KR0170064B1

KR0170064B1 - 아카란 황산을 포함하는 달팽이 엑기스

Info

Publication number: KR0170064B1
Application number: KR1019950046690A
Authority: KR
Inventors: 김영식; 박유미; 린하르트 로버트
Original assignee: 김영식
Priority date: 1995-12-05
Filing date: 1995-12-05
Publication date: 1999-02-01
Also published as: KR970042581A

Abstract

본 발명은 자양 강장제로 사용되는 아프리카산 왕달팽이(Achatina fulica)로부터 얻은 글리코사미노글리칸의 일종인 아카란 황산(acharan sulfate)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 아프리카산 왕달팽이로부터 프로테아제 등을 이용하여 달팽이 엑기스를 만들고 이로부터 아카란 황산을 분리·정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

아카란 황산을 포함하는 달팽이 엑기스

제1도는 헤파리나제 II와 아카란 황산을 반응시킨후 모세관 전기 영동에 의한 분석 결과를 나타낸다.

(a) △UAp2S(1-4)D-GlcNpAc의 구조를 가진 표준품 이당류.

(b) 왕달팽이의 아카란 황산과 헤파리나제 II의 반응후 생성된 이당류.

(c) (a)와 (b)의 혼합물.

제2도는 헤파린, 헤파란 황산 및 아카란 황산의 일반적 구조를 나타낸다.

본 발명은 아프리카산 왕달팽이(Achatina fulica)로부터 얻은 글리코사미노글리칸의 일종인 아카란 황산(acharan sulfate)에 관한 것이다.

또한 본 발명은 아프리카산 왕달팽이로부터 아카란 황산을 분리하는 방법에 관한 것이다.

더욱 상세하게는, 본 발명은 프로테아제 등을 이용하여 아프리카산 왕달팽이로부터 아카란 황산을 분리하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 아프리카산 왕달팽이로부터 분리된 아카란 황산을 암모니움 염을 이용한 복합체를 만들어 정제하는 방법에 관한 것이다.

아프리카산 왕달팽이(Achatina fulica)는 세계 도처에 분포되어 고급 식품원료로서 사용되어 왔고 강정 또는 강장식품으로 널리 애용되어 왔다. 이러한 왕달팽이에는 특히 글리코사미노글리칸이 풍부히 존재하는 것으로 알려져 있다.

글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan, 이하 GAG라고 약칭함)는 생합성과정에서 부분적인 변화를 통해 구조적으로 다양하고 복잡한 형태를 지니게 된다. GAG류의 기본적인 골격은 우론산과 글루코사민의 반복이면서 부분적으로 셀페이트화가 이루어져 있으며, 이러한 복잡한 화학 구조에 의해 여러 종류의 생물 활성을 나타낼 수 있게 된다. 현재까지 알려진 바에 의하면, 이러한 다양한 생물활성은 고유의 특정 서열이 존재함에 기인한 것으로 보인다.

동물류의 GAG류는 히얄우론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfate), 케라틴 황산(keratin sulfate), 헤파란 황산(heparan sulfate), 헤파린(heparin) 등이 알려져 있다. 이들 GAG류는 헤파린 이외에는 주로 연결조직에 분포하고 헤파린은 간, 허파, 피부 점막내의 동맥을 따라서 있는 마스트(mast) 세포내의 과립에 존재한다. 의약품으로 사용되는 콘드로이틴 황산은 상어의 척추 연골 및 소의 기관지에서 얻어지고 있다. 또한 하등 동물인 연체동물에도 GAG류가 발견되고 있는데, 그 예로서, 조개류에서 3-o-설페이트기를 가지면서 안티트롬빈 결합부위가 있는 GAG류의 존재가 보고되었고[Pejler 등, J. Biol. Chem. (1986) 262, 11413-11421], 해삼, 성게류에서도 설페이트기가 치환된 콘드로이틴 황산류가 발견되었다[Mourao 등, TIGG(1995) 7, 235-246]. 그리고 오징어의 각막에서도 콘드로이틴 황산이 존재함이 알려졌다[Karamanos 등, Int. J. Biochem. (1991) 23, 67-72].

