JPS6310601A

JPS6310601A - コンドロイチン硫酸誘導体

Info

Publication number: JPS6310601A
Application number: JP61072555A
Authority: JP
Inventors: Tadahisa Hashimoto; 橋本　周久; Shiyuugo Watabe; 終五渡部; Tadashi Harada; 原田　忠; Teru Muto; 輝武藤
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1986-03-12
Filing date: 1986-04-01
Publication date: 1988-01-18
Anticipated expiration: 2009-09-07
Also published as: JPH0670085B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の技術分野］本発明は、動物由来のコンドロイチン硫酸誘導体（以下
ｒＣ３−ｄｒ」という）に関する。

［従来技術］コンドロイチン硫酸（以下ｒＣ５Ｊという）は、１８９
１年に初めて軟骨から分離され、現在では種々の結合組
織の基質成分として広く存在することが知られ、組織中
の保水を計り、これによって新陳代謝を潤滑にし、細胞
の賦活機能を果しているものと推定されている。

Ｃ５はムコ多糖と呼ばれる多糖硫酸の一つで、Ｎ−アセ
チル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸又はＬ−
イヂュロン酸がβ−グリコシド結合１．た二軸を構成単
位とする分子量ｔｏ、ｏｏｏ〜ｓｏ　、ｏｏｏの多糖類
を基本骨賂とし、Ｎ−７セチルーＤ−ガラクトサミンの
０４位又は０６位に硫酸基が結合したコンドロイチン−
４硫酸（Ｃ３−Ａタイプともいう）、コンドロイチン−
６硫酸（ＣＳ−Ｃタイプともいう）、Ｄ−グルクロン酸
の代りにＬ−イヂュロン酸がＮ−アセチル−Ｄ−ガラク
トサミンとβ−グリコシド結合し、ガラクトサミンのＣ
４位に硫酸基が結合したデルマタン硫酸（Ｃ３−Ｂタイ
プともいう）が広く知られている。これらは、何れも構
成単位当り硫黄（以下「Ｓ」という）がほぼ１モル（６
，４％）含まれている。これに対して、用台ら〔ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー（東京）　　（Ｊ、　
Ｂｉｏｃｈｅｓ、　（Ｔｏｋ７ｏ）　）　、　６０　、
３１７　。

１９６６）は、スルメイカの軟骨中に構成中位当りＳｌ
、５５モル（７，９％）を含むＣＳを見出し、Ｃ３−Ｅ
タイプと命名した。このものの構成単位は、Ｎ−アセ壬
ルーＤ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸がβ−グリ
コシド結合したもので、構成単位当りＳが２モル結合し
たものと、１モル結合ビたちのがほぼ等量より成るＣ５
と推定される。また、カッラマン（にａｔｚｓａｎ）ら
〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　１６６　、７５８
　。

１９６９）はフクロナマコ（Ｔｂｙｏｎｅ　ｂｒｉａｒ
ｅｕａ）から３１．６モル（８，２％）を含むＣＳを得
ているが、このものも、構成成分はＤ−ガラクトサミン
とＤ−グルクロン酸であり、Ｓ含量からみてＣ３−Ｅタ
イプと推定される。

このように硫酸基を含む多糖硫酸エステルは、ヘパリン
に代表されるように抗血液凝固作用（以下ｒＡＣＡ活性
」という）と、デキストラン硫酸に代表されるように血
中脂質清澄作用（以下ｒＬＣＡ活性」という）を有する
ことが知られている。Ｃ５にもこれらＡＣＡ　、ＬＣＡ
両活性は認められるが、いずれも極めて弱い０人為的に
多糖に硫酸基を導入し、Ｓ含量を高めた多糖硫酸もこれ
ら活性を有し、前記デキストラン硫酸（Ｓ含量１５〜２
０％）は高脂血症治療薬として使用されていることは衆
知である。多糖硫酸のＳ含量が高まるに従ってＡＣＡ　
、ＬＣＡ両活性とも強まるが、ＬＣＡ活性を活用した医
薬品、特に注射薬の場合、ＡＣＡ活性は出血傾向を促す
副作用としてマイナスに作用する難点があり、その使用
に当っては慎重を要する。多糖硫酸のＡＣＡ活性を活用
した医薬品（抗凝固剤）はヘパリンを除いては見当らな
い、これは、その使い方を誤ると出血をもたらし、大事
に至る恐れがあるからと思われる。

このようなことから、Ｓ含量９．５〜１３．０％の多糖
硫酸はＡＣＡ　、ＬＣＡ両活性ともデキストラン硫酸よ
りは低いが、Ｃ３−Ａ　、−Ｃよりも高い活性を有する
新規物質として期待される。

