CN115297871A - 从自体生理液体中生产增强的抗炎/抗分解代谢剂的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了一种生产自体抗炎/抗分解代谢自体组合物的方法，所述组合物可用于治疗患有结缔组织受损和/或损伤、慢性肌腱炎、慢性肌肉撕裂、慢性退化性关节病症和/或皮肤炎症性疾病的哺乳动物。该方法包括以下步骤：将从哺乳动物收集的血液输送到管中；在约20℃至约40℃的温度下，在柠檬酸钠的存在下，将血液储存至少约3.5小时；离心血液以将血液分离成上清液组分和细胞部分；和收集上清液组分。
Description
技术领域
本申请总体上涉及医学，更具体地涉及用于治疗受损和/或损伤的结缔组织(包括慢性肌腱炎(tendinosis)、慢性肌肉撕裂(腱炎(tendinitis))、软骨撕裂)、慢性退化性关节病症(如骨关节炎)和慢性炎性皮肤病(包括特应性皮炎、慢性伤口)以及美容的方法和组合物。
背景技术
骨关节炎(“OA”)是一种退化性关节疾病，其特征在于软骨损伤和滑膜炎症。分子炎症级联的变化导致软骨大分子的破坏和不可逆的形态学变化。IL-1、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、IL-6、IL-8和金属蛋白酶是主要的分解代谢和促炎分子，在骨关节炎的发病机制中起主要作用。这些细胞因子由活化的滑膜细胞、单核细胞或关节软骨本身产生，它们的分解代谢作用可以被抑制性细胞因子如IL-4、IL-10、IL-13和IL-1ra成功阻断。
类似的炎症和分解代谢途径参与慢性腱炎(tendonitis)和慢性肌肉撕裂愈合失败的发病机制。肌腱细胞由于产生水平增加的IL-1、IL-6、金属蛋白酶(MMP)和其他分解代谢分子而受到持续损伤。促炎细胞因子IL-1和TNFα也参与了慢性肌炎的发病机制。特应性皮炎(湿疹)被认为是最常见的复发性炎症性皮肤病。慢性伤口(包括糖尿病伤口)是由于循环不良、神经病变、免疫障碍和全身性疾病的并发症、年龄和反复创伤而在三个月内不愈合的伤口。所有这些疾病的特征在于通过细胞因子和丢失的细胞外基质(ECM)干扰细胞信号传导，所述细胞外基质形成真皮皮肤层的最大成分。靶向特定的炎症性和分解代谢分子途径可以对炎症性病变具有有益的治疗效果。这种效果可以通过使用治疗活性蛋白质来实现。目前，制药工业采用高成本的分子遗传技术来生产重组蛋白，如胰岛素、干扰素、凝血因子等。然而，这些产生重组蛋白的方法包括在细菌细胞中表达人类基因。翻译后蛋白质修饰(包括糖基化)的模式可能不同于人类中天然存在的模式。这可能导致产品在人体环境中的不稳定性、生物功能的降低或免疫反应的激发。此外，最终重组产品的成本非常高。
Reinecke等人的美国专利号6,713,246公开了为了制备抗炎/抗分解代谢组合物，将血液在体温下孵育24小时，以便在孵育的血液中产生足够量的抗炎/抗分解代谢因子IL-1ra用于治疗目的。先前的研究表明，在健康个体中，需要大约24小时的血液孵育时间来产生足够水平的IL-1ra和其他抗炎/抗分解代谢因子，以提供可测量的治疗益处。
需要一种用于治疗受损和/或损伤的结缔组织、慢性肌腱炎、慢性肌肉撕裂和/或慢性退化性关节病症如骨关节炎和皮肤炎症性疾病以及用于美容应用的方法，其中可以用更短的血液样品孵育或储存时间产生治疗上有用的抗炎组分/抗分解代谢组分。
发明内容
描述了一种抗炎/抗分解代谢组合物，用于治疗受损和/或损伤的结缔组织、慢性肌腱炎、慢性肌肉撕裂和/或慢性退化性关节病症如骨关节炎和皮肤炎症性疾病。还描述了制备抗炎/抗分解代谢组合物的方法。所述抗炎/抗分解代谢组合物通过收集个体的血液，将所述血液与柠檬酸钠混合以形成混合物，并将所述血液和柠檬酸钠的混合物在约20℃至约40℃的温度下孵育或储存至少约3.5小时的时间来制备。所述抗炎/抗分解代谢组合物还可以与再生组合物组合，所述再生组合物包括用于治疗受损和/或损伤的结缔组织、慢性肌腱炎、慢性肌肉撕裂和/或慢性退化性关节病症如骨关节炎和皮肤炎症性疾病以及用于美容应用的自体富血小板血浆(PRP)。当抗炎/抗分解代谢组合物与包括自体富血小板血浆(PRP)的再生组合物组合时，所得组合物是可用于治疗患有结缔组织受损和/或损伤、慢性肌腱炎、慢性肌肉撕裂、慢性退化性关节病症和/或皮肤炎症性疾病的哺乳动物和用于美容应用的自体组合物。当抗炎/抗分解代谢组合物与包括自体富血小板血浆(PRP)的再生组合物组合时，所述抗炎/抗分解代谢组合物是所得自体组合物的抗炎/抗分解代谢组分，而所述再生组合物是所得自体组合物的再生组分。