GAG류는 생체내에서 프로테오글리칸(Proteoglycan)의 형태로 존재하며 이러한 프로테오글리칸은 프로테아제와 글리코시다제에 의해 분해되어 당부분이 유리된다. GAG류의 생리적 역할에 대해서 아직까지 많이 밝혀져 있지 않으나 생체내의 단백질들과 결합하여 생리활성을 나타내는 것으로 보인다. 생체내에서 GAG류와 결합하는 단백질은 프로테아제 저해제, 혈장의 리포단백질(lipoproteins), 성장인자, 지질분해효소, 외피세포결합제(extracelluar matrix) 단백질 등 크게 5가지로 나눌 수 있다. 이들 단백질은 GAG류와 결합하여 각각 특이한 생리 활성에 작용한다. 첫째, GAG류는 프로테아제 저해제와 결합하며, GAG류와 결합하는 대표적인 프로테아제 저해제로는 안티트롬빈 III(antithrombin III)와 헤파린 코팩터 II(heparin cofactor II)가 있다. 헤파린은 안티트롬빈 III와 결합하여 혈액인자 Xa와 트롬빈의 작용을 억제하고, 헤파린 코팩터 II와 결합하여 트롬빈의 작용을 저해하여 혈액 응고를 막는다. 둘째, GAG류는 혈장의 리포단백질과 결합하며, GAG류와 결합하는 대표적인 혈장 리포단백질에는 아포지단백질 E와 아포지단백질 B가 있다. 혈장 리포단백질과 결합하는 GAG류에는 헤파린과 콘드로이틴이 있으며, 헤파린과 콘드로이틴은 아포지단백질 E와 아포지단백질 B의 산성 및 염기성 아미노산이 몰려 있는 부위와 상호작용을 하여 동맥경화 발생을 조절한다. 셋째, GAG류는 성장인자와 결합한다. GAG류와 결합하는 성장인자에는 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 있으며, 성장인자와 결합하는 GAG류에는 헤파린(HE)과 헤파란 황산(HS)이 있다. HE와 HS는 bFGF와 결합하여 bFGF가 분해되는 것을 방지함으로써 세포성장 및 분화에 중요한 역할을 한다. 넷째, GAG류는 지질분해효소와 결합한다. 헤파린과 헤파린 황산을 정맥으로 주사하면 지질분해효소인 저밀도 지단백질(low density lipoprotein) 분해효소와 중성지방 분해효소를 혈장세포내로 유리시킨다. 헤파린이 지질분해효소와 결합에 필요한 특징은 알려져 있지 않으나 유리된 지지분해효소가 혈중의 지방을 분해시키기 때문에 동맥경화 예방에 큰 역할을 할 수 있다. 다섯째, GAG류는 외피세포결합체와 결합한다. GAG류와 상호작용을 하는 외피세포결합체의 단백질로는 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 라미닌(laminin), 트롬보스폰딘(thrombospondin)이 있다. 이들 GAG류와 결합하는 단백질은 세포 부착, 세포간의 정보 전달, 세포 분화, 세포 성장 등에 중요한 역할을 한다.

특히 왕달팽이에는 글리코사미노글리칸이 풍부히 존재하는 것으로 알려져 있었으나, 정확한 구조에 대해서는 밝혀져 있지 않았다. 이에 왕달팽이로부터 새로운 GAG류의 유도체를 만들고 그의 생물학적 활성을 밝히기 위해서는 정제 방법의 확립과 구조 결정의 필요성이 요구되고 있다. 따라서 본 발명은 강정 또는 강장식품으로 널리 이용되고 있는 아프리카산 왕달팽이(Achatina fulica)로부터 GAG류의 일종인 아카란 황산(acharan sulfate)을 풍부히 포함하고 있는 달팽이 엑기스를 제조하고 그 달팽이 엑기스로부터 아카란 황산을 분리·정제하고 그 특성을 밝힘을 목적으로 한다.

본 발명을 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다.

