KR102455394B1 - 강화된 항염증/항이화 및 재생 작용제를 자가 생리액으로부터 생산하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

강화된 항염증/항이화 및 재생 작용제를 자가 생리액으로부터 생산하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

포유동물에서의 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 및 염증성 피부 장애의 치료에 유용한 자가 조성물을 생산하는 방법이 기술된다. 이러한 방법은 IL-1ra 및 TIMP를 포함하는 자가 조성물의 항염증/항이화 성분을 제조하는 단계를 포함한다. 포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계; 혈액을 튜브로 전달하는 단계; 혈액을 바람직하게는 시트르산나트륨의 존재 하에 약 37℃ 내지 약 39℃의 온도에서 약 24시간 동안 인큐베이션하는 단계; 혈액을 원심분리하여 혈액을 상청액 성분 및 세포 분획으로 분리하는 단계; 상청액 성분을 수집하는 단계를 포함하여 항염증/항이화 성분이 제조된다. 이러한 방법은 포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계; 혈액을 약 4％ 시트르산의 존재 하에 튜브로 전달하는 단계; 혈액을 원심분리하여 혈소판-풍부 혈장 성분을 전혈로부터 분리하는 단계; 혈소판-풍부 혈장 성분을 수집하는 단계; 및 상청액 성분을 혈소판-풍부 혈장 성분과 혼합하여 자가 조성물을 제공하는 단계를 포함하는, 자가 조성물의 재생 성분을 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 자가 조성물로 대상체에서 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 및 염증성 피부 장애를 치료하는 방법, 포유동물에서 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 및 염증성 피부 장애를 치료하기 위한 자가 조성물, 및 포유동물에서의 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 및 염증성 피부 장애의 치료를 위한 이러한 자가 조성물의 용도가 또한 제공된다.

Description

강화된 항염증/항이화 및 재생 작용제를 자가 생리액으로부터 생산하기 위한 방법 및 조성물{METHOD AND COMPOSITION FOR PRODUCING ENHANCED ANTI-INFLAMMATORY/ANTI-CATABOLIC AND REGENERATIVE AGENTS FROM AUTOLOGOUS PHYSIOLOGICAL FLUID}
기술 분야
본 출원은 일반적으로 의약에 관한 것이고, 더욱 특히, 만성 건증, 만성 근육 파열 (건염), 연골 파열, 만성 퇴행성 관절 병태 예컨대 골관절염을 포함하는 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 뿐만 아니라 아토피성 피부염 및 만성 상처를 포함하는 만성 염증성 피부 질환의 치료에 특히 유용한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
배경
골관절염 ("OA")은 연골 손상 및 활액 염증을 특징으로 하는 퇴행성 관절 질환이다. 이전의 데이터는 연골 거대분자의 파괴 및 비가역적인 형태학적 변화에 이르는 분자성 염증 캐스케이드의 변화를 가리킨다1. 상당한 증거가 IL-1, 종양 괴사 인자-알파, IL-6,8 및 메탈로프로테이나제가 골관절염의 발병기전에서 주요 역할을 하는 우세한 이화성 및 염증유발성 분자라는 것을 나타냈다1. 이러한 시토카인들은 활성화된 윤활막세포, 단핵 세포 또는 관절 연골 자체에 의해 생산되고, 이들의 이화 효과는 억제성 시토카인 예컨대 IL-4,10,13 및 IL-1ra에 의해 성공적으로 차단될 수 있다1.
유사한 염증성 및 이화성 경로가 만성 건염의 발병기전2 및 만성 근육 파열 치유 실패3에서 수반된다. 증가된 수준의 IL-1,6, 메탈로프로테이나제 (MMP) 및 기타 이화성 분자를 생산함으로써 힘줄 세포가 연속적인 손상을 받는다2. 염증유발성 시토카인 IL-1 및 TNF-알파가 만성 근육염의 발병기전3에 또한 수반된다. 아토피성 피부염 (습진)은 가장 통상적인 재발성 염증성 피부 병태로 간주된다. 만성 상처 (당뇨병 상처 포함)는 순환 불량, 신경병증, 면역 장애 및 전신 질병의 합병증, 연령, 및 반복된 외상으로 인해 3개월 이내에 치유되지 않는 상처이다. 모든 언급된 병태는 시토카인을 통한 세포 신호전달을 파괴하는 것 및 진피 피부층의 가장 큰 성분을 형성하는 세포외 매트릭스 (ECM)의 상실을 특징으로 한다. 특수한 염증성 및 이화성 분자 경로를 표적화하는 것은 염증 병리에 대한 이로운 치료 효과가 있을 수 있다. 치료적으로 활성인 단백질을 사용함으로써 이러한 효과가 달성될 수 있다. 현재, 제약 산업은 재조합 단백질 생산 예컨대 인슐린, 인터페론, 혈액 응고 인자 등을 위해 고비용의 분자유전학 기술을 이용한다. 그러나, 이러한 재조합 단백질 생성 방법은 박테리아 세포에서의 인간 유전자의 발현을 포함한다. 글리코실화를 포함하는 번역-후 단백질 변형의 패턴이 인간에서 천연적으로 발생하는 것과 상이할 수 있다. 이는 생성물이 인간 환경에서 불안정한 것을 초래하여, 생물학적 기능 또는 면역 반응 유발을 감소시킬 수 있다. 추가적으로, 최종 재조합 생성물의 비용이 매우 높다.
발명의 개요
손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 예컨대 골관절염, 및 염증성 피부 장애를 치료하는데 유용한 생체활성 조성물이 기술된다. 이러한 조성물의 제조 방법이 또한 기술된다. 조성물은 항염증 성분/항이화 성분을 포함한다. 항염증 성분은 또한 항이화 성분이다. 본원의 목적을 위해, 용어 항염증 성분 및 항이화 성분은 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 조성물은 자가 혈소판-풍부 혈장 (PRP)을 포함하는 재생 성분을 또한 포함할 수 있다. 대부분의 PRP 제조 프로토콜은 혈소판으로부터의 성장 인자 및 시토카인의 즉각적인 방출을 초래하는 활성화 단계를 포함하지만, 본 발명은 주사된 조성물이 주위 조직에 의해 추후에 느리게 활성화되는 것을 위해 비-활성화 PRP 성분을 사용하는 것을 제공한다.
항염증/항이화 성분은 바람직하게는 IL-1ra, IL-1 수용체 길항제를 함유하는 자가 혈청을 포함한다. 추가적으로, 항염증/항이화 성분은 메탈로프로테이나제의 조직 억제제 (TIMP)를 증가된 수준으로 포함한다.
한 측면에 따르면,
A) 하기 단계를 포함하는, TIMP 및 IL-1ra를 포함하는 자가 조성물의 항염증/항이화 성분을 제조하는 단계: i) 포유동물로부터 자가 생리액, 바람직하게는 혈액을 수집하는 단계; ii) 혈액을 튜브로 전달하는 단계; iii) 혈액을 약 37℃ 내지 약 39℃의 온도에서 약 24시간 동안 인큐베이션하는 단계; iv) 혈액을 원심분리하여 혈액을 상청액 성분 및 세포 분획으로 분리하는 단계; 및 v) 상청액 성분을 수집하는 단계;
B) 하기 단계를 포함하는, 자가 조성물의 재생 성분을 제조하는 단계: i) 포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계; ii) 혈액을 약 4％ 시트르산나트륨의 존재 하에 튜브로 전달하는 단계; iv) 전혈을 원심분리하여 혈소판-풍부 혈장 성분을 분리하는 단계; 및 v) 혈소판-풍부 혈장 성분을 수집하는 단계; 및
C) 항염증/항이화 성분의 상청액 성분을 혈소판-풍부 혈장 성분과 혼합하여 자가 조성물을 제공하는 단계
를 포함하는, 포유동물에서 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 및 염증성 피부 장애를 치료하기 위한 자가 조성물을 생산하는 방법이 제공된다.