本発明者らは、天然物質中にこのような組成を有する物
質について鋭意研究を進めた結果、フクロナマコを除く
ナマコ類動物より３９．５〜１３．０％を含有するＣ３
−ｄｒを見出し、本発明を完成するに至った。

［発明の構成］本発明は、硫黄９．５〜１３．０％及びフコース１２．
０〜２８．０％を含有することを特徴とする動物由来の
Ｃ３−ｄｒに関するものである。

本発明に用いる動物としては、水産動物、特にナマコ類
動物が挙げられ、これらのうち樹子類以外の楯手類、隠
足類及び無足類のものであれば如何なるものでも用いる
ことができ、例えばマナマコ（Ｓｔｉｃｈｏｐｕａ　ｊ
ａｐｏｎｉｃｕｓ）　、りａナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒ
ｉａ　ａｔｒａ）　、　ニセクロナマコ（Ｈｏｌｏｔｈ
ｕｒｉａ　Ｉｅｕｒｏｓｐｉ１６ｔａ）　、フジナマコ
（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ　ｍｏｎａｃａｒｉａ）、オキ
ナマコ（Ｐａｒａｓｔｉｃｈｏｐｕｓ　ｎｊｇｒｉｐｕ
ｎｃｔａｔｕｓ）、シロナマコ（Ｐａｒａｃａｕｄｉｎ
ａ　ｃｈｉｌｅｎｓｉｓ　ｒａｎｓｏｎｎｅｔｉ）、オ
オイカリナマ：Ｉ　（Ｓｙｎａｐｔａ　ｍａｃｕｌａｔ
ａ）、ホソイカリナマコ（Ｌｅｐｔｏｓｙｎａｐｔａ　
１ｎｈａｅｒｅｎｓ）、ムラサキクルマナマコ（Ｐｏ１
７ｃｈｅｉｒａ　ｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、アクチノピガ
・エチニテス（Ａｃｔｉｎｏｐｙｇａ　Ｅｃｈｉｎｉｔ
ｅｓ）などが挙げられる。これらのナマコ類動物は、ご
く一部が食用に供されてはいるが、殆ど利用されていな
い未利用資源ということができる。

本発明のＣ３−ｄｒは、これら原料から常法に従って製
造することができる。即ち、原料を細挫、抽出し、プロ
テアーゼ処理、アルカリ処理後、トリクロロ酢酸処理し
て除蛋白し、透析、塩化セチルピリジニウム処理により
多糖硫酸を沈殿として分取し、目的物を溶出し、アルコ
ール沈殿を行って分画、精製して得られる。また、抽出
後、アルカリ処理し、アルコール沈殿による分画、精製
を行ってもよい。

このようにして得られたＣ３−ｄｒについてゲル濾過を
行い、カルバゾール法によってグルクロン酸を、システ
ィン・硫酸法によってフコースを調べた結果１両者は全
く同一の位置にあった。

また、セルロース・アセテート膜を支持体に、０、ＩＮ
塩酸を用いて電気泳動を行った結果、本発ｊｊｌｌのＣ
３−ｄｒは１スポツトを示し、同時に行った対照のＣ３
−Ａ　、−Ｃ及びＣ３−Ｅ　（スルメイカ軟骨由来）と
は異った易動度を示した。

本発明（Ｆ）ＣＳ−ｄｒは分子量約１５，０００〜８０
．０００で、羽渕らの方法〔ビイオキミカ・ビイオフィ
ジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉ層、　Ｂｉｏｐｈｙ。

Ａｃｔａ）、７６０，３１８．１９８３）に従って分析
、同定した結果、Ｄ−グルクロン酸（以下「ＧＡ」とい
う）、Ｄ−ガラクトサミン（以下ｒＧ　ａ　ｌ　ＮＪ　
という）、硫酸基、Ｄ−７：Ｉ−ス（以下ｒＦｕｃＪと
いう）を構成成分とすることが判った。更に、カルバゾ
ール法（アナリティカルやバイオケミストリー（Ａｎａ
ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、　。

４．３３０．１９６２）によってＧＡ１６．０〜２２．
０％、ストロミンジａ、　−（Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ）
法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト　リ
　−　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｗ、）、　　２　３
　４　　、　３　２　６　３　　。

１９５９）によってＧａＪＩＮ１３．０〜２０．０％、
酸素フラスコ燃焼・キレート滴定法（厚生省薬務局審査
第一・第二課監修、日本薬局１外医薬品成分規格、４４
７頁、昭和６０年ｌＯ月２９日■薬業時報社発行）によ
ってＳ９．５〜１３．０％、システィン・硫酸法〔ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカルｅケミストリー（Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ脂、）。