아프리카산 왕달팽이으로부터 다음과 같은 방법으로 달팽이 엑기스를 제조하고 그 달팽이의 엑기스로부터 아카란 황산(acharan sulfate)을 분리·정제한다.

식용 달팽이를 외부 골격과 분리시킨 후 아세톤, 헥산, 톨루엔 등의 유기용매로 처리하여 지방을 제거한다. 필요에 따라서 근육질, 내장, 점액질로 조직을 분류하여 각각 같은 처리를 행할 수 있다. 건조시켜 딱딱하게된 조직을 분쇄기를 이용하여 잘게 부수고 체를 통과시켜 일정한 크기의 분말을 얻는다. 분말을 pH 8.0-9.0범위를 유지할 수 있는 완충용액 또는 1-5N NaOH 용액에서 현탁시킨다. pH를 약알칼리로 유지시킨 완충용액을 사용한 이유는 단백질을 제거하기 위해 사용되는 프로테아제인 알칼라제의 최적 pH가 약알칼리이기 때문이다.

단백질을 제거하는 방법에는 NaOH를 사용하는 방법과 프로테아제를 사용하는 방법이 있다.

프로테아제인 알칼라제는 Bacillus licheniformis로부터 생산되며 모든 종류의 단백질을 분해시킬 수 있는 프로테아제로서 활성도는 0.6AU/g이다. 주효소는 섭틸리진(subtilisin) A로 엔도프로테아제의 일종이다. 최적 반응온도는 기질에 따라서 50-70℃이고 최적 pH는 6.5-9.0이다. 반응시간은 24시간에서 48시간 정도에서 대부분의 단백질이 소화된다. 알칼라제 이외에도 프로테아제로 파파인 프로테아제를 사용할 수 있으나, 경제성면에서도 알칼라제가 가장 유리하다.

NaOH 용액이 단백질을 제거시킬 수 있기 때문에 프로테아제를 사용하지 않을 수 있으나, 강알칼리 용액이기 때문에 강염산을 이용하여 중화시켜야 한다. 프로테아제를 사용하는 경우 중화시킬 필요가 없고 효소반응 후 상등액에 1mM의 염화칼슘 용액과 5% 트리클로로아세트산(TCA)을 처리하여 남아 있는 단백질 및 헥산을 침전시킨다. 염화칼슘 용액은 다당류와 칼슘염을 만들어 다당류를 안정화시킬 수 있다. 침전물을 5000g에서 원심분리한 후 고분자 탄수화물이 녹아 있는 상등액에 3배의 에탄올을 넣어 4℃에서 하룻밤 방치시킨 후 5000g에서 원심분리시켜 침전물을 다시 모은다. 에탄올에 대한 용해도 차에 의해서 분획을 할 수 있다. 침전물을 무수 에탄올로 씻어서 감압하에 건조시킨 후 분말로 만든다. 분말 성분중에 포함되어 있는 산성당을 정제하기 위하여 삼급 및 사급 암모니움염을 이용하여 정제할 수 있다. 사급 암모니움염으로는 세틸피리디움 클로라이드(세타블론, cetylpyridinium chloride)나 트리메틸아민 클로라이드(trimethylamine chloride)가 이용될 수 있다. 암모니움 염과 침전시켜 침전물을 강염으로 용해시키고 이것을 에탄올에 의해서 재침전시킬 경우 정제된 글리코사미노글리칸을 얻을 수 있다.

달팽이로부터 얻어진 글리코사미노글리칸의 구조를 규명하기 위하여 고자장 핵자기 공명과 콘드로이티나제 A, B, C, 헤파리나제 I, II, III를 이용하고, 또한 헤파리나제 II를 이용하여 얻어진 이당류를 모세관 전기영동에 의해서 글리코사미노글리칸 표준품과 비교할 때 분리 시간이 일치하고 또한 얻어진 이당류에 대해 표준품의 이당류와 함께 핵자기 공명을 이용하여 분석을 할 때 정확히 일치한다(제1도 참조). 유론산 정량은 카바졸(carbazole)을 이용한 방법[Bitter, T. and Muir, H.M. Analytical Biochemistry (1962) 4, 330]에 의해서, 헥소사민은 2,4-펜타디온(2,4-pentadione)의 알칼리용액과 반응후 p-디메틸아미노벤즈알데히드와 반응시켜 발색되는 양을 정량하여 얻는다[Ludonweig, J and Benmanan, J.D., Carbohydr. Res., (1968), 8, 185].