본 개시내용의 목적을 위해, 용어 시트르산나트륨 및 시트르산은 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
또 다른 측면에 따르면,
A) 하기 단계를 포함하는, TIMP 및 IL-1ra를 포함하는 자가 조성물의 항염증/항이화 성분을 제조하는 단계: i) 포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계; ii) 혈액을 시트르산나트륨을 포함하는 튜브로 전달하는 단계; iii) 혈액을 약 37℃ 내지 약 39℃의 온도에서 약 24시간 동안 인큐베이션하는 단계; iv) 혈액을 원심분리하여 혈액을 상청액 성분 및 세포 분획으로 분리하는 단계; 및 v) 상청액 성분을 수집하는 단계;
B) 하기 단계를 포함하는, 자가 조성물의 재생 성분을 제조하는 단계: i) 포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계; ii) 혈액을 약 4％ 시트르산나트륨의 존재 하에 튜브로 전달하는 단계; iv) 전혈을 원심분리하여 혈소판-풍부 혈장 성분을 분리하는 단계; 및 v) 혈소판-풍부 혈장 성분을 수집하는 단계; 및
C) 항염증/항이화 성분의 상청액 성분을 혈소판-풍부 혈장 성분과 혼합하여 자가 조성물을 제공하는 단계
를 포함하는, 포유동물에서 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 및 염증성 피부 장애를 치료하기 위한 자가 조성물을 생산하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에 따르면,
i) 포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계; ii) 시트르산나트륨을 튜브에 첨가하는 단계; iii) 혈액을 튜브로 전달하는 단계; iv) 혈액을 약 37℃ 내지 약 39℃의 온도에서 약 24시간 동안 인큐베이션하는 단계; v) 혈액을 원심분리하여 혈액을 상청액 성분 및 세포 분획으로 분리하는 단계; 및 vi) 상청액 성분을 수집하는 단계
를 포함하는, 포유동물에서 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 및 염증성 피부 장애를 치료하기 위한 자가 조성물을 생산하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에 따르면, 본 개시내용의 방법에 의해 생산된, 포유동물에서 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 및 염증성 피부 장애를 치료하기 위한 자가 조성물이 제공된다.
또 다른 측면에 따르면, 조성물이 항염증/항이화 성분 (바람직하게는 시트르산나트륨을 포함함)을 포함하고, 항염증/항이화 성분이 TIMP 및 IL-1ra를 포함하는, 포유동물에서 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 및 염증성 피부 장애를 치료하기 위한 자가 조성물이 제공된다. 조성물은 혈소판-풍부 혈장을 포함하는 재생 성분을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에 따르면, 조성물이 항염증/항이화 성분을 포함하고, 상기 항염증/항이화 성분이 포유동물의 자가 혈액으로부터 수득된 상청액 성분을 포함하며, 상기 항염증/항이화 성분이 IL-1ra 및 TIMP를 포함하고, 조성물이 포유동물로부터 수득된 혈소판-풍부 혈장을 포함하는 재생 성분을 추가로 포함하는, 포유동물에서 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 및 염증성 피부 장애를 치료하기 위한 자가 조성물이 제공된다. 항염증/항이화 성분은 바람직하게는 시트르산나트륨을 포함한다. 가장 바람직하게는, 시트르산나트륨은 시트르산나트륨의 4％ 용액이다.
또 다른 측면에 따르면, 포유동물에서의 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 및 염증성 피부 장애의 치료를 위한 본 발명의 자가 조성물의 용도가 제공된다.
또 다른 측면에 따르면,
포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계;
혈액을 튜브로 전달하는 단계;
혈액을 약 37℃ 내지 약 39℃의 온도에서 약 24시간 동안 인큐베이션하는 단계;
혈액을 원심분리하여 혈액을 상청액 성분 및 세포 분획으로 분리하는 단계; 및
상청액 성분을 수집하는 단계; 및
하기 단계를 포함하는, 자가 조성물의 재생 성분을 제조하는 단계:
포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계;
혈액을 약 4％ 시트르산의 존재 하에 튜브로 전달하는 단계;
혈액을 원심분리하여 혈소판-풍부 혈장 성분을 전혈로부터 분리하는 단계;
혈소판-풍부 혈장 성분을 수집하는 단계; 및
상청액 성분을 혈소판-풍부 혈장 성분과 혼합하여 자가 조성물을 제공하는 단계; 및
자가 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계
를 포함하는, 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 및 염증성 피부 장애에 대해 포유동물을 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에 따르면,
포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계;
시트르산나트륨을 튜브에 첨가하는 단계;
혈액을 튜브로 전달하는 단계;
혈액을 약 37℃ 내지 약 39℃의 온도에서 약 24시간 동안 인큐베이션하는 단계;
혈액을 원심분리하여 혈액을 상청액 성분 및 세포 분획으로 분리하는 단계;
상청액 성분을 수집하는 단계;
하기 단계를 포함하는, 자가 조성물의 재생 성분을 제조하는 단계:
포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계;
혈액을 시트르산의 존재 하에 튜브로 전달하는 단계;
혈액을 원심분리하여 혈소판-풍부 혈장 성분을 전혈로부터 분리하는 단계;
혈소판-풍부 혈장 성분을 수집하는 단계;
상청액 성분을 혈소판-풍부 혈장 성분과 혼합하여 자가 조성물을 제공하는 단계; 및
자가 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계
를 포함하는, 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 및 염증성 피부 장애에 대해 포유동물을 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에 따르면,
포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계;
혈액을 약 4％ 시트르산나트륨의 존재 하에 튜브로 전달하는 단계;
혈액을 약 37℃ 내지 약 39℃의 온도에서 약 24시간 동안 인큐베이션하는 단계;
혈액을 원심분리하여 혈액을 상청액 성분 및 세포 분획으로 분리하는 단계;
상청액 성분을 수집하는 단계; 및
상청액 성분을 포유동물에게 투여하는 단계
를 포함하는, 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 및 염증성 피부 장애에 대해 포유동물을 치료하는 방법이 제공된다.
본원에 기술된 조성물 및 방법은 인간 용도에 적절하다. 이는 말, 개 및 낙타의 치료를 포함하여 광범위한 수의학 용도에 또한 적절하다.
본 개시내용은 비교적 안전하고, 효과적이며, 안정적이고, 재생성이고, 비용 효율적인, 인간의 퇴행성 관절 질환 치료 및 말, 개 및 낙타를 포함하는 수의학 용도를 위한 대안적인 생성물을 제공한다.
도면 설명
도 1은 상이한 시점의 정지 및 로킹(rocking)을 포함하는 다양한 인큐베이션 조건의 인간 혈청 샘플 내의 IL-1ra 길항제 단백질 수준의 비교를 나타내는, pg/ml 단위의 IL-1ra 농도 대 시간의 플롯이다.
도 2는 공기, Ca++ (포스페이트 완충 염수 (PBS) 내) 및 상이한 농도의 혈청의 존재 하에서의 상이한 시점의 인간 혈청 샘플 내의 IL-1ra 길항제 단백질 수준의 비교를 나타내는, pg/ml 단위의 IL-1ra 농도 대 시간의 플롯이다.
도 3a 및 3b는 치료 전 (3a) 및 정상적인 치료 후 상태 (3b)의 환자의 오른쪽 척추주위 영역의 도플러 초음파 영상이다.
도 4a 및 4b는 과도한 충혈 (a, 치료 전 상태)을 특징으로 하는 만성 아킬레스 건증을 나타내는 도플러 초음파 영상이고, 이러한 충혈이 자가 조성물 치료의 결과로서 해소되었다 (b, 치료 후 영상화).
도 5는 24h 인큐베이션 전 및 후의 TIMP 1, TIMP 2 및 TIMP 4의 농도 수준의 평균을 나타내는 그래프이다.
도 6은 주사 전 및 후의 8명의 환자에서의 시각 상사 척도 ("VAS")에 따른 무릎 관절 통증의 평균 기준선을 나타내는 그래프이다.
도 7은 8명의 환자에서의 무릎 통증, 경직 및 일상 활동 능력의 평균 수준에 대한 WOMAC 지수에 따른 점수값을 나타내는 플롯이다.
도 8은 1차, 2차 및 3차 주사 및 2개월 및 3개월 추적 후의 평균 결과의 내역을 제공하는 그래프 형태의 결과를 나타낸다.
도 9는 24h 인큐베이션 전 및 후의 인간 혈청 샘플 내의 PGDF의 평균 농도 수준 사이의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 10은 37℃에서의 24h 동안의 인큐베이션 전 (기준선 수준) 및 후의 인간 혈청 샘플 내의 MMP2, MMP3, MMP7, MMP9 및 MMP13 단백질 수준의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 11은 시트르산나트륨의 존재 하에서의 37℃에서의 24h 동안의 인큐베이션 전 (기준선 수준) 및 후의 인간 혈청 샘플 내의 MMP2, MMP3, MMP7, MMP9 및 MMP13 단백질 수준의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 12는 도 11로부터의 MMP9 데이터를 나타내는 그래프이다.
도 13은 37℃에서의 24h 동안의 인큐베이션 전 (기준선 수준) 및 후의 인간 혈청 샘플, 활성화된 PRP 및 최종 조성물 내의 IL-1β 수준의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 14는 37℃에서의 24h 동안의 인큐베이션 전 (기준선 수준) 및 후의 인간 혈청 샘플, 활성화된 PRP 및 최종 조성물 내의 TNF-α 수준의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 15는 37℃에서의 24h 동안의 인큐베이션 전 (기준선 수준) 및 후의 인간 혈청 샘플, 활성화된 PRP 및 최종 조성물 내의 TIMP2 수준의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 16은 37℃에서의 24h 동안의 인큐베이션 전 (기준선 수준) 및 후의 인간 혈청 샘플, 활성화된 PRP 및 최종 생성물 내의 IL-1ra 수준의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 17은 37℃에서의 24h 동안의 인큐베이션 전 (기준선 수준) 및 후의 인간 혈청 샘플, 활성화된 PRP 및 최종 조성물 내의 PDGF 수준의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 18a는 테스트된 17명의 환자에서의 통증의 평균 수준에 대한 WOMAC 지수에 따른 점수값을 나타내는 플롯이다. CA- 및 CA+ 군에 대한 기준선 및 주사 1개월 후의 값이 제공된다.