１７５．５９５．１９４８）によってＦｕｃ１２．０〜
２８．０％より成ることが判った。

この結果、ＧａＪＬＮとＧＡがほぼ等是含まれることよ
り１本発明のＣ３−ｄｒは、Ｇａ２ＮとＧＡを構成単位
とする点においては従来のＣ３−Ａ　、　−Ｃ、−Ｅタ
イプと同じ基本計略を有するが、これらよりＳ含量が多
く、且つＦｕｃを含有し、その陽も多く、全く新規のＣ
３−ｄｒである。このことは、次の表１より明らかで、
カッラマンらがフタロナマコより得たＣ５とは全く異な
るＣ３−ｄｒである。

表１本発明のＣ３−ｄｒについてＡＣＡ活性を測定したとこ
ろ、現在医薬品として使用されているＣ５に比して非常
に高い活性のあることが認められた。即ち、本発明実施
例１で得られたＣ３−ｄｒ（Ｓ＝１１．８％）と、比較
対象として濃硫酸法（特許第６９２７２　％　）によっ
て調製したコンドロイチンポリ硫酸ナトリウム（Ｓ＝１
３．０％、以下「ＣＰＳ」という）、ヘパリンナトリウ
ム（第一化学■、１０，０００国際単位／６７−８）及
びＣ５−Ｃタイプ（ナトリウム塩）（生化学工業■、Ｓ
＝６．６％）の４検体について、ウサギの血液を用い、
ブロクター（Ｐｒｏｃｔｏｒ）らの方法〔アメリカン・
ジャーナルーオブ・クリ二カルーパソロジ−（Ａｍ、　
Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈ、）　、　３６　。

２１２．１９６１）に従ってｉｎ　ｖｉｔｒｏの系で活
性部分トロンボプラスチン時間測定による抗血液凝固活
性測定を行った。即ち、生理食塩水を対照とし、対照の
凝固特開（１２，８秒）を２倍に延長するために必要な
検体量を求めた。その結果は表２に示す通りで、本発明
のＣ３−ｄｒは、ｃｐｓの約２倍、Ｃ５−Ｃタイプの４
００倍、抗血液凝固剤として汎用されているヘパリンの
約半分という高い活性を示した。

表２また、本発明のＣ３−ｄｒのＬＣＡ活性については未測
定であるが、前記ＣＰＳは高脂血症治療薬であるデキス
トラン硫酸ナトリウムと同等又はそれ以上のＬＣＡ活性
を有することが知られていることから、本発明のＣ５−
ｄｒはＣＰＳと同等又はそれ以上のＬＣＡ活性を有する
ものと推定される。

以上のことから１本発明のＣ３−ｄｒは、ヘパリンに代
る抗血液凝固剤が求められている今日、抗血液凝固剤と
して開発されるか、あるいは高脂血症治療薬、又は他の
、例えば線溶系薬剤として実用に供されるかは今後の研
究開発に待つところであるが、有用な医薬品提供の可能
性を秘めた、極めて重要な生理活性物質であるといえる
。

［発明の実施例］次に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はこれらによって限定されるものではない。

実施例　１新鮮なマナマコ（東京湾産、５ｔｉｃｈｏｐｕｓｊａｐ
ｏｎｉｃｕｓ）　１　ｋｇを、内臓を除去し、細礫、ホ
モジナイズし、水４００−を加え、アクチナーゼ（科研
製薬■製）２ｇを加え、中性で４５℃に一夜保った後、
液温を１００℃に上げ、放冷後、濾過して不溶物を除い
た０次いで、炉液に０．５Ｎになるように水酸化ナトリ
ウムを加え、４０”Ｃ！に１時間保った後、濾過し、′
ｆ液に１．３容のアルコールを加え、生じた沈殿物を分
取し、水に溶かし、再びアルコールを溢加後、沈殿分取
と、アルコール沈殿を繰返し、最後に分取した沈殿を水
に溶かして凍結乾燥してＣ３−ｄｒＯ，８１ｇを得た。

このものはＧＡ＝１８．４％、ＧａＪＩＮ＝１６．０％
、５＝１１．８％、Ｆｕｃ＝１８．０％を含み、ゲル濾
過法による測定で分子量は約４３．０００であった。ま
た、このものはセルロース・アセテート膜電気泳動で１
スポツトを示した。更に、このものを赤外分光器で測定
した結果は図に示すとおりで、Ｇａ１ＮのＮ−アセチル
基、Ｇａ１ＮのＣ−４位及びＣ−６位の硫酸基それぞれ
の吸収を示した。

実施例　２新鮮なマナマコ（能登産、　５ｔｉｃｈｏｐｕｓｊａｐ
ｏｎｉｃｕｓ）　５００　ｇを、内臓を除去し、細礫、
ホモジナイズし、クロロホルム−メタノール（１：２）
混液ｌＯ容を加え、２５℃に１時間保った後、液相を除
き、水を加えて煮沸し、アクチナーゼ（科研製薬■製）
６００ｍｇを加え、中性で５５℃に８時間保つ操作を２
回行った後、液温を１００℃に上げ、放冷後、濾過した
。！ｐ液に０．４Ｎになるように水酸化ナトリウムを加
え。