식용 달팽이의 학명이 Achatina fulica이기 때문에 이로부터 얻어진 GAG류의 이름을 아카란 황산(acharan sulfate)이라 명명하였으며 아카란 황산의 구조는 제2도에 표시된 바와 같이,

→4)-2-acety1,2-deoxy-α-D-glucopyranose(1→4)-2-sulfo-α-

L-idopyranosyl uronic acid(1→

구조의 반복적인 이당류로 되어 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

I. 달팽이 엑기스의 제조

[실시예 1]

식용 달팽이 육질을 뮤게에 대한 용량비로 5배의 부피의 아세톤을 이용하여 48시간 방치한 후, 지방을 제거하고 일정한 크기로 분쇄하였다. 식용 달팽이 분말 4g을 1.0N의 NaOH 용액 80ml에 침적시켜 25℃에서 24시간 배양한 후 미제거 단백질의 분해를 위해 알칼라제 25.ml를 첨가하여 60℃에서 24시간 200rpm의 교반 반응조에서 소화시켰다.

발효가 종결되면 1mM의 염화칼슘 용액과 TCA를 가하여 4℃에서 10분간 방치 후 원심분리하여 상등액을 취한 후 상등액에 대한 3배 부피의 에탄올에 5% 아세트산 칼륨(potassium acetate)을 첨가하여 4℃에서 1일간 방치하였다. 그 후 침전물을 얻어 2-5ml의 에탄올로 침전물을 씻은 다음 다시 감압하에 건조시켜 조GAG류 0.28g(수율 7.0%)를 모았다.

[실시예 2]

식용 달팽이 건조분말 4g을 2.5N NaOH 완충용액 40ml에 침적시켜 실시예 1과 동일한 방법으로 추출하여 달팽이 조GAG류 0.25g(수율 6.25%)를 얻었다.

[실시예 3]

식용 달팽이 건조분말 4g을 5N의 NaOH 완충용액 40ml에 침적시켜 실시예 1과 동일 방법으로 추출하여 달팽이 조GAG류 0.23g(수율 5.8%)을 얻었다.

[실시예 4]

달팽이로부터 분리하여 탈지와 건조를 거친 근육질, 내장, 점액 각 2g씩을 0.05M 트리스염산 완충용액(Tris-HCl, pH 7.5) 20ml씩에 현탁시켜 알칼라제 2ml씩을 넣어 48시간 반응시켰다. 실시예 1과 같은 방법으로 처리하여 근육으로부터 400mg(수율 20%), 내장으로부터 40mg(수율 1%), 점액으로부터 100mg(수율 5%)의 조GAG류를 얻었다.

[실시예 5]

식용 달팽이 건조분말 5g을 0.05M 탄산나트륨 완충용액(sodium carbonate, pH 9.0) 50ml 용액에 프로테아제 2.5ml를 첨가하여 60℃에서 48시간 동안 200rpm으로 교반하면서 효소반응에 의해 분해시킨 후 1mM 염화칼슘과 5% TCA를 가하여 4℃에서 10분간 방치하였다. 방치한 후 원심분리에 의해 상등액만 취하였다. 상등액에 3배의 에탄올과 5% 아세트산 칼륨(potassium acetate)을 첨가하여 4℃에서 24시간 방치한 후 침전물을 얻었다. 침전물을 무수에탄올 2-5ml로 1회 씻고 온도 20-25℃에서 10mmHg하에서 건조하여 조GAG류 760mg(수율 13.2%)를 얻었다.