当人或其它哺乳动物的血液在孵育前与柠檬酸钠混合时，在与柠檬酸钠混合的血液在约20℃至约40℃的温度下孵育至少约3.5小时后，抗炎/抗分解代谢组合物包含增加水平的IL-1ra。此外，在混合物在约20℃至约40℃的温度下孵育至少约3.5小时后，抗炎/抗分解代谢组合物优选包含增加水平和/或治疗有效水平的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)。
根据本发明的一个方面，提供了一种生产自体抗炎/抗分解代谢自体组合物的方法，所述组合物可用于治疗患有结缔组织受损和/或损伤、慢性肌腱炎、慢性肌肉撕裂、慢性退化性关节病症和/或皮肤炎症性疾病的哺乳动物，所述方法包括以下步骤：
将哺乳动物的血液与一定量的柠檬酸钠混合形成混合物；
在约20℃至约40℃的温度下孵育混合物至少约3.5小时至约12小时；
离心孵育的混合物以将血液分离成上清液组分和细胞部分；和
收集上清液组分。
根据另一方面，提供了一种用自体抗炎/抗分解代谢组合物治疗患有结缔组织受损和/或损伤、慢性肌腱炎、慢性肌肉撕裂和/或慢性退化性关节病症和皮肤炎症性疾病的哺乳动物的方法，该方法包括以下步骤：
将哺乳动物的血液与一定量的柠檬酸钠混合形成混合物；
在约20℃至约40℃的温度下孵育混合物至少约3.5小时至约12小时；
离心孵育的混合物以将血液分离成上清液组分和细胞部分；
收集上清液组分以提供自体抗炎/抗分解代谢组合物；和
向哺乳动物施用自体抗炎/抗分解代谢组合物。
根据另一方面，提供了一种生产自体组合物的方法，该组合物可用于治疗患有结缔组织受损和/或损伤、慢性肌腱炎、慢性肌肉撕裂、慢性退化性关节病症和/或皮肤炎症性疾病的哺乳动物，该方法包括以下步骤：
制备包含IL-1ra和TIMP的自体组合物的抗炎/抗分解代谢组分，所述制备抗炎/抗分解代谢组分的步骤包括以下步骤：
将哺乳动物的血液与一定量的柠檬酸钠混合形成混合物；
在约20℃至约40℃的温度下孵育混合物至少约3.5小时至约12小时；
离心孵育的混合物以将血液分离成上清液组分和细胞部分；
收集抗炎/抗分解代谢组分的上清液组分；
制备自体组合物的再生组分，其包括以下步骤：
将哺乳动物的血液与一定量的抗凝血剂混合，该抗凝血剂优选为约4重量％的柠檬酸钠溶液；
离心血液以从中分离富血小板血浆组分；
收集富血小板血浆组分；和
将抗炎/抗分解代谢组分的上清液组分与富血小板血浆组分混合，以提供自体组合物。
根据另一方面，提供了一种治疗患有结缔组织受损和/或损伤、慢性肌腱炎、慢性肌肉撕裂和/或慢性退化性关节病症和皮肤炎症性疾病的哺乳动物的方法，该方法包括以下步骤：
制备包含IL-1ra和TIMP的自体组合物的抗炎/抗分解代谢组分，所述制备抗炎/抗分解代谢组分的步骤包括以下步骤：
将哺乳动物的血液与一定量的柠檬酸钠混合形成混合物；
在约20℃至约40℃的温度下孵育混合物至少约3.5小时至约12小时；
离心孵育的混合物以将血液分离成上清液组分和细胞部分；和
收集抗炎/抗分解代谢组分的上清液组分；
制备自体组合物的再生组分，其包括以下步骤：
将哺乳动物的血液与一定量的抗凝血剂混合，该抗凝血剂优选为约4重量％的柠檬酸钠溶液；
离心血液以从中分离富血小板血浆组分；
收集富血小板血浆组分；
将上清液组分与富血小板血浆组分混合，以提供自体组合物；和
向哺乳动物施用所述自体组合物。
附图说明
