 침전물을 초산에 용해하고, 이어서 투석함으로써, 조 프로테오글리칸의 순도를 더욱 향상시키는 것을 특징으로 한 프로테오글리칸의 정제방법이다.

즉, 본 발명에서는, 클로로포름, 메탄올, 구아니딘염산염, 단백질분해효소저해제 등의 유독, 유해한 시약 대신에, 프로테오글리칸의 전체 정제과정을 통해 초산, 식염 및 미변성 에탄올 만을 사용하는 것으로 했다. 이들 시약은 모두 일반 가공식품에 이용되고 있는 것들 뿐이다. 또한 보다 간편한 정제방법을 얻기 위해, 상기의 특허출원에 있어서 사용했던 요소에 의한 치환, DEAE-Sephacel법에 의한 분리정제과정을 생략하기로 했다.

다음에 본 발명의 실시형태를 구체적으로 설명한다.

본 발명의 프로테오글리칸의 원재료로서는, 소나 고래의 연골을 사용하더라도 좋지만, 입수의 용이성 및 비용면 등에서 볼 때 연어의 코연골이 바람직하고, 특히 아오모리현 연안에서 어획된 흰연어를 통조림 등의 식료품으로 가공처리했을 때에 배출되는 머리부분을 사용하는 것이 바람직하다.

사용하는 초산으로서는 식품용, 공업용품 등 어느 것이더라도 좋지만, 그 얻어지는 프로테오글리칸의 사용목적에 따라 적절히 선택한다. 그 농도는 후술하는 시험에 의해 4%인 것이 바람직하지만, 이 농도에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

원료로서 아오모리현 연안에서 어획된 흰연어를 통조림 등의 식료품으로 가공처리했을 때에 배출되는 머리부분을 사용하며, 이것을 일단 -30℃에서 보존한다.

상기의 보존한 상기 원료를 4℃에서 20시간 해동후, 칼을 사용하여 연어 머리부분으로부터 코연골을 채취하여 출발재료로 했다. 이 연어의 코연골로부터 핀셋을 사용하여 고형 지방을 가급적 제거하고, 생리식염수로 세척했다. 이어서, 손회전식 고기다지는 기기로 잘게 분쇄하여, 잘게 썰어진 연어의 코연골을 얻었다.

이 잘게 썰어진 연어 코연골의 일부를 10배용량(W/V)의 업무용 양조초(식초중의 초산과 거의 동일한 농도인 4%로 희석하여 사용한다. 이후 4% 초산이라고 한다) 속에 4℃에서 0, 6, 12, 24, 48, 72, 120, 168시간 담그고, 교반하여, 조 프로테오글리칸의 용출상태를 카르바졸 ·황산법에 의한 우론산량으로서 경시적으로 관찰했다. 그 결과를 도3에 나타낸다. 도3에서 조 프로테오글리칸의 용출은 24시간까지 현저하게 증가하고, 그 후의 증가량은 현저하지 않았다. 이 결과에 의해, 4% 초산에 대한 조 프로테오글리칸의 용출시간은, 48시간이 가장 효율이 좋은 것이 판명되었다.

상기의 결과를 토대로, 잘게 썰어진 연어의 코연골 50 g을 4% 초산에, 4℃에서 48시간 담그고, 교반하고 조 프로테오글리칸의 용출을 행하여, 프로테오글리칸을 얻었다(청구항 1의 발명).

이어서, 그 용출액을 스테인레스스틸 메쉬(150 ㎛)로 여과하여 불용물을 제거했다. 이어서, 조 프로테오글리칸을 포함하는 용액을 원심분리기(4℃, 10,000 rpm, 20분간)로 원심분리했다. 얻어진 상등액에 3배량의 식염포화 에탄올을 가하여 교반한 후, 재차 원심분리기(4℃, 10,000 rpm, 20분간)로 원심분리하여, 농축된 반고형상의 프로테오글리칸을 얻었다(청구항 2의 발명).

이 반고형상의 프로테오글리칸을 다시 4% 초산에 담궈 용해하고, 용액을 배제한계 분자량 100만인 셀룰로오스 에스테르 멤브란 투석튜브로 충분히 투석하여, 순도가 높은 액상의 프로테오글리칸을 얻었다(청구항 3의 발명).