[실시예 6]

식용 달팽이 분말 5g을 0.05M 탄산나트륨 완충용액(sodium carbonate buffer, pH 9.0) 50ml 용액에 프로테아제 1.0ml를 첨가하여 60℃에서 48시간동안 200rpm으로 교반하면서 발효시킨 후 1mM 염화칼슘과 5% TCA를 가하여 4℃에서 10분간 방치하였다. 방치한 후 셀라이트(celite)를 이용한 여과를 거쳐 상등액만 취하였다. 상등액에 대해 3배 부피의 에탄올과 1% 아세트산 칼륨(potassium acetate)을 첨가하여 4℃에서 24시간 방치한 후 침전물을 얻었다. 침전물을 무수 에탄올 2-5ml로 1회 씻고 온도 20-25℃에서 10mmHg하에서 건조하여 조GAG류 762mg(수율 13.8%)를 얻었다.

II. 아카란 황산의 정제 및 확인

[실시예 7]

실시예 6에서 얻은 조GAG류(1g)을 20ml의 0.2M 염화나트륨에 녹여 5000g에서 원심분리한 다음 상등액에 5% 세틸피리디니움 클로라이드 4ml를 가하여 1시간 동안 상온에 놓아두었다. 침전물 복합체를 원심 분리하여 5ml의 2.5N 염화나트륨 용액으로 녹여 다시 5배의 알콜로 침전시켜 원심분리하여 모았다. 정제한 GAG류를 다시 5ml의 물에 녹여 투석을 시킨후 동결건조시켜서 비교적 정제된 GAG류를 모았다. 이러한 GAG류를 10mg/ml의 용액으로 만들어 카바졸(carbazole) 시약을 이용한 우론산 정량에 의해서 GAG류의 존재를 확인하였다.

[실시예 8]

실시예 7에서 정제한 GAG류에 대해서 10mg을 D₂O에 세 번 치환시킨 다음 동결건조시키고 데시케이타내에서 P₂O₅와 함께 건조시켜 마지막으로 99.96%의 D₂O에 다시 처리하고 동결 데시케이타내에서 P₂O₅와 함께 건조시켰다. 이를 99.96%의 D₂O에 녹여서 500MHz 핵자기공명(NMR)을 수행하였다. NMR은 Varian사 제품으로 VXR 5000콤퓨터시스템이 달린 500MHz UNITY-500 스펙트로미터를 사용해서 행하였다.

핵자기공명후 두 개의 아노머(anomer) 수소의 케미칼 시프트에서 GlcNAcα1-은 5.1ppm이고 IdoAp2Sα1-은 5.2ppm으로 확인되었다. 표 1에서 케미칼 시프트 결과가 표시되었다.

[실시예 9]

아카란 황산과 헤파리나제(heparin lyase) I, II, III를 반응시켜 모세관 전기영동에 의해서 분석하였다. 반응 조건은 아카란 황산 1mg, 헤파리나제 I(또는 헤파리나제 II, 헤파리나제 III, 각 10mU) 50μl, 50mM 트리스염산 완충용액/NaCl(pH 7.4)을 가하여 전체 용액을 1ml로 조정하였고 반응 온도는 37℃로 하였다. 모세관 전기영동은 미국 Dionex사 제품의 자외선 검출기가 부착된 것으로 역상모드로 작동하면서 시료를 음극에 주입시킨 후 20mM 트리스염산 완충용액(pH 3.5, 1M 염화나트륨으로 pH 조정)을 흘려주면서 18,000V에서 행해졌다.

헤파리나제 I과 III의 경우 아카란 황산과 반응이 전혀 또는 거의 이루어지지 않으나, 헤파리나제 II는 아카란 황산을 완전히 분해시켜 이당류를 생성하였다. 헤파리나제 II와 반응시켰을 때 모세관 전기영동에 의해서 얻어진 결과는 단일 피크이고(제1도 참조), 이것은 △UAp2S(1-4)D-GlcNpAc의 표준품의 결과와 일치하였다. 또한 생성된 이당류를 표준품과 함께H-NMR을 행하였을 때 정확하게 일치하게 나타났다.