도 18b는 테스트된 17명의 환자에서의 경직의 평균 수준에 대한 WOMAC 지수에 따른 점수값을 나타내는 플롯이다. CA- 및 CA+ 군에 대한 기준선 및 주사 1개월 후의 값이 제공된다.
도 18c는 테스트된 17명의 환자에서의 일상 활동 능력의 평균 수준에 대한 WOMAC 지수에 따른 점수값을 나타내는 플롯이다. CA- 및 CA+ 군에 대한 기준선 및 주사 1개월 후의 값이 제공된다.
도 18d는 테스트된 17명의 환자에서의 시각 상사 통증 척도 (VAS)의 통계적 분석을 나타내는 플롯이다. CA- 및 CA+ 군에 대한 기준선 및 주사 1개월 후의 값이 제공된다.
도 19a는 본 개시내용의 방법으로의 치료 전의 건선을 앓고 있는 환자의 팔의 피부 사진이다.
도 19b는 본 개시내용의 방법으로의 치료 3개월 후의 건선을 앓고 있는 환자의 팔의 피부 사진이다.
상세한 설명
본 개시내용은 상승작용적인 항염증/항이화, 증식, 조직 리모델링 및 재생 효과가 있는 생체활성 단백질들로 혈청이 강화된, 자가 항염증/항이화 성분 및 바람직하게는 자가 혈소판-풍부 혈장 성분을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
이같은 조성물은 전형적으로 하기의 치료적으로 활성인 단백질을 포함한다: IL-1ra6, IL-47, IL-108,9, IL-1310, PDGF11, TGF-β10,11 및 VEGF12,13,14,16.
IL-1ra는 단핵구, 지방세포 및 상피 세포에 의해 분비된다. 인간 단핵구를 약 37℃에서 약 24h 동안 인큐베이션함으로써 치료적 유효 농도의 이러한 단백질이 획득된다17. IL-4,10,13, PDGF, TGF-β는 혈소판 및 과립구의 내용물이고, PRP 성분 내에서 운반된다. IL-4,10,13은 백혈구에서 유래된다. PDGF는 혈소판에 의해 생산되고, TGF-B는 혈소판 및 일부 T 세포에 의해 방출된다. 언급된 단백질들의 상승작용적 효과를 사용하면 강력한 생체활성 자가 생성물이 생성된다. 따라서, 재생성 생물학적 인자 및 항염증성 시토카인 및 성장 인자의 공급원으로서의 신선하게 제조된 PRP와 IL-1 억제제의 공급원으로서의 인큐베이션된 자가 혈청을 포함하는 항염증 성분의 조합은 퇴행성 병태 예컨대 골관절염, 만성 건증 및 만성 근육 파열, 뿐만 아니라 염증성 피부 장애의 치료를 위한 강력하고 비용-효율적인 자가 치료제를 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"는 대상체에서 통증 및/또는 염증이 감소되는 완화 치료를 포함한다.
본원의 항염증/항이화 성분을 생산하는 방법이 IL-1ra 생산에 더하여 메탈로프로테이나제의 조직 억제제 (TIMP)가 증가된 수준으로 생산되는 것에 이른다는 것이 놀랍다. 매트릭스 메탈로프로테이나제 MMP는 활성 상태일 때 관절 파괴를 야기하는 것으로 생각된다. TIMP는 활성 MMP를 중화함으로써, IL-1ra와 상승작용적인 추가적인 항이화 이익을 제공한다.
본원의 항염증/항이화 성분의 생산에서, 환자 혈액을 약 37℃ 내지 약 39℃의 온도에서 약 24시간 동안 인큐베이션하기 전에 시트르산나트륨을 첨가하는 것이, 관절에 대한 이화 효과가 있는 병리학적인 분자 작용제 예컨대 MMP9, IL-1β 및 TNF-α의 수준 증가를 방지하지만, 항이화 및 재생 작용제 예컨대 TIMP, IL-1ra 및 PDGF 수준의 유의한 감소는 유도하지 않는다는 것이 또한 놀랍다.
바람직하게는, 골관절염, 만성 건증 및 만성 근육 파열, 뿐만 아니라 염증성 피부 장애의 치료를 위한 자가 조성물을 생산하는 기술된 방법은 무균 기술에 의해 포유동물의 자가 생리액, 바람직하게는 혈액을 수집하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다. 그러나, 본원의 조성물 및 방법은 광범위한 수의학 용도, 예를 들어, 말, 개 및 낙타의 치료에 또한 적절하다.
정맥천자 부위 및 수집 튜브의 표면을 아이오딘 용액의 2％ 팅크제로 세정할 수 있다. 임의의 부위 세정을 시작하기 전에, 아이오딘에 대한 임의의 알레르기에 관하여 환자에게 질문할 수 있다. 또한 튜브 덮개를 70％ 알콜 용액로 세정하여, 혈액 수집 전의 가능한 오염을 방지한다.
자가 생리액, 바람직하게는 혈액을 바람직하게는 약 37℃ 내지 약 39℃의 온도에서 배양함으로써 바람직하게 조성물이 제조된다. 그러나, 관련 기술 분야의 기술자는 결과가 허용가능하면서 혈액을 이러한 범위 밖의 온도, 예를 들어 약 37℃ 내지 약 40℃에서 인큐베이션할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 가장 바람직하게는, 온도는 37℃ 내지 38℃이다. IL-1ra 세포외 강화를 위해, 그리고 바람직하게는 TIMP의 생산을 위해 바람직하게는 약 24시간 동안 혈액을 인큐베이션한다. 바람직하게는, 인큐베이션 전에 시트르산나트륨 (바람직하게는 4％의 농도)이 혈액이 수집되는 멸균 유리 튜브 또는 폴리스티렌 튜브에 첨가된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 첨가물이 없는 멸균 유리 튜브 (코비덴(Coviden)) 또는 폴리스티렌 (BD) 배큐테이너(vacutainer) 튜브에서 인큐베이션될 수 있다. 한 실시양태에서, 로커(rocker) 플랫폼 (24 rpm) 또는 정지 상태에서의 자가 생리액, 바람직하게는 혈액의 인큐베이션이 추가로 제공된다. 바람직하게는, 도 1에서 제시된 바와 같이 정지 상태에서 인큐베이션이 수행된다.
바람직하게는, IL-1ra 생산을 용이하게 하도록 0.64-0.72 mM Ca++ 존재 하에 혈액을 인큐베이션한다15. 특히 바람직한 실시양태에서, 인큐베이션 전에 멸균 주사기 및 바늘을 사용하여 염화칼슘 용액을 혈액이 있는 튜브에 직접 첨가하는 것에 의해 인큐베이션되는 혈액을 0.64-0.72 mM Ca++를 함유하는 멸균 염화칼슘 용액으로 9:1 비율로 희석하는 것이 가능하고 유리하다 (9 cc 전혈에 대해 1 cc의 염화칼슘 용액) (도 2). IL-1ra 생산을 증가시키기 위해 혈액을 대기에 노출시키도록 동일한 부의 멸균 공기를 혈액을 함유하는 멸균 튜브에 첨가할 수 있다 (도 2). 특히 바람직한 실시양태에서, 인큐베이션 전에 멸균 주사기 및 바늘을 사용하여 공기가 0.22 ㎛ 밀렉스GP(MillexGP) 필터를 통해 혈액이 있는 튜브에 직접 통과될 것이다.
바람직하게는, 시트르산나트륨이 9.5 부의 전혈 (9.5 cc) : 0.5 (0.5 cc)의 바람직하게는 4％의 시트르산나트륨의 비로 인큐베이션 전에 혈액에 첨가된다. 4％ 시트레이트는 바람직하게는 4％ 시트르산나트륨 용액이다. 4％ 시트르산나트륨 용액은 상업적으로 쉽게 입수가능하다.
그 후, 인큐베이션된 혈액을 원심분리하여 상청액 성분을 세포 분획으로부터 분리한다. 원심분리는 약 10-20분 동안 약 4000-10000 rpm에서 수행된다. 바람직하게는, 원심분리는 10분 동안 4000 rpm에서 수행된다.
다음 단계는 무균 기술을 사용하여 상청액을 흡인하고 이를 추후 프로세싱을 위해 분취량으로 분할하는 것을 수반한다. 이러한 절차는 무균 환경 (HEPA 필터가 있는 층류 후드)에서 수행된다. 생물학적으로 활성인 작용제들을 함유하는 3 cc의 상청액 층을 멸균 주사기 및 바늘에 의해 조심스럽게 뽑아낸다. 분취량을 약 -20℃에서 동결시키고 6개월까지 보관하거나 또는 약 -70℃에서 1년까지 보관함으로써 IL-1ra를 함유하는 생성물의 장기 보관이 달성된다.