图1是以pg/ml为单位的IL-1ra浓度对时间的图，显示了在不同时间点患有骨关节炎的患者的人血清样品中IL-1ra拮抗蛋白水平的比较。
图2是以pg/ml为单位的TIMP浓度对时间的图，显示了在不同时间点患有骨关节炎的患者的人血清样品中TIMP 1和TIMP 2水平的比较。
图3是图i)显示了第一个受试患者的视觉模拟疼痛量表(VAS)的统计分析；ii)显示了根据WOMAC指数的第一个受试患者疼痛程度的分值；iii)显示了根据WOMAC指数的第一个受试患者僵硬水平的分值；和iv)显示了根据WOMAC指数的第一个受试患者日常活动能力水平的分值。提供了基线值和注射后1个月的值。
图4是图i)显示了第二个受试患者的视觉模拟疼痛量表(VAS)的统计分析；ii)显示了根据WOMAC指数的第二个受试患者疼痛程度的分值；iii)显示了根据WOMAC指数的第二个受试患者僵硬水平的分值；和iv)显示了根据WOMAC指数的第二个受试患者日常活动能力水平的分值。提供了基线值和注射后1个月的值。
图5是图i)显示了第三个受试患者的视觉模拟疼痛量表(VAS)的统计分析；ii)显示了根据WOMAC指数的第三个受试患者疼痛程度的分值；iii)显示了根据WOMAC指数的第三个受试患者僵硬水平的分值；和iv)显示了根据WOMAC指数的第三个受试患者日常活动能力水平的分值。提供了基线值和注射后1个月的值。
图6是图i)显示了第四个受试患者的视觉模拟疼痛量表(VAS)的统计分析；ii)显示了根据WOMAC指数的第四个受试患者疼痛程度的分值；iii)显示了根据WOMAC指数的第四个受试患者僵硬水平的分值；和iv)显示了根据WOMAC指数的第四个受试患者日常活动能力水平的分值。提供了基线值和注射后1个月的值。
图7是以pg/ml为单位的IL-1ra浓度对时间的图，显示了12名受试者在不同时间点的人血清样品中IL-1ra拮抗蛋白水平的比较。
图8是以pg/ml为单位的MMP9浓度对时间的图，显示了12名受试者在不同时间点的人血清样品中MMP9水平的比较。
图9是以pg/ml为单位的TNF-α浓度对时间的图，显示了12名受试者在不同时间点的人血清样品中TNF-α水平的比较。
图10是以pg/ml为单位的IL-1b浓度对时间的图，显示了12名受试者在不同时间点的人血清样品中IL-1b水平的比较。
图11a是显示22名受试患者的视觉模拟疼痛量表(VAS)的统计分析图。提供了基线值和注射后1个月的值。
图11b是显示根据WOMAC指数的22名受试患者平均疼痛程度的分值的图。提供了基线值和注射后1个月的值。
图11c是显示根据WOMAC指数的22名受试患者平均僵硬水平的分值的图。提供了基线值和注射后1个月的值。
图11d是显示根据WOMAC指数的22名受试患者日常活动能力平均水平的分值的图。提供了基线值和注射后1个月的值。
具体实施方式
本公开涉及一种用于生产自体抗炎/抗分解代谢组合物的方法，当在约20℃至约40℃的温度下在室温下储存至少约3.5小时至约6小时或更长时间时，该组合物产生足够量的用于治疗用途的IL-1ra、TIMP 1和TIMP 2。
本公开还涉及一种用于生产自体组合物的方法，所述自体组合物包括自体抗炎/抗分解代谢组合物和再生自体富血小板血浆(PRP)组合物的组合，所述再生自体富血小板血浆组合物具有富含具有抗炎/抗分解代谢、增殖、组织重塑和再生作用的生物活性蛋白的血清。关于本文所指的自体组合物，所述自体抗炎/抗分解代谢组合物是自体组合物的抗炎/抗分解代谢组分，而所述再生自体富血小板血浆(PRP)组合物是自体组合物的再生组分。
这种组合物通常包括以下治疗活性蛋白：IL-1ra、IL-4、IL-10、IL-13、PDGF、TGF-β和VEGF。
IL-1ra由单核细胞、脂肪细胞和上皮细胞分泌。已知这种蛋白质的治疗有效浓度是通过将来自健康人受试者的人单核细胞在约37℃下孵育约24小时而获得的。现已发现，对于患有骨关节炎的个体，IL-1ra和TIMP的治疗有效浓度是通过将与柠檬酸钠混合的人血在约20℃至约40℃的温度下孵育或储存约3.5小时至约6小时或更长时间来实现的。