[실시예 10]

아카란 황산의 성분 분석을 위하여, 이를 PO하에서 완전히 건조시킨 후 메타놀리시스(methanolysis)를 통하여 분해시켰다. 24시간 동안 80℃에서 메타놀리시스를 시킨 후 0.15ml 피리딘(pyridine)을 가하여 중화시켰다. 재아세틸화는 0.1ml 아세트 무수물(acetic anhydride)를 가한 후 1시간 동안 실온에서 방치한 후 35℃에서 질소가스하에서 피리딘(pyriine)을 제거하였다. 시료를 PO하에서 진공 펌프로 완전히 건조시킨 후 50μl의 피리딘/N,O-비스(트리메틸시릴)트리플로로아세트아마이드[pyridine/N,O-bis-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide](1:2, v/v)를 가하여 30분 동안 실온에서 방치시켜 시릴(silyl)화를 시켰다. 시릴화가 이루어진 시료를 가스크로마토그라프에서 분석을 하였다. 칼럼은 미국 Altech사 제품의 AT-1 모세관 칼럼으로 규격은 0.53mm×30m(1.5㎛ 굵기)로 주입부의 온도는 270℃, 검출기의 온도는 280℃를 각각 유지하였다. 칼럼의 온도는 120℃에서 260℃로 1분당 10℃씩 증가되도록 프로그램되었다.

가스크로마토그라프에 의해서 얻어진 단당류의 조성에서 47% 이듀론산, 3% 글루쿠론산, 50% N-아세틸글루코사민이 얻어졌다. 이러한 결과를 종합할 때 아카란 황산의 구조는 제2도와 같이,

→4)-2-acety1,2-deoxy-α-D-glucopyranose(1→4)-2-sulfo-α

-L-idopyranosyluronic acid(1→

로 명명되었다.

III. 아카란 황산의 특성

[실시예 11]

아카란 황산이 혈액인자 Xa와 혈액인자 IXa의 응고시간에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 아카란 황산 10μl을 혈액인자 Xa-결핍 혈장 또는 혈액인자 IXa-결핍 혈장 90μl에 넣어 37℃에서 1분간 반응시켰다. 혈액인자 Xa의 응고시간 측정에는 소의 혈액인자 Xa, 100μl이 위의 혼합물에 가해지고 혈액인자 IXa의 경우는 소의 혈액인자 IXaβ, 100μl를 가한다. 37℃에서 반응시킨 후 100μl의 0.025M CaCl이 포함된 Platelin(Organon Teknika사 제품)를 가하여 응고를 유발시킨다. 적어도 3가지 이상의 아카란 황산 농도로 기준(control) 용액의 응고시간을 2배로 하는 농도를 구한다. 여러 종류의 글리코사미노글리칸을 사용한 결과와 아카란 황산의 결과를 비교했을 때 본 발명의 아카란 황산이 동일한 영향을 나타냄을 알 수 있었다.

[실시예 12]

항 트롬빈 활성은 S-2238(Kabi Vitrum사 제품, Stockholm)로 측정되어진다. 100μl의 안티트롬빈 III(0.2units/ml, Sigma사 제품)과 여러 가지 농도의 아카란 황산을 37℃에서 3분간 반응시킨 후 100μl의 소의 트롬빈(10NIHU/ml, Sigma사 제품)을 가하고 1분간 반응시킨 후 남아있는 트롬빈의 활성을 300μl의 S-2238 용액(0.5mM)을 가하여 측정한다. 반응은 300μl의 50%(v/v) 아세트산을 가하여 멈추게 하고 그 흡광도를 405nm에서 측정하였다. 항 혈액인자 Xa 활성은 Testzym 헤파린 키트(Daiichi Pure Chemicals Co.사 제품)를 사용하여 측정하였다.

