KR101313755B1 - 상피조직 또는 피하조직 재생용 자가혈장의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 상피조직 또는 피하조직 재생용 자가혈장의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 전혈로부터 수득되는 혈소판풍부혈장(PRP) 및 혈소판결핍혈장(PPP)으로부터 자가트롬빈(autologous thrombin)이 형성된 혈소판결핍혈장(PPP)을 혼합하여 제조되는 상피조직 및 피하조직 재생을 위한 자가혈장 제조방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 특정장비 없이도 30분 이내로 혈소판결핍혈장(PPP)에서 자가트롬빈을 생성하여 혈소판풍부혈장(PRP)을 활성화시킴으로써 bed side 시술이 가능하여 매우 쉽게 임상에 적용하여 상피조직을 재생하고 피하 결체조직을 복원할 수 있을 뿐만 아니라, 침습성이 덜하고, 시술 시간이 짧으며, 부작용이 거의 없고, 경제적이며, 시술 후 일상 복귀시간을 단축할 수 있어 유용하다.
본 발명은 특정장비 없이도 30분 이내로 혈소판결핍혈장(PPP)에서 자가트롬빈을 생성하여 혈소판풍부혈장(PRP)을 활성화시킴으로써 bed side 시술이 가능하여 매우 쉽게 임상에 적용하여 상피조직을 재생하고 피하 결체조직을 복원할 수 있을 뿐만 아니라, 침습성이 덜하고, 시술 시간이 짧으며, 부작용이 거의 없고, 경제적이며, 시술 후 일상 복귀시간을 단축할 수 있어 유용하다.
Description
본 발명은 상피조직 또는 피하조직 재생용 자가혈장의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 전혈로부터 수득되는 혈소판풍부혈장(PRP) 및 혈소판결핍혈장(PPP)으로부터 자가트롬빈(autologous thrombin)이 형성된 혈소판결핍혈장(PPP)을 혼합하여 제조되는 상피조직 및 피하조직 재생을 위한 자가혈장 제조방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
혈액 내에 존재하는 혈소판의 과립에는 혈소판-유래 성장인자 PDGF(Platelet-Derived Growth Factor), 섬유아세포 성장인자 FGF(Fibroblast Growth Factor), 상피세포성장인자 EGF(Epidermal Growth Factor), 형질전환 성장인자 TGF(Transforming Growth Factor) 등의 여러 성장인자 및 비트로넥틴(vitronectin), 피브로넥틴(fibronectin)과 같은 결합물질들이 있다. 이러한 물질들은 혈소판이 자극을 받아 활성화되면 유출되는 것으로 주변의 지방조직, 콜라겐, 엘라스틴과 같은 결체조직을 재생시키고 줄기세포들의 이동과 분화에 관여하여 상처회복이나 동통완화에 유용하다.
근래 20여 년간 자가 혈소판이 풍부한 혈장을 이용하여 치과 치조골 이식, 통증완화, 정형외과 인대수술 회복, 일반 수술 시 지혈 등의 분야에 많이 이용되어 왔다. 또한 최근에는 이러한 인자들의 증식 및 재생 유도력을 피부 함몰부 복원이나 피부색, 탄력회복에 이용함으로써 부작용없이 피부가 개선되는 효과를 얻을 수 있었다.
인간 또는 동물의 혈장으로부터 유래된 트롬빈은 혈소판 활성화 인자 중 하나로 혈액 응고에 관여한다. 이는 피브리노겐에 작용하여 상기를 피브린으로 전환시키며, 그 결과 피브린 매트릭스(fibrin matrix)를 형성시킨다. 또한 혈소판 세포막에 작용하여 구조적 변화를 지혈제로서 소 트롬빈(bovine thrombin, BT)을 사용하는 것이 임상적으로 통상적인 반면, 인간 혈장-유래 트롬빈은 오직 각종 수술 과정에서 국소 지혈제 및 상처 봉합제로서 인간 혈장-유래 피브린 봉합제(fibrin sealant)와 함께 사용되는 것만이 허용된다.
소 트롬빈(BT)은 수십 년간 외과적 환경에서 임상적인 지혈을 달성하기 위하여 사용되어 왔으며, 이는 인간 혈장으로부터 유래된 피브린 밀폐제를 제조하기 위한 수단으로서 사용되어 왔다. 소 트롬빈은 또한 혈액 은행과 같은 실험실 제조된 동결침전제제 및 자가 또는 동종 혈소판풍부혈장(PRP), 혈소판 농축물(PC) 또는 혈소판결핍혈장(PPP)을 응고시키는데 사용된다.
소 트롬빈의 사용과 관련된 위험으로는 체내에 항트롬빈 항체를 만들어 자가트롬빈을 공격하는 응고장애를 유발할 수 있을 뿐만 아니라 질병이환 가능성의 문제점이 있어, 1980년대 후반부터는 자가트롬빈을 이용한 혈소판 활성화가 증가하고 있다.