IL-4、IL-10、IL-13、PDGF、TGFβ包含在血小板和颗粒的内容物中，并在PRP成分中输送。IL-4、IL-10、IL-13来自白细胞。PDGF由血小板产生，TGFβ由血小板和一些T细胞释放。利用上述蛋白质的再生效应，可以产生一种有效的生物活性自体产物。因此，作为再生生物因子和抗炎细胞因子和生长因子来源的新鲜制备的PRP与包含作为IL-1抑制剂来源的储存的自体血清的抗炎组分的组合提供了用于治疗退行性病症如骨关节炎、慢性肌腱炎和慢性肌肉撕裂以及皮肤炎症性疾病的强大且经济的自体治疗剂。
如本文所用，“治疗”包括姑息治疗，其中受试者的疼痛和/或炎症减轻。
本文使用的程度术语，例如“基本上”、“大约”和“近似”，是指被修饰术语的合理偏离量，使得最终结果不会显著改变。这些程度术语应该被解释为包括被修饰术语的至少±5％的偏差，如果这种偏差不会否定它所修饰的词的含义。
所述制备用于治疗骨关节炎、慢性肌腱炎和慢性肌肉撕裂以及皮肤炎症性疾病的自体组合物的方法优选包括通过无菌技术收集哺乳动物自体生理液体(优选血液)的步骤。优选地，哺乳动物是人。然而，本文的组合物和方法也适用于广泛的兽医应用，例如用于治疗马、狗和骆驼。
静脉穿刺部位和采集管表面可以用2％的碘酒溶液清洗。在开始对该部位进行任何清洗之前，可能会询问患者是否对碘酒过敏。或者，静脉穿刺部位和采集管表面可以用2％葡萄糖酸氯己定的70％异丙醇溶液清洗。管盖用70％酒精溶液清洗，也是为了避免采血前可能的污染。
所述自体抗炎/抗分解代谢组合物优选通过在优选约20℃的室温下孵育或储存与柠檬酸钠混合的来自哺乳动物(优选人)的自体生理液体(优选血液)来制备。然而，与柠檬酸钠混合的血液可以在约20℃至约40℃的温度下孵育或储存，具有可接受的结果。
与柠檬酸钠混合的血液优选在约20℃下孵育或储存约3.5小时至约12小时，用于IL-1ra细胞外富集，优选用于产生TIMP。与柠檬酸钠混合的血液最优选在约20℃下孵育或储存约3.5小时至约6小时。然而，如上所述，与柠檬酸钠混合的血液可以在约20℃至约40℃的温度下储存超过12小时，具有可接受的结果。
优选将治疗有效量的柠檬酸钠形式的柠檬酸盐加入到无菌玻璃管或聚苯乙烯管中，在孵育前将血液收集到该管中。所提供的柠檬酸钠优选为4重量％的柠檬酸钠溶液。可接受的4重量％柠檬酸钠溶液的一个例子是由Baxter Corporation提供的抗凝血柠檬酸钠溶液USP，基于由加拿大卫生部颁发的DIN 00060313，每100ml溶液含有4g柠檬酸钠二水合物。在一个特别优选的实施方案中，孵育可以在没有添加剂的无菌玻璃管(Coviden)或聚苯乙烯(BD)真空采血管中进行。在一个实施方案中，进一步提供了在摇床平台(24rpm)上或在静态条件下孵育自体生理液体，优选血液。优选在静态条件下进行孵育。
优选地，血液的储存在0.64-0.72mM Ca++存在下进行，以促进IL-1ra的产生。在一个特别优选的实施方案中，通过在孵育前使用无菌注射器和针头将含有0.64-0.72mM Ca++的无菌氯化钙溶液直接加入到装有血液的管中，用所述溶液以9:1的比例稀释培养的血液(1cc氯化钙溶液对9cc全血)是可能的和有利的。可以将等量的无菌空气加入到含有血液的无菌管中，以将培养物暴露于大气中，从而增加IL-1ra的产量。在一个特别优选的实施方案中，在孵育之前，使用无菌注射器和针头，空气通过0.22μm MillexGP过滤器直接进入装有血液的管中。
在孵育之前，优选以9.5份全血(9.5cc):0.5份4重量％柠檬酸钠溶液(0.5cc)的比例将浓度为4重量％柠檬酸钠的柠檬酸钠溶液与血液混合。
然后对血液和柠檬酸钠的孵育混合物进行离心，以从细胞部分中分离出上清液组分。上清液组分是所得的自体抗炎/抗分解代谢组合物。离心根据本领域已知的方法进行。优选地，离心在约4000-10000rpm下进行约10-20分钟。最优选地，离心在4000rpm下进行10分钟。
离心后，上清液优选通过0.25μm过滤器过滤。