여러 종류의 글리코사미노글리칸을 사용하여 실험한 결과와 본 발명의 아카란 황산의 흡광도 실험결과를 비교했을 때 아카란 황산이 동일한 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

본 발명의 아카란 황산은 지금까지 알려진 GAG류의 효능과 동일 유사한 효과를 나타낸다. GAG류가 약물로 쓰이는 예로서, 콘드로이틴 황산은 점안제, 관절염치료제, 최근에 들어서 강장드링크류 등에도 사용된다. 또한 히얄우론산은 화장품의 첨가물로 많이 쓰이고 있다. 또한 임상에서 글리칸 의약품으로서 널리 사용되는 것은 헤파린으로, 약간의 부작용도 있지만 항응고제로 혈전 치료제, 수술후, 신장투석, 인공혈관 등에 광범위하게 사용되고 있다. 최근에 들어서는 부작용을 낮춘 저분자량의 헤파린이 같은 목적으로 사용되고 있으며 또한 더마탄 황산(dermatan sulfate)이 항혈전제로 임상 실험중에 있다. 다라서 본 발명의 아카란 황산도 위와 같이 여러 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 아카란 황산은 지금까지 알려진 GAG류의 효능과 동일 유사한 효과를 나타낸다. GAG류가 약물로 쓰이는 예로서, 콘드로이틴 황산은 점안제, 관절염치료제, 최근에 들어서 강장드링크류 등에도 사용된다. 또한 히얄우론산은 화장품의 첨가물로 많이 쓰이고 있다. 또한 임상에서 글리칸 의약품으로서 널리 사용되는 것은 헤파린으로, 약간의 부작용도 있지만 항응고제로 혈전 치료제, 수술후, 신장투석, 인공혈관 등에 광범위하게 사용되고 있다. 최근에 들어서는 부작용을 낮춘 저분자량의 헤파린이 같은 목적으로 사용되고 있으며 또한 더마탄 황산(dermatan sulfate)이 항혈전제로 임상 실험중에 있다. 따라서 본 발명의 아카란 황산도 위와 같이 여러 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 아카란 황산은 위에서 언급된 생물활성을 포함해서, 구조적으로 변형시켰을 때(예, 탈아세틸화, 황산화, 새로운 올리고 GAG류화) 부작용이 작은 항응고제로 사용되며, 황산화된 올리고 당이 섬유아세포 성장인자와의 결합에 필요한 구조적 특징을 제공하므로 세포 성장 및 분화와 관련된 중요한 역할에도 관여한다. 또한, 반복적인 이당류의 단순한 구조를 지니고 있기 때문에 설페이트기 전이효소를 이용한 반응의 모델 화합물로서도 이상적이다.

또한 건강 식품으로서 이용되고 있는 달팽이로부터 유래된 것이기 때문에 골다공증을 포함하여 간 기능효과 및 갱년기 장애에도 매우 효과적이다.

Claims

아프리카산 왕달팽이로부터 분리된 새로운 글리코사미노글리칸인 구조식(I)의 아카란 황산.

→4)-2-acety1,2-deoxy-α-D-glucopyranose(1→4)-2-sulfo-α-L

-idopyranosyluronic acid(1→

(I)
엔도프로테아제를 효소원으로 사용하여 달팽이 건조물을 분해시켜 얻는 상기 구조식(I)의 아카란 황산을 함유하는 것을 특징으로 하는 달팽이 엑기스.
제2항에 있어서, 엔도프로테아제는 섭틸리신(subtilisin)인 것을 특징으로 하는 달팽이 엑기스.
엔도프로테아제를 효소원으로 사용하여 pH 6.5-9.0의 완충용액에서 달팽이 건조물을 분해시켜 얻는 것을 특징으로 하는 달팽이 조효소 엑기스의 제조방법.
제4항에 있어서, 프로테아제 반응이 50-70℃의 온도조건에서 수행됨을 특징으로 하는 달팽이 엑기스의 제조방법.
제5항에 있어서, pH 6.5-9.0의 완충용액은 0.05N 탄산나트륨 완충용액(pH, 9.0)인 것을 특징으로 하는 달팽이 엑기스의 제조방법.
조GAG류를 암모니움염을 이용하여 침전시키고 침전물을 강염으로 용해시켜 정제하는 것을 특징으로 하는 아카란 황산의 정제방법.
제7항에 있어서, 암모니움염은 세틸피리디움 클로라이드 또는 트리메틸아민 클로라이드인 것을 특징으로 하는 아카란 황산의 정제방법.