프로테오글리칸은, 동결건조하여, 분말상으로 보존하는 것이 바람직하다. 본 실시예에서는 투석내액을 동결건조하여, 분말 프로테오글리칸 표준품 240 mg을 얻었다.

청구항 3의 발명의 방법에 의해 얻어진 프로테오글리칸에 대해서, 다음에 기술하는 방법에 의해 성상을 조사했다.

먼저, 화학분석의 결과를 표1에 나타낸다.

연어 코연골 프로테오글리칸 표준품의 화학분석

몰비	단백질%(w/w)
헥소사민	단백질%(w/w)	우론산	황산
1.00	0.99^*	0.67^*	6.99

^*헥소사민을 1.00으로 했을 때의 몰비를 나타냈다

표1에 있어서 우론산 및 황산은 헥소사민을 1.00으로 했을 때의 몰비로, 그 값은 각각 0.99와 0.67이고, 구성성분으로서의 이들 3자는, 거의 당량씩 존재하는 것으로 알려졌다. 또한, 코어 단백질은 6.99%(w/w)이고, 우론산과의 비(코어 단백질/우론산)는 0.23(w/w)이었다. 이 비율은 프로테오글리칸의 순도를 나타내는 하나의 값으로, 그 이론값 0.2에 가깝다.

이 표준품의 단백질을 구성하는 아미노산조성의 분석에서는, 시약으로서 판매되고 있는 소의 코연골 프로테오글리칸의 문헌기재와 마찬가지로, 글리신, 세린, 글루타민산이 특히 많고, 연어의 코연골 프로테오글리칸의 전체 아미노산 1000잔기중에 있어서의 글리신, 세린, 글루타민산 3자의 총합계는 386잔기를 차지하고 있다. 한편, 히드록시프롤린에 대해서는 겨우 2잔기였다. 히드록시프롤린은 콜라겐단백질에 특징적인 아미노산으로, 이 연어의 코연골 프로테오글리칸 표준품으로의 콜라겐의 혼입은 인정되지만, 그 양은 매우 적어, 유의한 양이라고는 할 수 없다. 따라서, 얻어진 연어의 코연골 프로테오글리칸의 순도는 매우 높다고 할 수 있다.

이어서 연어의 코연골 프로테오글리칸의 분자사이즈에 관한 정보를 얻기 위해, SB805HQ 컬럼(8 ×300 mm)을 사용하여 고속액체 크로마토그래피를 행하고, 그 피크의 용출위치는 215 nm의 자외선흡수에 의해 확인했다. 이 때에는, 시약으로서 판매되고 있는 소의 코연골 프로테오글리칸의 그것과 비교했다. 그 결과 SB805HQ 컬럼으로부터의 대칭 피크로서의 용출위치(KAV)는 연어의 코연골 프로테오글리칸에서 0.28, 소의 코연골 프로테오글리칸에서 0.17로 나타나, 연어의 코연골 프로테오글리칸의 분자사이즈는 소의 코연골 프로테오글리칸의 그것에 비해 작은 것으로 나타났다.

더욱이, 연어의 코연골 프로테오글리칸의 코어 단백질부분을 프로나아제소화하고, 남은 GAG 당사슬부분의 시료를, 표준품으로서의 콘드로이틴6-황산(Ch6S), 데르마탄황산(DS) 및 히알루론산(HA)과 함께 셀룰로오스아세테이트막상에서 전기영동에 걸었다. 그 결과, 표준품의 콘드로이틴6-황산(Ch6S)에 일치하는 단일밴드가 나타나, 연어의 코연골 프로테오글리칸의 GAG의 대부분은 콘드로이틴황산인 것이 알려졌다.

이 GAG 당사슬의 2당단위 이성체에 대해서도 조사했다. 프로테오글리칸을 프로나아제로 소화한 후, 콘드로이티나아제 ABC로 소화하고, 그 때 생성하는 불포화2당을 고속액체 크로마토그래피(Polyamin-Ⅱ 컬럼)로 분석했다. 그 결과를 표2에 나타낸다. 표2에서 대부분은 2당 1황산 구조였다.