上清液可以立即与再生自体富血小板血浆(PRP)组合物结合，或者可以任选地分成等分试样，用于将来使用无菌技术的处理。该程序在无菌环境下进行(带HEPA过滤器的层流罩)。优选地，用无菌注射器和针头小心抽取约3cc含有生物活性剂的上清液。可通过在约-20℃下冷冻等分试样并在约-70℃下储存长达18个月来实现含IL-1ra产品的长期储存。
再生自体富血小板血浆(PRP)组合物的制备包括将血液抽取到真空采血管中。然后根据本领域已知的方法将血液与抗凝血剂混合。本发明优选的抗凝血剂是柠檬酸钠。最优选地，抗凝血剂是4重量％的柠檬酸钠溶液。优选地，抗凝血剂以9.5份全血(9.5cc):0.5份4重量％柠檬酸钠(0.5cc)的比例提供。本领域技术人员将会理解，在制备再生自体富血小板血浆(PRP)组合物时，其它抗凝血剂如酸性柠檬酸葡萄糖溶液和肝素可用作抗凝血剂。
然后根据本领域已知的方法对血液进行离心，优选以约7500rpm离心约30秒，以分离PRP部分。作为离心步骤的产物获得的PRP部分是自体PRP组合物。在优选实施方案中，离心参数用于PRP制备，作为用于骨关节炎和慢性肌腱炎治疗和皮肤病的最终产品的一部分。在无菌条件下，通过无菌注射器和针头抽取自体PRP组合物。在治疗慢性撕裂的一个特别优选的实施方案中，将白细胞血沉棕黄层部分加入到自体PRP组合物中作为额外的VEGF来源，以促进受影响部位新血管的发育。血沉棕黄层和血浆在如上所述的全血离心后通过无菌注射器和针头手动收集，或者使用市售的Harvest SmartPrep系统收集。
任选地，通过小孔过滤器过滤来自注射器的自体PRP组合物来活化自体PRP组合物，所述小孔过滤器优选为约0.25μm过滤器，最优选为0.22μm MillexGP过滤器。
通过将抗炎/抗分解代谢组合物与富血小板血浆组合物混合以提供自体组合物，制备由抗炎和再生(活化的PRP)组合物的50/50组合组成的最终产品。
以上公开内容总体上描述了本申请。通过参考下面的具体实施例可以获得更完整的理解。描述这些实施例仅仅是为了说明的目的，而不是为了限制本申请的范围。形式上的改变和等同物的替换被认为是环境可能暗示的或变通的。尽管本文使用了特定的术语，但是这些术语是描述性的，而不是限制性的。
以下非限制性实施例是对本发明的说明：
实施例
实施例1
图1显示了在诊断为双侧膝骨关节炎的三名人类患者的血液中显著产生IL-1ra，其中从患者抽取血液并在柠檬酸钠存在下在约20℃的室温下储存3.5小时或6小时。图1中显示的数据是基于三名患者的平均结果，其细节提供如下。
图2显示了在诊断为双侧膝骨关节炎的三名患者的血液中显著产生TIMP 1和TIMP2，其中血液在柠檬酸钠存在下在约20℃的室温下储存3.5小时或6小时。图2中显示的数据是基于三名患者的平均结果，其细节提供如下。
结果表明，在诊断为双侧膝骨关节炎的三名人类患者的血液中显著产生IL-1ra、TIMP 1和TIMP 2，其中血液在约20℃的室温下在柠檬酸钠存在下储存3.5小时或6小时。这是一个意想不到的结果，因为以前没有证明在没有柠檬酸钠存在下储存的血液在孵育3.5小时或6小时后产生显著水平的IL-1Ra、TIMP 1和TIMP 2。
图1和图2中所示的数据是从以下实施例2的案例1、2和3的患者中获得的。
实施例2
每个患者都是被诊断患有双侧膝骨关节炎的个体。对于每个患者，血液被收集在单独的含有柠檬酸钠的玻璃管和塑料管中。每个玻璃管含有约9.5份全血(9.5cc)和0.5份4重量％的柠檬酸钠溶液(0.5cc)。
将装有患者血液的玻璃管在约20℃下储存3.5小时或6小时。然后测量患者血液中IL-1ra、TIMP 1和TIMP 2的水平。上述三名患者的结果如图1和图2所示。
然后将玻璃管以4,000rpm离心10分钟以分离抗炎组分。离心后，通过0.25μm过滤器过滤抗炎组分。
塑料管中收集的血液用于制备再生PRP组分。塑料管立即以约7500rpm离心，并将再生组分收集到无菌注射器中。然后过滤来自注射器的再生组分，并从而通过穿过0.25μm过滤器而活化。然后将再生组分立即与在约20℃下储存了3.5小时或6小时的抗炎组分组合。