２５℃に４時間保った後、中和し、濾過し、炉液に濁り
が生じなくなるまでトリクロロ酢酸水溶液を加え、生じ
た沈殿物を除去し、透析し、内容液に渇りが生じなくな
るまで塩化セチルピリジニウム水溶液を加え、生じた沈
殿物を分取し、２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０％アルコ
ールを加え、２５℃に１時間保ち、不溶物を除いた後、
実施例１と同様にアルコール沈殿、精製、凍結乾燥を行
ってＣ５＝４ｒＯ，３５ｇを得た。コノものはＧＡ１９
．０％、Ｇａ！ＬＮ１７．２％、Ｓ１１．８％、Ｆｕｃ
１７．６％を含み、ゲル濾過法による測定で分子量は約
２４．０００であった。また、セルロース・アセテート
膜電気泳動で１スポツトを示した。

実施例　３新鮮なマナマコ（礼文島産、５ｔｉｂｈｏｐｕｓｊａｐ
ｏｎｉｃｕｓ）　ｌ　ｋｇを、実施例１と同様に内臓除
去、細礫、ホモジナイズ、プロテアーゼ処理、アルカリ
処理、アルコールによる沈殿、精製を行い、凍結乾燥し
てＣ３−ｄｒＯ，６８ｇを得た。このものはＧＡ１８．
０％、ＧａＪＩＮ１４．３％、５１０．３％、Ｆｕｃ２
２．０％を含み、分子量は約ｓｏ、ｏｏｏ、セルロース
・アセテート膜電気泳動で１スポツトを示した。

実施例　４新鮮なりロナマコ（沖縄産、　Ｈｏ１ｏｔｈｕｒｉａ　
ａｔｒａ）５００ｇを実施例２と同様に内臓除去、細礫
、ホモジナイズ、クロロホルム−メタノール処理、煮沸
、プロテアーゼ処理、アルカリ処理、トリクロロ酢酸処
理、１１！化セチルピリジニウム処理、アルコールによ
る沈殿、精製を行い、凍結乾燥してＣ３−ｄｒＯ，３０
ｇを得り、コノモのはＧＡ１７．５％、ＧａＪＩＮ１５
．６％、３１１．１％、Ｆｕｃ２３．８％を含み、分子
量は約４５．０００．セルロース・アセテート膜電気泳
動で１スポツトを示した。

実施例　５新鮮なアクチノピガ・エチニテス（Ａｃｔｉｎｏｐｙｇ
ａＥｃｈｉｒ＋１ｔｅｓ　、沖縄産）５００ｇを実施例
２と同様に内臓除去、細礫、ホモジナイズ、プロテアー
ゼ処理、アルカリ処理、塩化セチルピリジニウム処理、
アルコールによる沈殿、精製を行い、凍結乾燥してＣ３
−ｄｒＯ，２６ｇを得た。コノものはＧＡ１８．１％、
ＧａｕＮ１５．１％、８１１．３％、Ｆｕｃ１９．６％
を含み、分子量＋１約１８，５００．セルロースφアセ
テート膜電気泳動で１スポツトを示した。

実施例６〜９新鮮なオキナマコ（Ｐａｒａｓｔｉｃｈｏｐｕｓ　ｎｉ
ｇｒｉｐｕｎｃｔａｔｕｓ）、シロナマコ（Ｐａｒａｃ
ａｕｄｉｎａ　ｃｈｉｌｅｎｓｉｓ　ｒａｎｓｏｎｎｅ
ｔｉ）、オオイカリナマ：Ｉ　（Ｓｙｒ＋ａｐｔａ　ｍ
ａｃｕｌａｔａ）、ホソイカリナマコ（Ｌｅｐｔｏｓ７
ｎａｐｔａ　１ｎｈａｅｒｅｎｓ）について、それぞれ
実施例１と同様に操作してＣ３−ｄｒを得た。これらの
物性は表３の通りであった。また、いずれもセルロース
・アセテート膜電気泳動で１スポツトを示した。

表３［発明の効果］本発明によれば、抗血液凝固剤又は高脂血症治療薬とし
ての用途が期待される新規なＣ５−ｄｒを提供すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

図は、本発明のコンドロイチン硫酸誘導体の赤外吸収ス
ペクトルである。

Claims

【特許請求の範囲】

硫黄９．５〜１３．０％及びフコース１２．０〜２８．
０％を含有することを特徴とする動物由来のコンドロイ
チン硫酸誘導体。