PRP를 포함하는 재생 성분의 제조는 혈액을 배큐테이너 튜브 내로 채혈하는 것을 수반한다. 이는 바람직하게는 4％ 시트르산의 존재 하에 수행된다. 바람직하게는, 9.5 부의 전혈 (9.5 cc) : 0.5 (0.5 cc)의 4％ 시트르산 비이다. 그 후, 혈액을 바람직하게는 약 30초 동안 약 7500 rpm에서 원심분리하여 PRP 분획을 단리한다. 이러한 원심분리 파라미터가 골관절염 및 만성 건증 치료 및 피부 장애를 위한 최종 생성물의 일부로서의 PRP 제제에 대한 바람직한 실시양태에서 사용된다. PRP 분획을 무균 조건 하에 멸균 주사기 및 바늘에 의해 뽑아낸다. 만성 파열의 치료를 위한 특히 바람직한 실시양태에서, 이환 부위에서의 새로운 혈관 발달을 촉진하기 위해 백혈구 버피 코트(buffy coat) 분획이 추가적인 VEGF 공급원으로서 PRP에 첨가된다. 수동으로 상기 기재된 바와 같이 전혈 원심 분리 후에 멸균 주사기 및 바늘에 의해 또는 시판되는 하비스트 스마트프렙(Harvest SmartPrep) 시스템을 사용하여 버피 코트 층 및 혈장을 수집한다. PRP를 포함하는 재생 성분은 동결되거나 또는 다른 식으로 보관되지 않는다. 재생 성분과 항염증/항이화 성분의 혼합 후에 신속하게 자가 조성물이 환자에게 투여되어야 한다.
IL-1ra 및 바람직하게는 TIMP 함유 혈액을 포함하는 항염증/항이화 성분을 PRP 분획을 포함하는 재생 성분과 바람직하게는 1:1 비로 배분하여 최종 생성물을 수득한다.
힘줄-유래 콜라겐18 및 조직-유래 트롬빈에 의한 추후의 느린 활성화를 위해 이러한 생성물을 주사한다.
하기의 예시적인 실시예의 도움을 받아 본 발명이 추가로 기술된다.
실시예
실시예 1 - 상이한 배양 조건에서의 세포외 IL- 1ra 생산의 비교
도 1에 그래프로 나타난 바와 같이, 정지 대 로킹 인큐베이션을 포함하는 상이한 시점의 인큐베이션 조건에 노출된 인간 혈청 샘플 내의 IL-1ra 길항제 단백질 수준을 비교하였다. IL-1ra는 활성화된 혈액 단핵구, 대식세포에 의해 분비된다. 진탕 공정을 사용하는 것을 통한 혈액 세포와 수집 튜브의 내부 표면 사이의 접촉에 의해 이같은 활성화가 달성된다. 세포 성분에 노출되는 내부 표면적을 증가시킴으로써, 세포 활성화 프로세스 및 생체활성 분자 분비가 최대화될 수 있다.
10명의 건강한 남성 및 여성 지원 공여자 (21 내지 60세)로부터의 말초혈을 무균 조건 하에 정맥 천자로 멸균 10 ml 유리 튜브에 수집하였다. 1개의 튜브는 인큐베이션 단계 없이 표준 절차에 따라 조작하였다 (대조군 샘플). 샘플을 로커 플랫폼 (24 rpm)에서 진탕하면서 또는 진탕하지 않으면서 3.5h, 7h, 및 24h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션된 샘플을 10분 동안 4,000 rpm에서 원심분리한 후, 여과하고, 제작 프로토콜 (인터넷으로 bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10014905.pdf에서 입수가능함)에 따라 IL-1ra의 최종 농도를 프로세싱되지 않은 대조군 샘플 (0h)의 것에 비교하였다. 일원 ANOVA 테스트에서 24h의 인큐베이션 후에만 혈청 내의 IL-1ra 농도의 유의한 증가가 나타났다; 3.5h 및 7h 인큐베이션 샘플에서는 유의한 IL-1ra 농도 증가가 관찰되지 않았다. 추가적으로, 정지 및 로킹 인큐베이션 조건 사이에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 매그픽스 루미넥스(MAGPIX Luminex)™ 기술을 사용하여 IL-1ra 농도를 평가하였다.
도 2는 하기의 인큐베이션 조건에 노출된 인간 혈청 샘플 내의 Il-1ra 길항제 단백질 수준의 비교를 나타낸다: 공기, Ca++ (포스페이트 완충 염수 (PBS) 내) 및 상이한 농도의 혈청의 존재 하에서의 24h 인큐베이션. 일원 ANOVA 테스트에서, 50％ 희석 혈액에서의 배양을 제외한 모든 언급된 조건에서 24h 인큐베이션 후에 혈청 내의 IL-1ra 생산의 유의한 증가가 나타났다.
실시예 2 - 골관절염 및 만성 건증으로 진단되고 자가 조성물로 치료된 환자의 사례 보고
방법 및 물질:
본원에서의 각각의 환자에 대해, 환자로부터의 혈액을 수집하고, 혈액을 튜브로 전달하고, 혈액을 약 37℃ 내지 약 39℃의 온도에서 약 24시간 동안 인큐베이션하고, 혈액을 원심분리하여 혈액을 상청액 성분 및 세포 분획으로 분리하고, 항염증 성분의 상청액 성분을 수집함으로써 IL-1ra 및 TIMP를 포함하는 자가 조성물의 항염증/항이화 성분을 제조하였다. 유사하게, 환자로부터 혈액을 수집하고, 혈액을 약 4％ 시트르산의 존재 하에 튜브로 전달하고, 혈액을 원심분리하여 혈소판-풍부 혈장 성분을 전혈 성분으로부터 분리하고, 혈소판-풍부 혈장 성분을 수집하고, 항염증/항이화 성분의 상청액 성분을 혈소판-풍부 혈장 성분과 혼합하여 자가 조성물을 제공함으로써 자가 조성물의 재생 성분을 제조하였다. 그 후, 자가 조성물을 환자에게 투여하였다.
사례 1: S, 61세.
진단: 환자가 수년 전에 시작되었고 이전 6개월 이내에 증가된, 잠행성으로 발병된 양측성 무릎 통증을 보고하였다. 무릎 MRI가 무릎의 중증 OA를 나타냈다: 오른쪽 무릎에서의 기저 부종과 함께 오른쪽 및 오른쪽 무릎 내의 대퇴골 관절돌기를 수반하는 전층 연골 결손 및 내측 대퇴골 활차의 후면을 수반하는 전층 연골 결손이 증량된 내측 구획의 중증 연골증. 1년 전에, 환자가 코르티손 주사 IA를 받았고, 이는 1개월 경감을 제공하였다. 신체 검사: 무릎 가동 범위 (ROM)가 완전하였고, 모든 인대가 정상이었으며, 소형 양측성 삼출 신경혈관 검사가 정상이었다. VAS는 60이었다.
치료: 1주일 간격의 3회의 환자 양측 무릎 내로의 환자용 국소성 자가 조성물의 주사.
결과: 환자용 국소성 자가 조성물의 양측에서의 1차 주사 후에, 환자가 유의한 개선을 보고하였고, VAS가 3이었다. 3차 주사 시에, ROM이 완전하였고, 모든 인대가 정상이었으며, 관절선 통증이 없었고, 삼출이 없었다. 환자가 강한 통증 감소를 보고하였고, VAS가 10이었고, 환자의 신체 활동이 되돌아왔다. 3개월 후, 추적 검사에서 환자가 통증이 없는 것으로 나타났다.
사례 2: E, 64세.
진단: 왼쪽 고관절에서 VAS 60을 나타낸 활동적인 남성. 일상 활동의 통증이 있고, 장거리를 걷는 것이 유의하게 손상됨. MRI가 양쪽 고관절에서의 경도의 OA를 나타냈다: 양측 고관절 퇴행 및 비구순의 퇴행성 파열. 통증 경감 면에서 물리 치료가 제한적으로 성공하였다.
치료: 1주일 간격의 ×2의 왼쪽 고관절 내로의 환자용으로 제조된 국소성 자가 조성물의 초음파-가이드 주사.
결과: 국소성 자가 조성물의 1차 주사 후, 환자가 통증의 85％ 개선을 보고하였다 (환자의 개인적 평가). 국소성 자가 조성물의 2차 주사 후, VAS가 10이었다. 5개월 후, VAS가 또한 10이었다.
사례 3: A, 70세.
진단: 왼쪽 무릎에서의 만성 통증 (VAS가 6이었음) 압통 및 종창을 나타낸 여성 환자. 걷기, 서기, 및 계단오르기에 많은 어려움이 있었다. 무릎 통증에 도움이 되기 위해 물리 치료사 (6회 방문), 카이로프랙터 (6회 방문)에게 갔었고, 결과가 없었다. MRI가 왼쪽 무릎에서의 중증 OA를 나타냈고, 내측 대퇴골 관절돌기 및 내측 경골 고평부의 체중 지지부에서의 전층 연골 결손로 인한 내측 구획의 협착이 있었다.