获得最终的自体组合物，其包含抗炎和再生(活化的PRP)组分的50/50组合。在每个案例中，将自体组合物施用于患者。
用西安大略和麦克马斯特大学关节炎指数(WOMAC)问卷对每位患者进行评估，以评估髋和/或膝骨关节炎患者的疼痛、僵硬和身体功能。如图3-图6所示，注射后一个月对WOMAC问卷数据的初步分析显示，每个患者的疼痛、僵硬和日常活动都有统计学上的显著改善。视觉模拟疼痛量表(VAS)的统计分析显示每个患者的疼痛显著减轻，也显示在图3-图6中。
案例1：31岁
诊断：患者报告右膝疼痛发作。右膝的MRI显示骨关节炎的变化，表现为内侧半月板体部和后角的复杂撕裂，炎性皱襞和中度软骨软化，5cm Bakers囊肿。
治疗：右膝自体组合物注射到膝盖x 1。血液在室温下储存6小时。
结果：如图3所示，在注射后一个月的随访中，患者报告在疼痛减轻、僵硬减轻、日常活动和VAS评分方面有显著改善，显示一个月后疼痛显著减轻。结果显示WOMAC评分有了很大的改善。病人能够恢复身体活动。
案例2：59岁
诊断：患者报告左膝疼痛发作。左膝的MRI显示骨关节炎的变化：存在相关的水平劈裂撕裂，外侧半月板退化。
治疗：左膝自体组合物注射到膝盖x 1。将装有用于制备抗炎组分的患者血液的玻璃管在室温下储存6小时。
结果：如图4所示，在注射后一个月的随访中，患者报告显著改善，疼痛明显减轻，WOMAC和VAS评分明显改善。
案例3：62岁
诊断：患者报告左膝疼痛发作。左膝的MRI显示骨关节炎的变化：涉及内侧半月板体部和后角的复杂撕裂，伴有退化，覆盖股骨髁和内侧胫骨平台的关节透明软骨退化性变薄。
治疗：左膝自体组合物注射到膝盖x 1。含有用于制备抗炎组分的受试者血液的玻璃管在室温下储存3.5小时。
结果：如图5所示，在注射后一个月的随访中，患者报告了显著的治疗效果、明显的疼痛减轻、WOMAC和VAS评分的明显改善。
案例4：70岁
诊断：患者报告右膝疼痛发作。右膝的MRI显示骨关节炎的变化：0.5x0.4 cm混合部分和全层软骨缺损，累及股骨外侧髁的负重面，伴有10mm软骨下囊肿簇：中度三室骨关节炎。
治疗：右膝自体组合物注射x 1。含有用于制备抗炎组分的受试者血液的玻璃管在室温下储存3.5小时。
结果：如图6中的图表所示，在注射后一个月的随访中，患者报告了显著的治疗效果、明显的疼痛减轻、WOMAC和VAS评分的明显改善。
实施例3
从12名健康受试者抽取血液，然后与4重量％的柠檬酸钠溶液混合。与4重量％柠檬酸钠溶液混合的血液储存在约20℃下。血液与柠檬酸钠的比例为9.5份全血(9.5cc):0.5份4重量％柠檬酸钠溶液(0.5cc)。在作为对照的0小时、6小时、12小时和24小时测量IL-1ra、MMP9、TNFα和ILβ的水平。结果如图7-图10所示。
图7显示了12名受试者在作为对照的0小时、6小时、12小时和24小时的IL-1ra平均水平。如图7所示的结果显示，在孵育6小时和12小时后，IL-1ra水平有统计学上的显著增加。根据方差分析的单向分析，这在统计上是显著的。
图8显示了12名受试者在作为对照的0小时、6小时、12小时和24小时的MMP9平均水平。如图8所示的结果显示，孵育后MMP9的水平没有增加。
图9显示了12名受试者在作为对照的0小时、6小时、12小时和24小时的TNFα平均水平。如图9所示的结果显示，孵育后TNFα水平没有增加。
图10显示了12名受试者在作为对照的0小时、6小时、12小时和24小时的ILβ平均水平。如图10所示的结果显示，孵育后ILβ水平没有增加。
实施例4
用本公开的自体组合物治疗22名患者。每个患者都是被诊断患有双侧膝骨关节炎的个体。对于每个患者，血液被收集在含有柠檬酸钠的单独的玻璃管和塑料管中。每个玻璃管含有约9.5份全血(9.5cc)和0.5份4重量％柠檬酸钠溶液(0.5cc)。