현재 국내에서 사용되는 스위스의 리젠(Regen Lab.)은 혈장 분리젤이 들어있는 검사용 튜브에 채혈하여 이를 다시 사용하고, 고유의 원심분리기가 있어야 하며, 혈장용 튜브와 자가트롬빈용 튜브가 별개로 있는데, 이들이 서로 조금이라도 혼합되면 금방 젤화가 되어 사용이 불가하며, 시술시간이 15~20분이 지나면 자가트롬빈용 튜브 내 혈장이 젤화가 되어 사용이 불가하다는 문제점이 있다.
또한, 국내에서 현재 시판되는 CaCl2만을 활성제(activator)로 사용한 Prosys 역시 고유의 원심분리기가 있어야 하고, 검사용 튜브에 채혈하였다 다시 이용하며, 자가트롬빈을 이용하지 못하고 오직 칼슘 이온만을 이용하여 젤화가 충분치 않아 혈소판의 활성화가 제대로 이루어지지 못하므로 결체조직의 분화, 재생력이 부족하여 함몰부 복원 등의 볼륨이 필요한 부위에 사용할 수 없다는 문제점이 있다.
한국등록특허 제855,621호는 회전구동체, 제1저장부 및 제2저장부를 포함하는 저장수단, 여과수단, 첨가수단을 포함하는 자가트롬빈 및 피브리노겐의 제조장치에 관한 것이 개시되어 있는데 이러한 자가트롬빈 생성을 위한 종래의 방법들은 장치 및 단계가 복잡하여 시간이 다소 오래 걸리고 수득량이 적어 임상적으로 활용에 충분치 않은 문제점이 있다.
이에, 본 발명자는 상기 문제점을 해결하기 위하여, 전혈로부터 혈소판 풍부혈장 및 특정 조건하에서 자가트롬빈이 형성된 혈소판 결핍 혈장을 수득하고, 이들을 혼합하여 피부에 주입한 결과, 상피조직 또는 피하조직이 재생되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 상피조직 또는 피하조직 재생용 자가혈장의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 자가혈장을 함유하는 상피조직 또는 피하조직 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 (a) 전혈을 원심분리하여 혈소판풍부혈장(PRP)을 수득하는 단계; (b) 전혈을 원심분리하여 혈소판결핍혈장(PPP)을 수득하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 혈소판결핍혈장(PPP)에 염화칼슘 및 무수에탄올을 혼합하여 실온에 방치한 후, 원심분리하여 자가트롬빈이 안정화된 혈소판결핍혈장(PPP)을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 (a)단계에서 수득된 혈소판풍부혈장(PRP) 및 상기 (c)단계의 혈소판결핍혈장(PPP)을 혼합하는 단계를 포함하는, 상피조직 또는 피하조직 재생용 자가혈장의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조되고, 혈소판 풍부 혈장과 혈소판 결핍 혈장의 비율이 1:0.2~0.4(부피비)인 자가혈장을 함유하는, 상피조직 또는 피하조직 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명은 특정장비 없이도 30분 이내로 혈소판결핍혈장(PPP)에서 자가트롬빈을 생성하여 혈소판풍부혈장(PRP)을 활성화시킴으로써 bed side 시술이 가능하여 매우 쉽게 임상에 적용하여 상피조직을 재생하고 피하 결체조직을 복원할 수 있을 뿐만 아니라, 침습성이 덜하고, 시술 시간이 짧으며, 부작용이 거의 없고, 경제적이며, 시술 후 일상 복귀시간을 단축할 수 있어 유용하다.