치료: 국소성 자가 조성물을 제조하고, 왼쪽 무릎 내로 1주일 간격으로 3회 주사하였다.
결과: 국소성 자가 조성물로의 치료 후 5개월의 추적 방문: 환자가 증상의 약 80％ 개선을 보고하였고, 종창이 없었다; VAS는 20이었다.
사례 4: J, 26세, 프로 수영선수.
진단: 척추주위 근육 상해 이후의 상태, 만성 척추주위 건염. 환자가 척추주위 근육에 걸친 통증을 호소하였다. 장기간의 물리치료가 결과를 나타내지 않았다. 등 ROM이 완전하고, 신경혈관 검사가 정상이었다. 컬러 도플러 (도 3a)에서 오른쪽 척추주위 충혈 영역이 확인되고, VAS는 80이었다.
치료: 염증 영역을 초음파 기술을 사용하여 표시하고, 자가 조성물을 근육 내로 1주일 간격으로 ×4 주사하였다.
도 3a 및 3b는 치료 전의 오른쪽 척추주위 영역에서의 충혈 (도 3a) 및 정상적인 치료 후 상태 (도 3b)를 나타낸 도플러 초음파 영상이다.
결과: 도플러가 염증을 나타내지 않았고 (도 3b), 요법 4개월 후에 VAS가 10이었다.
사례 5: S, 18세.
진단: 오른쪽 아킬레스 파열 이후의 상태. 환자가 아킬레스 부착부에서의 통증을 호소하였다: 만성 아킬레스 건염 및 건초염. 도플러가 이러한 영역에서의 중증 힘줄내 충혈을 나타냈다 (도 4a). VAS는 60이었다.
치료: 장기간의 물리요법 및 카이로프래틱 치료가 어떠한 양성 결과도 나타내지 않았다. 자가 조성물을 제조하고, 초음파 가이드를 사용하여 힘줄 내로 1주일 간격으로 3회 주사하였다.
도 4a 및 4b는 과도한 충혈 (도 4a, 치료 전 상태)을 특징으로 하는 만성 아킬레스 건증을 나타낸 도플러 초음파 영상이고, 이러한 충혈이 자가 조성물 치료의 결과로서 해소되었다 (도 4b, 치료 후 영상화).
결과: 도플러 영상화에서 충혈이 나타나지 않았고 (도 4b), 주사 5개월 후의 추적 평가에서 VAS가 0이었다.
실시예 3 - 시험관 내 연구
건강한 남성 및 여성 지원 공여자 (21 내지 60세)로부터의 말초혈을 무균 조건 하에 정맥 천자로 멸균 10 ml 유리 튜브에 수집하였다. 1개의 튜브는 인큐베이션 단계 없이 표준 절차에 따라 조작하였다 (대조군 샘플). 샘플을 여러 인큐베이션 조건에 노출시켰고, 각각의 샘플로부터의 500 ㎕의 혈청을 검정법에 사용하였다. 분석 전에 샘플을 10,000×g로 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포 잔해물 및 응집물을 제거하였다. 편평바닥 미량역가 플레이트에서 제조사의 설명서 (인터넷으로 bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10014905.pdf에서 입수가능함)에 따라 매그플렉스(MagPlex)™ 비드를 사용한 바이오플렉스 프로™ 휴먼 시토카인 27-플렉스 패널((BioPlex Pro™ Human Cytokine 27-plex Panel), 휴먼 TIMP 마그네틱 루미넥스™ 퍼포먼스 어세이 4-플렉스 패널™(Human Magnetic Luminex™ Performance Assay 4-plex Panel™) (바이오-래드 래버러토리즈, 캐나다, 리미티드(Bio-Rad Laboratories, Canada, LTD)) 분석을 수행하였다.
간략하게, 샘플을 샘플 희석제에서 1:4 희석하였다. 표준물을 구성하고, 4배 단계 희석으로 희석하였다. 항체가 커플링된 포착 비드를 준비하고 플레이팅하였다. 각각의 웰에 첨가하기 전에 비드 용액을 와동시켰다. 플레이트를 세정하고, 모든 세정 단계를 수동으로 수행하였다. 먼저, 세정 용액을 플레이트에 첨가하고, 이어서 플레이트를 밀봉 테이프로 덮었다. 플레이트를 30초 동안 1100　rpm으로, 그 후 1.5분 동안 300 rpm으로 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 진탕기에서 내리고, 자석 상에서 1분 동안 인큐베이션한 후, 상청액을 폐기하였다. 세정 후, 희석된 샘플 및 표준물을 웰 내의 비드에 이중으로 첨가하였다. 플레이트를 진탕기 상에서 30분 동안 인큐베이션하고, 인큐베이션 및 세정 후, 검출 항체를 30분 동안 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 다시 진탕기 상에서 인큐베이션하고, 또 다른 세정 단계 후, 스트렙타비딘 용액을 10분 동안 웰에 첨가하였다. 마지막 인큐베이션 단계 후, 비드를 검정법 완충제에 다시 현탁시키고, 플레이트를 엑스포넨트(xPONENT)™ 소프트웨어 (루미넥스 코포레이션(Luminex Corporation), 미국 텍사스주 오스틴)를 사용하여 매그픽스(MagPix)™ (루미넥스 코포레이션)로 판독하였다. 엑스포넨트™ 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하였다. 각각의 분석물에 대해 표준 곡선을 구축함으로써 샘플의 절대 농도를 결정하였다.
통계 분석: 모든 통계 테스트를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)™ 버전 5.01을 사용하여 수행하였다. 군들 사이의 비교를 위해 분산 분석 (ANOVA) + 본페로니 사후 테스트를 사용하여 통계학적 비교를 수행하였다. 분석된 실험의 수는 ≥ 3이었고, 데이터는 평균 ± s.e.m., p< 0.05으로 제시되었다.
도 5는 37℃에서의 24h 동안의 인큐베이션 전 (기준선 수준) 및 후의 인간 혈청 샘플 내의 TIMP 1, TIMP 2 및 TIMP 4 (MMPS 길항제) 단백질 수준의 비교를 나타내는 그래프이다. 이원 ANOVA 테스트에서 인큐베이션 24시간 후에 TIMP 1 및 TIMP 2 수준의 통계적으로 유의한 증가가 나타났다.
도 9는 프로세싱되지 않은 인간 혈청 샘플 내의 PGDF의 평균 농도 수준과 24h 인큐베이션 샘플 내의 PGDF의 평균 수준 사이의 비교를 나타내는 그래프이다. 테스트 데이터 분석은 프로세싱된 샘플에서의 PGDF 단백질 농도의 통계적으로 유의한 증가를 나타냈다. 매그픽스 루미넥스™ 기술을 사용하여 PDGF 농도를 평가하였다.
실시예 4 - 무릎 골관절염 관절 통증에 대해 치료된 환자로부터의 결과
8명의 환자를 무릎 골관절염 관절 통증의 증상에 대해 치료하였다. 실시예 2에 요약된 절차에 따라 환자에게 국소성 자가 조성물을 1주일 간격으로 4회 주사하였다.
주사한 후, 시각 상사 통증 척도 (VAS), 및 고관절 및/또는 무릎 골관절염 환자의 통증, 경직 및 신체 기능을 평가하기 위한 웨스턴 온타리오 & 맥마스터 대학교 관절염 지수(Western Ontario and McMaster Universities Arthritis Index) (WOMAC) 질문지로 환자를 평가하였다. WOMAC 질문지 데이터의 분석은, 도 7에 나타난 바와 같이, 장기간 동안 (3개월까지) 환자의 일상 활동의 통계적으로 유의한 개선 및 통증 및 경직 파라미터 개선의 통계적으로 유의하지는 않지만 양성인 동태를 나타냈다. 시각 상사 통증 척도의 통계 분석은 도 6에 나타난 바와 같이 3차 주사 후 유의한 통증 감소를 나타냈다.
도 6은 8명의 환자에서의 VAS 척도에 따른 관절 통증의 평균 기준선 및 주사 후의 비교를 나타내는 막대 그래프이다. 이러한 결과는 통증의 통계적으로 유의한 평균 감소를 나타내고, 3개월까지 효과가 안정적이다.
도 7은 8명의 환자에서의 통증, 경직 및 일상 활동 능력의 평균 수준에 대한 WOMAC 지수에 따른 점수값을 나타내는 플롯이다. 기준선, 주사 후, 주사 2개월 후 및 주사 3개월 후에 대한 값이 제공된다.
도 8은 1차, 2차, 3차 주사, 4차 주사 2개월 후 및 4차 주사 3개월 후의 평균 결과의 내역을 제공하는 8명의 환자에서의 그래프 형태의 결과를 나타낸다.