将含有与柠檬酸钠混合的患者血液的玻璃管在约20℃下储存6小时。然后将玻璃管以4,000rpm离心10分钟，以分离抗炎组分。离心后，通过0.25μm过滤器过滤抗炎组分。
塑料管中收集的血液用于制备再生PRP组分。塑料管立即以约7500rpm离心，并将再生组分收集到无菌注射器中。然后过滤来自注射器的再生组分，并从而通过穿过0.25μm过滤器而活化。然后将再生组分立即与在约20℃下储存了6小时的抗炎组分组合。
对于每个患者，获得最终的自体组合物，其包含抗炎和再生(活化的PRP)组分的50/50组合。在每个案例中，将自体组合物施用于患者。
用西安大略和麦克马斯特大学关节炎指数(WOMAC)问卷对22名患者进行评估，用于评估髋和/或膝骨关节炎患者的疼痛、僵硬和身体功能。注射后一个月对WOMAC问卷数据的初步分析显示，在用自体组合物治疗的患者中，患者的疼痛、僵硬和日常活动有统计学上的显著改善，分别如图11b、图11c和图11d所示。视觉模拟疼痛量表(VAS)的统计分析显示，患者的疼痛明显减轻，如图11a所示。
尽管已经参考说明性实施方案描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于这些精确的实施方案。在不脱离本发明的范围的情况下，可以对上述本发明的特定实施方案进行多种修改、变化和调整。权利要求的范围不应受实施例中阐述的优选实施方案的限制，而应给予与说明书整体一致的最宽的解释。
Claims (27)
1.一种产生自体抗炎/抗分解代谢自体组合物的方法，所述组合物可用于治疗患有结缔组织受损和/或损伤、慢性肌腱炎、慢性肌肉撕裂、慢性退化性关节病症和/或皮肤炎症性疾病的哺乳动物，所述方法包括以下步骤：
将哺乳动物的血液与一定量的柠檬酸钠混合形成混合物；
在约20℃至约40℃的温度下孵育所述混合物至少约3.5小时至约12小时；
离心孵育的混合物以将血液分离成上清液组分和细胞部分；和
收集所述上清液组分以提供自体抗炎/抗分解代谢组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合物被孵育约3.5小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合物被孵育约6小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述柠檬酸钠是4重量％的柠檬酸钠溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中将所述哺乳动物的血液与一定量的柠檬酸钠混合形成混合物的步骤包括提供9.5份全血与0.5份4重量％柠檬酸钠溶液的比例。
6.根据权利要求5所述的方法，其中将9.5cc血液与0.5cc 4重量％的柠檬酸钠溶液混合。
7.一种用自体抗炎/抗分解代谢组合物治疗患有结缔组织受损和/或损伤、慢性肌腱炎、慢性肌肉撕裂和/或慢性退化性关节病症和皮肤炎症性疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括以下步骤：
将哺乳动物的血液与一定量的柠檬酸钠混合形成混合物；
在约20℃至约40℃的温度下孵育所述混合物至少约3.5小时至约12小时；
离心孵育的混合物以将血液分离成上清液组分和细胞部分；
收集所述上清液组分以提供自体抗炎/抗分解代谢组合物；和
向哺乳动物施用所述自体抗炎/抗分解代谢组合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述混合物被孵育约3.5小时。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述混合物被孵育约6小时。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述柠檬酸钠是4重量％的柠檬酸钠溶液。
12.根据权利要求11所述的方法，其中将所述哺乳动物的血液与一定量的柠檬酸钠混合形成混合物的步骤包括提供9.5份全血与0.5份4重量％柠檬酸钠溶液的比例。