불포화 2당분석

△Di-OS	△Di-6S	△Di-4S	△Di-diSD	△Di-triS
15.1	59.4	25.1	0.3	0.1

이상과 같이, 연어의 코연골을 원재료로 하는 프로테오글리칸이, 식품첨가물로서 리스트에 수록되어 있는 시약(예를 들면, 다니무라 아키오 ·외 감수「식품중의 식품첨가물 분석법 해설서, 제Ⅲ부 화학적 합성품 이외의 식품첨가물」(1992년 고단사발행), 또는 식품의 보존이나 조미료의 원재료로서 사용되는 시약(구리이하라게이쇼 ·외감수「종합식품 안전사전」(1995년 산업조사회사전 출판센터발행) 참조)만으로 얻어진 것은 획기적인 발명이다. 더욱이 요소에 의한 치환, DEAE-Sephacel법에 의한 분리정제 등 시간과 수고가 드는 공정을 필요로 하지 않고 가능했던 것도 획기적인 발명으로, 보다 간편하고 보다 비용이 적게 드는 정제방법을 얻는다는 과제를 한꺼번에 해결할 수 있게 된 것이다.

이상의 결과로부터, 본 발명을 토대로 얻어진 연어의 코연골 프로테오글리칸은, 경구적으로 섭취 가능하고, 또한, 종래의 방법에 의한 것과 거의 동등한 순도인 것이 확인되었다.

현재, 히알루론산은, 박테리아로부터 안전하고 또한 대량으로 얻을 수 있게 되어, 의약품에 응용되고 있다. 한편, 프로테오글리칸은 고도의 수분 유지능력, 수분 보충능력, 해독, 진통 등의 작용을 가지고 있음이 알려지고 있고, 더욱이 GAG당사슬부분에 의존한 다른 기능도 기대되고 있지만, 지금까지의 정제방법에 의해 얻어진 프로테오글리칸으로는, 인간에 사용하여 그 유용성을 조사하는 것은 불가능했었다. 또한 연어의 코연골 유래의 복합당질 프로테오글리칸의 단리는, 본 출원인 등이 상술한 특허출원에 의한 방법을 사용할 때까지는 행해진 적이 없고, 또한 전혀 이용되지도 않았었다. 그러나, 본 발명에 의해, 우수한 작용을 갖는 프로테오글리칸을 안전한 방법으로, 또한 적은 비용으로 대량으로 정제할 수 있게 되었기 때문에, 프로테오글리칸에 대한 요구는 더욱 높아져, 그 사용범위도 넓어질 것으로 기대된다.

또한, 지금까지 연어의 머리부분으로부터 고형 지방분을 제거하기 위해 사용되었던 클로로포름-메탄올, 아세톤 등의 유기용제도 사용하지 않기 때문에, 그 폐액처리도 불필요해져, 환경오염의 문제도 생기지 않게 되었다. 그리고, 본 발명의 정제방법은, 간편하고 또한 효율적이며, 게다가 그 공정에 의해 얻어진 프로테오글리칸은, 안전성이 높아, 경구적으로 섭취 가능하여, 화장품, 의약부외품 뿐 아니라, 의약품, 의료재료, 가공식품, 건강보조식품, 인공장기 등 지극히 광범위한 분야에서 새로운 응용제품의 개발이 가능해져, 인류의 건강, 의학분야에서 커다란 공헌이 가능해진다.

Claims

조 프로테오글리칸(proteoglycan)의 용출용매에 초산을 사용하는 것을 특징으로 하는 프로테오글리칸의 정제방법.
조 프로테오글리칸의 용출용매에 초산을 사용하여, 얻어진 용출액을 여과후 원심분리하고, 상등액에 식염포화 에탄올을 가하여 재차 원심분리하여 조 프로테오글리칸을 농축시킨 것을 특징으로 하는 프로테오글리칸의 정제방법.
조 프로테오글리칸의 용출용매에 초산을 사용하여, 얻어진 용출액을 여과후 원심분리하고, 상등액에 식염포화 에탄올을 가하여 원심분리함으로써 얻어진 조 프로테오글리칸을 포함하는 반고형 침전물을 초산에 용해하고, 이어서 투석함으로써, 조 프로테오글리칸의 순도를 더욱 향상시키는 것을 특징으로 한 프로테오글리칸의 정제방법.