도 6-8에서 제시된 결과는 테스트된 8명의 환자의 평균 결과이다.
실시예 5 - 항염증/항이화 성분의 제조에서 인큐베이션 전에 시트르산나트륨 (CA)을 첨가하는 것의 효과
15명의 환자를 테스트하여, 환자의 혈액을 약 24시간 동안 인큐베이션하기 전에 혈액에 시트르산나트륨 (CA)을 첨가하는 것이 항염증 성분 내 및 항염증 성분 및 재생 또는 PRP 성분의 조합물인 최종 생성물 내의 MMP (MMP9 포함), IL-1β, TNF-α, TIMP2, Il-1ra 및 PDGF 수준에 미치는 효과를 결정하였다.
하기의 논의에서 용어 "혈액" 및 "혈청"이 상호교환가능하게 사용된다.
방법 및 물질:
본원에서의 각각의 환자에 대해, 항염증/항이화 성분을 하기와 같이 제조하였다. 약 9.5 cc의 혈액을 환자로부터 수집하였다. 그 후 약 9.5 cc의 혈액을 약 0.5 cc의 염수 용액을 함유하는 제1 튜브로 전달하였다. 염수 용액은 약 0.9％ NaCl을 포함하였다. 또 다른 약 9.5 cc의 혈액을 환자로부터 수집하고, 약 0.5 cc의 4％ 시트르산나트륨을 함유하는 제2 튜브로 전달하였다. 혈액을 수집한 후, 제1 및 제2 튜브를 약 37℃ 내지 약 39℃의 온도에서 약 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 제1 및 제2 튜브를 원심분리하여 각각의 튜브 내의 혈액을 상청액 성분 및 세포 분획으로 분리하였다. 제1 및 제2 튜브의 상청액 성분을 별개로 수집하여, 염수를 함유하는 제1 튜브에서 유래되는 제1 항염증/항이화 성분 및 시트르산나트륨을 함유하는 제2 튜브로부터 유래되는 제2 항염증/항이화 성분을 제공하였다. 각각의 환자에 대해, 환자로부터 혈액을 수집하고, 혈액을 약 4％ 시트르산의 존재 하에 튜브로 전달하고, 혈액을 원심분리하여 혈소판-풍부 혈장 성분을 전혈 성분으로부터 분리함으로써 재생 성분을 제조하였다. 각각의 환자에 대해, 혈소판-풍부 혈장 성분을 수집하고, 제1 및 제2 튜브의 상청액 성분과 각각 혼합하여, 염수를 함유하는 제1 튜브에서 유래되는 제1 최종 생성물 및 시트르산나트륨을 함유하는 제2 튜브로부터 유래되는 제2 최종 생성물을 제공하였다.
각각의 환자에 대해, 채혈 직후에 MMP2, MMP3, MMP7, MMP9, MMP13, IL-1β, TNF-α, TIMP2, Il-1ra 및 PDGF의 기준선 수준을 측정하였다. 15명의 환자 각각에 대해, 인큐베이션 약 24시간 후에 염수 및 환자 혈액을 함유하는 제1 튜브에서 MMP9, IL-1β, TNF-α, TIMP2, Il-1ra 및 PDGF 수준을 측정하였다. 유사하게, 15명의 환자 각각에 대해, 인큐베이션 약 24시간 후에 시트르산나트륨 및 환자 혈액을 함유하는 제2 튜브에서 MMP9, IL-1β, TNF-α, TIMP2, Il-1ra 및 PDGF 수준을 측정하였다. 각각의 환자에 대해, 혈소판-풍부 혈장 성분을 트롬빈과 혼합한 후, MMP9, IL-1β, TNF-α, TIMP2, Il-1ra 및 PDGF 수준을 측정하였다. 각각의 환자에 대해, 제1 및 제2 최종 생성물 각각에서 MMP9, IL-1β, TNF-α, TIMP2, Il-1ra 및 PDGF 수준을 측정하였다. 도 10-17에서 그래프로 제시된 측정치는 테스트된 15명의 환자의 평균을 나타낸다.
테스트된 15명의 환자에서, 0시간 인큐베이션 시의 천연 혈청 (혈액) 내의 IL-1ra의 평균 수준이 9 ± 4 pg/ml로 측정되었다. 항염증/항이화 성분과 재생 또는 PRP 성분의 조합으로부터 초래된 최종 생성물에서, 천연 혈청 (혈액) 내의 IL-1ra에 대한 평균 측정치는 920 ± 80 pg/ml였다. 이는 시트르산나트륨이 항염증/항이화 성분에 첨가된 경우 및 시트르산나트륨이 첨가되지 않은 경우 양쪽 모두에 그러하였다.
테스트된 15명의 환자에서, 0시간 인큐베이션 시의 천연 혈청 (혈액) 내의 PDGF의 평균 수준이 1100 ± 300 pg/ml로 측정되었다. 항염증/항이화 성분과 재생 또는 PRP 성분의 조합으로부터 초래된 최종 생성물에서, 천연 혈청 (혈액) 내의 PDGF에 대한 평균 측정치는 1920 ± 380 pg/ml였다. 이는 시트르산나트륨이 항염증/항이화 성분에 첨가된 경우 및 시트르산나트륨이 첨가되지 않은 경우 양쪽 모두에 그러하였다.
테스트된 15명의 환자에서, 0시간 인큐베이션 시의 천연 혈청 (혈액) 내의 TIMP2의 평균 수준이 1800 ± 150 pg/ml로 측정되었다. 항염증/항이화 성분과 재생 또는 PRP 성분의 조합으로부터 초래된 최종 생성물에서, 천연 혈청 (혈액) 내의 TIMP2에 대한 평균 측정치는 5500 ± 360 pg/ml였다. 이는 시트르산나트륨이 항염증/항이화 성분에 첨가된 경우 및 시트르산나트륨이 첨가되지 않은 경우 양쪽 모두에 그러하였다.
이러한 도면들에서, 혈청 0h는 수집 직후에 측정된 환자 혈액 내의 피분석물 수준의 기준선 측정치이다. 혈청 24h + 0.5 cc 염수는 24시간 인큐베이션 후의 염수 용액과 혼합된 환자 혈액 내의 피분석물 수준이다. 혈청 24h + 0.5 cc CA는 24시간 인큐베이션 후의 4％ 시트르산나트륨 용액과 혼합된 환자 혈액 내의 피분석물 수준이다. PRP + 트롬빈은 응고제로서의 트롬빈과 조합된 PRP 성분 내의 피분석물 수준이다. 이러한 측정치는 PRP 성분 내의 피분석물의 기준선 수준을 나타낸다. PRP + 혈청 + 트롬빈 또는 PRP + 혈청 24h + 트롬빈은 항염증/항이화 성분이 시트르산나트륨 없이 염수만으로 제조된 경우의 항염증/항이화 성분과 재생 또는 PRP 성분의 조합으로부터 초래된 최종 생성물 내의 피분석물 수준이다. PRP + 혈청 + CA + 트롬빈 또는 PRP + 혈청 24h + CA + 트롬빈은 항염증/항이화 성분이 시트르산나트륨과 함께 제조된 경우의 항염증/항이화 성분과 재생 또는 PRP 성분의 조합으로부터 초래된 최종 생성물 내의 피분석물 수준이다.
실시예 2의 절차에 기재된 바와 같은 항염증/항이화 성분 제조에서, 이러한 성분의 생산이 인큐베이션 단계 후 증가된 수준의 IL-1ra (항염증제), TIMP (항이화제) 및 PDGF (재생 작용제)를 초래한다는 것이 관찰되었다. 자가 생체활성 조성물을 생산하는 방법은 활성화된 혈액 단핵 세포가 양성 생체활성 분자를 분비하는 능력을 기초로 한다. 그러나, 동일한 면역 세포가 이의 활성화 시 병리학적 분자 작용제 및 이의 억제제 양쪽 모두를 비선택적으로 생산하는 것으로 현재 밝혀져 있다. 따라서, 자가 생체활성 조성물은 상승된 농도의 이화성 분자 예컨대 MMP9를 또한 함유한다. 도 10에 나타난 바와 같이, 환자 혈액을 염수의 존재 하에 24h 동안 약 37℃ 내지 약 39℃에서 약 24시간 동안 인큐베이션한 후에 제조된 항이화 성분 내의 4가지 MMP 유형의 정량적 측정에 의해 이것이 입증되었다. 도 10에 나타난 바와 같이, MMP 2,3,7,13의 농도는 인큐베이션 후에 유의하게 변화하는 것으로 발견되지 않았지만, 골관절염 발병기전에 가장 결정적인 MMP9의 농도는 유의하게 증가되었다. 일원 ANOVA 테스트는 인큐베이션 24시간 후에 MMP9 수준의 통계적으로 유의한 증가를 나타냈다.