13.根据权利要求11所述的方法，其中将9.5cc血液与0.5cc 4重量％的柠檬酸钠溶液混合。
14.一种生产自体组合物的方法，所述自体组合物可用于治疗患有结缔组织受损和/或损伤、慢性肌腱炎、慢性肌肉撕裂、慢性退化性关节病症和/或皮肤炎症性疾病的哺乳动物，所述方法包括以下步骤：
制备包含IL-1ra和TIMP的自体组合物的抗炎/抗分解代谢组分，所述制备抗炎/抗分解代谢组分的步骤包括以下步骤：
将哺乳动物的血液与一定量的柠檬酸钠混合形成混合物；
在约20℃至约40℃的温度下孵育所述混合物至少约3.5小时至约12小时；
离心孵育的混合物以将血液分离成上清液组分和细胞部分；
收集所述抗炎/抗分解代谢组分的上清液组分；
制备所述自体组合物的再生组分，其包括以下步骤：
将哺乳动物的血液与一定量的抗凝血剂混合；
离心血液以从中分离富血小板血浆组分；
收集所述富血小板血浆组分；和
将所述抗炎/抗分解代谢组分的上清液组分与所述富血小板血浆组分混合，以提供所述自体组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述混合物被孵育约3.5小时。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述混合物被孵育约6小时。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述柠檬酸钠是4重量％的柠檬酸钠溶液。
18.根据权利要求17所述的方法，其中将所述哺乳动物的血液与一定量的柠檬酸钠混合形成混合物的步骤包括提供9.5份全血与0.5份4重量％柠檬酸钠溶液的比例。
19.根据权利要求17所述的方法，其中将9.5cc血液与0.5cc 4重量％的柠檬酸钠溶液混合。
20.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗凝血剂是约4重量％的柠檬酸钠溶液。
21.一种治疗患有结缔组织受损和/或损伤、慢性肌腱炎、慢性肌肉撕裂和/或慢性退化性关节病症和皮肤炎症性疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括以下步骤：
制备包含IL-1ra和TIMP的自体组合物的抗炎/抗分解代谢组分，所述制备抗炎/抗分解代谢组分的步骤包括以下步骤：
将哺乳动物的血液与一定量的柠檬酸钠混合形成混合物；
在约20℃至约40℃的温度下孵育所述混合物至少约3.5小时至约12小时；
离心孵育的混合物以将血液分离成上清液组分和细胞部分；和
收集所述抗炎/抗分解代谢组分的上清液组分；
制备所述自体组合物的再生组分，其包括以下步骤：
将哺乳动物的血液与一定量的抗凝血剂混合；
离心血液以从中分离富血小板血浆组分；
收集所述富血小板血浆组分；
将所述上清液组分与所述富血小板血浆组分混合，以提供所述自体组合物；和
向哺乳动物施用所述自体组合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述混合物被孵育约3.5小时。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述混合物被孵育约6小时。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述柠檬酸钠是4重量％的柠檬酸钠溶液。
25.根据权利要求24所述的方法，其中将所述哺乳动物的血液与一定量的柠檬酸钠混合形成混合物的步骤包括提供9.5份全血与0.5份4重量％柠檬酸钠溶液的比例。
26.根据权利要求24所述的方法，其中将9.5cc血液与0.5cc 4重量％的柠檬酸钠溶液混合。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述抗凝血剂是约4重量％的柠檬酸钠溶液。
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