자가 생체활성 조성물 내에 증가된 MMP9 농도가 존재하는 것은 환자 치료 과정 동안 역효과 징후를 초래할 수 있다. 따라서 이러한 음성 성분을 선택적으로 제거하는 것이 요망된다. 항응고제인 시트르산나트륨의 존재는 인간 혈액 백혈구에 의한 MMP9 방출을 유의하게 하향 조절한다19. 9.5 cc 혈액 : 0.5 cc 시트르산나트륨 비의 시트르산나트륨 (CA) 존재 하의 인간 혈액을 약 37℃ 내지 약 39℃의 온도에서 24시간 동안 인큐베이션하였고, 도 11 및 12에 나타난 바와 같이 특히 MMP9 분비에서의 강한 동적 변화가 발견되었다. 특히, 항염증/항이화 성분 제조에서 시트르산나트륨을 첨가하는 것이 항염증/항이화 성분 및 재생 성분이 조합된 최종 생성물 (트롬빈-활성화 PRP + 24h 혈청)에서 MMP 9 농도를 유의하게 감소시켰다. 시트르산나트륨이 항염증/항이화 성분 제조에서 첨가된 경우 24h 인큐베이션 후의 MMP9 수준이 기준선 수준 (0h)에 비교하여 변화하지 않았다. PRP 성분 성분 내의 MMP9의 기준선 수준을 나타내도록, 트롬빈이 있는 PRP 성분 내의 MMP9 수준을 측정하였다. 이러한 측정은 PRP 성분 생성에서 유의한 양의 MMP9가 생산되지 않는다는 것을 나타낸다.
혈액 인큐베이션 프로세스가 이화유발성 분자 MMP9의 상승에 이른다는 것을 고려하여, 다른 병리학적 분자 작용제, 즉 IL-1β 및 TNF-α의 농도를 인큐베이션된 혈청, 및 항염증/항이화 성분 및 재생 성분이 조합된 최종 생성물 (트롬빈-활성화 PRP + 24h 동안 인큐베이션된 혈액 혈청)에서 테스트하였다. 활성화된 백혈구가 인큐베이션 동안 방출하는 이러한 분자들에 대한 시트르산나트륨의 효과를 테스트하였다. 도 13 및 14에 나타난 바와 같이, IL-1β 및 TNF-α 농도 양쪽 모두가 인큐베이션 시 유의하게 증가하지만, 항염증/항이화 성분 제조에서 시트르산나트륨을 첨가하는 것에 의해 이러한 효과가 효율적으로 차단될 수 있다는 것이 발견되었다.
도 13을 참조로, 이원 ANOVA 테스트는 시트르산나트륨의 존재 하에 약 37℃ 내지 약 39℃에서 24시간 동안 인큐베이션된 혈액 혈청에서, 뿐만 아니라 기존의 생성물 제조 방법 (PRP + 혈청 24h + 염수)과 비교하여 최종 생성물 (PRP + 혈청 24h + 시트르산나트륨 (CA) + 트롬빈)에서 IL-1β 농도의 통계적으로 유의한 감소를 나타냈다. 전반적으로 지칭되는 바와 같이, 최종 생성물 (PRP + 혈청24h + CA + 트롬빈)은 항염증/항이화 성분 및 재생 성분의 조합물이다.
도 14를 참조로, 이원 ANOVA 테스트는 시트르산나트륨의 존재 하에 약 37℃ 내지 약 39℃에서 24시간 동안 인큐베이션된 혈액 혈청에서, 뿐만 아니라 기존의 생성물 제조 방법 (PRP + 혈청 24h + 염수)과 비교하여 최종 생성물 (PRP + 혈청 24h + CA + 트롬빈)에서 TNF-α 농도의 통계적으로 유의한 감소를 나타냈다.
시트르산나트륨을 항염증/항이화 성분에 첨가하는 것이 생체활성 조성물 제조 동안 병리학적 분자 작용제 억제제에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해, TIMP, Il-1ra 및 PDGF 농도를 유사한 조건에서 테스트하였다. 도 15, 16, 및 17에 나타난 바와 같이, TIMP, Il-1ra 및 PDGF 생산에 대한 시트르산나트륨의 음성 효과가 관찰되지 않았다.
도 15를 참조로, 37℃에서의 24h 동안의 인큐베이션 전 (기준선 수준) 및 후의 인간 혈청 샘플, 활성화된 PRP 및 최종 생성물 내의 TIMP2 수준을 비교하였다. 이원 ANOVA 테스트는 시트르산나트륨의 존재 하에 24시간 인큐베이션된 혈청에서, 뿐만 아니라 기존의 생성물 제조 방법 (PRP + 혈청 24h + 염수)과 비교하여 최종 생성물 (PRP + 혈청 24h + CA + 트롬빈)에서 시트르산나트륨이 TIMP 농도를 감소시키지 않았음을 나타냈다.
도 16을 참조로, 이원 ANOVA 테스트는 시트르산나트륨의 존재 하에 24시간 인큐베이션된 혈청에서, 뿐만 아니라 기존의 생성물 제조 방법 (PRP + 혈청 24h + 염수)과 비교하여 최종 생성물 (PRP + 혈청 24h + CA + 트롬빈)에서 시트르산나트륨이 IL-1ra 농도를 감소시키지 않았음을 나타냈다.
도 17을 참조로, 이원 ANOVA 테스트는 24시간 인큐베이션된 혈청에서, 뿐만 아니라 기존의 생성물 제조 방법 (PRP + 혈청 24h + 염수)과 비교하여 최종 생성물 (PRP + 혈청 24h + CA + 트롬빈)에서 시트르산나트륨이 PDGF 농도를 감소시키지 않았음을 나타냈다.
실시예 6 - 무릎 골관절염 관절 통증 증상이 있는 환자의 치료
17명의 환자를 실시예 2에 요약된 바와 같이, 본원에 기술된 방법에 따라 무릎 골관절염 관절 통증의 증상에 대해 치료하였다. 2가지 군의 환자에게 1주일 간격으로 2회 주사하였다. 제1군의 7명의 환자에게는 시트르산나트륨의 부재 하에 제조된 항염증/항이화 성분 (CA-)을 포함하는 생성물을 제공하였다. 제2군의 10명의 환자에게는 시트르산나트륨의 존재 하에 제조된 항염증/항이화 성분 (CA+)을 포함하는 생성물을 제공하였다. 양쪽 치료 모두 어떠한 유해 사례도 초래하지 않았고, 안전하고 효과적인 것으로 확인되었다.
고관절 및/또는 무릎 골관절염 환자의 통증, 경직 및 신체 기능을 평가하기 위한 웨스턴 온타리오 & 맥마스터 대학교 관절염 지수 (WOMAC) 질문지로 환자를 평가하였다. WOMAC 질문지 데이터의 주사 1개월 후의 예비 분석은 각각 도 18a, 18b, 및 18c에서 나타난 바와 같이 시트레이트가 있는 항염증/항이화 성분 (CA+)으로 치료된 환자에서 환자의 통증, 경직 및 일상 활동의 통계적으로 유의한 개선을 나타냈다. 시트레이트가 없는 항염증/항이화 성분 (CA-)으로 치료된 환자 군에서는, 각각 도 18a, 18b, 및 18c에서 나타난 바와 같이 언급된 파라마티 개선의 통계적으로 유의하지는 않지만 양성인 동태가 관찰되었다. 시각 상사 통증 척도 (VAS)의 통계 분석은 도 18d에 나타난 바와 같이 양쪽 군에서 유의한 통증 감소를 나타냈다.
실시예 7 - 만성 염증성 피부 질환
실시예 2의 방법을 중증 건선을 앓고 있는 59세의 여성 환자에서 4주 기간에 걸쳐 수행하였다. 항염증/항이화 성분을 혈소판-풍부 혈장 성분과 조합함으로써 생산된 자가 조성물을 1주일 간격의 자가 조성물의 4회의 개별적인 주사로 여성 환자에게 투여하였다. 치료는 전체 병변 부위의 진피내 주사를 수반하였다. 치료 4주 후에 극적인 시각적 변화가 관찰되었다. 주사 3개월 후에 건선 효과가 근절되면서 결과가 안정적이었다. 도 19는 치료 전의 여성 환자의 팔의 이환 영역의 사진이다. 도 19b는 4차 주사 3개월 후의 여성 환자의 팔의 이환 영역의 사진이다.
항염증/항이화 성분 제조에서의 시트르산나트륨 첨가 및 무첨가로 실시예 2의 방법을 만성 염증성 피부 질환 예컨대 아토피성 피부염 및 만성 상처를 앓고 있는 대상체에서 수행한다. 만성 염증성 피부 질환의 중증도가 감소된다.
실시예 8 - 말, 개 및 낙타
항염증/항이화 성분 제조에서의 시트르산나트륨 첨가 및 무첨가로 실시예 2의 방법을 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직을 앓고 있는 말, 개 및 낙타에서 수행한다. 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직과 연관된 통증의 중증도가 감소된다.
예시적인 실시양태를 참조로 본 발명이 기술되었지만, 본 발명이 이러한 명확한 실시양태에 한정되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 다수의 변형, 변경 및 개조가 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 상기 기술된 본 발명의 특정 실시양태에 이루어질 수 있다. 특허청구범위의 범주는 실시예에 기재된 바람직한 실시양태에 제한되지 않아야 하고, 전체적으로 설명과 일관되는 가장 넓은 해석이 이러한 범주에 제공되어야 한다.
참고문헌
Figure 112017040764452-pct00001
Figure 112017040764452-pct00002
이러한 참고문헌의 내용이 본원에 참고로 포함된다.

Claims (32)

  1. 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열, 만성 퇴행성 관절 병태, 및/또는 염증성 피부 장애를 앓고 있는 포유동물의 치료에 유용한 자가 조성물을 생산하는 방법이며,
    하기 단계를 포함하는, IL-1ra 및 메탈로프로테이나제의 조직 억제제(Tissue Inhibitor of MetalloProteinase) (TIMP)를 포함하는 자가 조성물의 항염증/항이화 성분을 제조하는 단계:
    포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계,
    혈액을 튜브로 전달하는 단계,
    혈액을 37℃ 내지 39℃의 온도에서 24시간 동안 인큐베이션하는 단계,
    혈액을 원심분리하여 혈액을 상청액 성분 및 세포 분획으로 분리하는 단계, 및
    항염증/항이화 성분의 상청액 성분을 수집하는 단계,
    하기 단계를 포함하는, 자가 조성물의 재생 성분을 제조하는 단계:
    포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계,
    혈액을 소정량의 4％ 시트르산을 포함하는 튜브로 전달하는 단계,
    혈액을 원심분리하여 혈액으로부터 혈소판-풍부 혈장 성분을 분리하는 단계, 및
    혈소판-풍부 혈장 성분을 수집하는 단계, 및
    항염증/항이화 성분의 상청액 성분을 혈소판-풍부 혈장 성분과 혼합하여 자가 조성물을 제공하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 튜브가 유리로 만들어진 배큐테이너(vacutainer) 튜브인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 튜브가 폴리스티렌으로 만들어진 배큐테이너 튜브인 방법.
  4. 제1항에 있어서, IL-1ra 및 TIMP를 포함하는 자가 조성물의 항염증/항이화 성분을 제조하는 단계가,
    IL-1ra 생산을 용이하게 하도록 혈액을 Ca++의 존재 하에 배양하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 인큐베이션 단계 전에 멸균 주사기 및 바늘을 사용하여 0.64 내지 0.72 mM Ca++를 포함하는 멸균 염화칼슘 용액을 자가 생리액이 있는 튜브에 직접 첨가하는 것에 의해, 혈액이 상기 멸균 염화칼슘 용액과 9:1 비율로 함께 배양되는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    IL-1ra 생산을 증가시키기 위해 혈액을 포함하는 튜브에 멸균 공기를 첨가하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 혈액을 원심분리하여 혈액을 상청액 성분 및 세포 분획으로 분리하는 단계가 4000 내지 10000 rpm에서 10 내지 20분 동안 수행되는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 혈액을 원심분리하여 혈액을 상청액 성분 및 세포 분획으로 분리하는 단계가 4000 rpm에서 10분 동안 수행되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상청액 성분을 분취량으로 분할하고, 추가 사용을 위해 보관하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상청액 성분을 분취량으로 분할하고, 추가 사용을 위해 동결시키는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 혈액을 소정량의 4％ 시트르산을 포함하는 튜브로 전달하는 단계가 9.5부의 전혈 (9.5 cc):0.5부 (0.5 cc)의 4％ 시트르산의 비를 제공하는 것을 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 혈액을 원심분리하여 혈액으로부터 혈소판-풍부 혈장 (PRP) 성분을 분리하는 단계가 7500 rpm에서 30초 동안 수행되어 PRP 분획이 단리되는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 새로운 혈관 발달을 촉진하기 위해 백혈구 버피 코트(buffy coat) 분획이 추가적인 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor) (VEGF) 공급원으로서 재생 성분에 첨가되는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상청액 성분을 혈소판-풍부 혈장 성분과 혼합하여 자가 조성물을 제공하는 단계가 상청액 성분과 혈소판-풍부 혈장 성분을 1:1 비로 혼합하는 것을 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된, 포유동물에서 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 또는 염증성 피부 장애를 치료하기 위한 자가 조성물.
  17. 포유동물에서 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 또는 염증성 피부 장애를 치료하기 위한 자가 조성물이며,
    항염증/항이화 성분을 포함하고,
    상기 항염증/항이화 성분은 포유동물의 자가 혈액으로부터 수득된 상청액 성분을 포함하고,
    상기 항염증/항이화 성분은 IL-1ra 및 메탈로프로테이나제의 조직 억제제 (TIMP)를 포함하며,
    포유동물로부터 수득된 혈소판-풍부 혈장을 포함하는 재생 성분을 추가로 포함하는
    자가 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 혈소판-풍부 혈장이 IL-4,10,13, PDGF, TGF-β, 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 포함하는 것인 자가 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 항염증/항이화 성분 및 재생 성분을 1:1 비로 포함하는 자가 조성물.
  20. 제17항에 있어서, 재생 성분이 백혈구 버피 코트 분획을 추가로 포함하는 것인 자가 조성물.
  21. 포유동물에서의 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직의 치료에 유용한 자가 조성물을 생산하는 방법이며,
    하기 단계를 포함하는, IL-1ra 및 메탈로프로테이나제의 조직 억제제 (TIMP)를 포함하는 자가 조성물의 항염증/항이화 성분을 제조하는 단계:
    포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계,
    소정량의 시트르산나트륨을 튜브에 첨가하는 단계,
    혈액을 튜브로 전달하는 단계,
    혈액을 37℃ 내지 39℃의 온도에서 24시간 동안 인큐베이션하는 단계,
    혈액을 원심분리하여 혈액을 상청액 성분 및 세포 분획으로 분리하는 단계, 및
    항염증/항이화 성분의 상청액 성분을 수집하는 단계,
    하기 단계를 포함하는, 자가 조성물의 재생 성분을 제조하는 단계:
    포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계,
    혈액을 소정량의 4％ 시트르산을 포함하는 튜브로 전달하는 단계,
    혈액을 원심분리하여 혈액으로부터 혈소판-풍부 혈장 성분을 분리하는 단계, 및
    혈소판-풍부 혈장 성분을 수집하는 단계, 및
    항염증/항이화 성분의 상청액 성분을 혈소판-풍부 혈장 성분과 혼합하여 자가 조성물을 제공하는 단계
    를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 항염증/항이화 성분을 제조하는 단계에서,
    시트르산나트륨이 4％ 시트르산나트륨 용액이고,
    상기 혈액을 상기 튜브로 전달할 때 0.5:9.5의 4％ 시트르산나트륨 용액 대 혈액 비를 제공하도록 시트르산나트륨이 튜브에 첨가되는 것인
    방법.
  23. 포유동물에서 손상되고/되거나 상처를 입은 결합 조직, 만성 건증, 만성 근육 파열 및/또는 만성 퇴행성 관절 병태 또는 염증성 피부 장애를 치료하기 위한 자가 조성물이며,
    하기 단계를 포함하는, IL-1ra 및 메탈로프로테이나제의 조직 억제제 (TIMP)를 포함하는 자가 조성물의 항염증/항이화 성분을 제조하는 단계:
    포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계,
    시트르산나트륨을 튜브에 첨가하는 단계,
    혈액을 튜브로 전달하는 단계,
    혈액을 37℃ 내지 39℃의 온도에서 24시간 동안 인큐베이션하는 단계,
    혈액을 원심분리하여 혈액을 상청액 성분 및 세포 분획으로 분리하는 단계, 및
    항염증/항이화 성분의 상청액 성분을 수집하는 단계,
    하기 단계를 포함하는, 자가 조성물의 재생 성분을 제조하는 단계:
    포유동물로부터 혈액을 수집하는 단계,
    혈액을 소정량의 4％ 시트르산을 포함하는 튜브로 전달하는 단계,
    혈액을 원심분리하여 혈액으로부터 혈소판-풍부 혈장 성분을 분리하는 단계, 및
    혈소판-풍부 혈장 성분을 수집하는 단계, 및
    상기 상청액 성분을 혈소판-풍부 혈장 성분과 혼합하여 자가 조성물을 제공하는 단계
    에 의해 생산되는 자가 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 항염증/항이화 성분을 제조하는 단계에서,
    시트르산나트륨이 4％ 시트르산나트륨 용액이고,
    상기 혈액을 상기 튜브로 전달할 때 0.5:9.5의 4％ 시트르산나트륨 용액 대 혈액 비를 제공하도록 시트르산나트륨이 튜브에 첨가되는 것인
    자가 조성물.
  25. 제17항에 있어서, 항염증/항이화 성분이 시트르산나트륨을 포함하는 것인 자가 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 시트르산나트륨이 4％ 시트르산나트륨 용액인 자가 조성물.
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