도 1은 실시예에 제시된 다양한 조건에 따른 혼합액(a~o)의 시간에 따른 젤화정도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 실시예에 제시된 다양한 조건에 따른 혼합액(a~o)의 23분, 50분 경과 후 젤화정도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 비교예에 제시된 p 및 q의 시간에 따른 젤화정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예에 제시된 혼합액 a~o 및 비교예에 제시된 p~q의 50분 경과 후 젤화정도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 조성물을 임상에 적용하여 피부에 주사하기 전, 후의 비교사진을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예에 제시된 다양한 조건에 따른 혼합액(a~o)의 23분, 50분 경과 후 젤화정도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 비교예에 제시된 p 및 q의 시간에 따른 젤화정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예에 제시된 혼합액 a~o 및 비교예에 제시된 p~q의 50분 경과 후 젤화정도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 조성물을 임상에 적용하여 피부에 주사하기 전, 후의 비교사진을 나타낸 것이다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 전혈을 원심분리하여 혈소판풍부혈장(PRP)을 수득하는 단계; (b) 전혈을 원심분리하여 혈소판결핍혈장(PPP)을 수득하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 혈소판결핍혈장(PPP)에 염화칼슘 및 무수에탄올을 혼합하여 실온에 방치한 후, 원심분리하여 자가트롬빈이 안정화된 혈소판결핍혈장(PPP)을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 (a)단계에서 수득된 혈소판풍부혈장(PRP) 및 상기 (c)단계의 혈소판결핍혈장(PPP)을 혼합하는 단계를 포함하는, 상피조직 또는 피하조직 재생용 자가혈장의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서, '혈소판'이란 혈액의 유형성분인 혈구의 하나로, 골수 내에 있던 거대핵세포(megakaryocyte)로부터 세포질이 갈라져 나온 지름 2~3㎛의 세포 조각으로 혈액의 응고와 지혈작용에 중요한 역할을 한다. 혈관이 손상되어 피부나 점막 등에 출혈이 생겼을 경우 가장 먼저 활성화되는데, 혈소판이 손상된 혈관벽에 붙어 공기와 맞닿게 되면 트롬보키나아제라는 효소의 작용으로 혈장단백질 중 하나인 프로트롬빈을 트롬빈으로 바꾸고, 트롬빈이 다시 피브리노겐을 피브린으로 변화시켜 피브린이 혈액을 응고시키는 복잡한 과정을 거쳐 혈액이 응고되어 지혈작용을 하는 것이다. 이러한 혈소판이 활성화되면 다양한 성장인자 및 재생에 관여하는 인자들이 결체조직으로 방출되어 상피조직 및 피하조직을 재생, 복원시켜 피부가 개선되고, 상처회복 등에 뛰어난 효과를 가진다.
본 발명에서, '혈장' 이란 혈액 속의 유핵세포인 적혈구, 백혈구 등을 제외한 액체성분으로 혈액응고 인자를 가진 담황색을 띠는 중성의 액체이다. 전혈을 항응고제를 넣고 원심분리시키면 위쪽에는 혈장이, 아래쪽에는 유핵혈구 성분으로 나누어지므로 혈장을 수득할 수 있다. 일반적으로, 혈장의 조성은 물이 약 90%, 혈장단백질이 7~8%이고, 그 밖에 지질, 당류, 무기염류와 비단백질성 질소화합물로서 요소, 아미노산, 요산 등이 함유되어 있다.
이러한 혈장은 잘 알려진 통상의 방법, 예를 들면 원심분리, 침강 또는 여과 방법에 따라 혈액으로부터 쉽게 분리할 수 있다. 원심분리는 혈장으로부터 혈액 세포를 침강시키는데 적합한 조건하에서 실시할 수 있다. 예를 들면, 약 1500g force로 약 5~15분 동안 원심분리하는데, 이것은 적혈구 및 백혈구뿐만 아니라 실질적으로 모든 세포 단편을 침전시키는데 충분하다.
혈소판풍부혈장(Platelet Rich Plasma, PRP)은 혈장 내에 혈소판이 많이 함유된 혈장으로, 원심분리기를 이용하여 전혈으로부터 분리된 혈장 하단부의 혈소판이 가장 풍부하게 함유된 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 원심분리는 200~1000g에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있는데, 200g 미만이면 유핵세포인 적혈구나 백혈구의 혼합률이 많아져 혈소판의 유효농도가 적어지고 분리되는 혈장량이 15%이하로 시술시 필요량을 위해선 더 많은 채혈을 해야 한다는 문제가 있고, 1000g을 초과하면 침전되는 혈소판이 증가하여 혈장에 부유하는 혈소판의 유효농도가 감소한다는 문제가 있다.
혈소판결핍혈장(Platelet Poor Plasma, PPP)은 혈소판풍부혈장(PRP)의 원심분리보다 빠른 속도로 원심분리하여 혈장 내에 혈소판이 적은 혈장으로, 이 때문에, 트롬빈 형성에 좋은 조건을 가진다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계 또는 (c)단계의 원심분리는 1000~2000g에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있는데, 1000g 미만이면 혈장에 부유하는 혈소판의 수가 증가하여 트롬빈에 의한 혈소판 활성화 연쇄반응이 진행하여 트롬빈의 농도가 낮아지는 문제가 있고, 2000g을 초과하면 트롬빈을 만들기 위해 관여하는 혈액응고 인자들이 침전되어 효율적인 트롬빈 생성이 어려운 문제가 있다. 이때, (b)단계의 원심분리시 80%이상의 혈소판을 침전시켜 혈소판결핍혈장(PPP)을 수득하게 되고, (c)단계의 원심분리시 피브리노겐을 침전시켜 트롬빈이 안정화된 혈소판결핍혈장(PPP)을 수득하게 되는 것이다.
본 발명에서, 염화칼슘(CaCl2)은 칼슘의 공급원으로 사용되는데 칼슘은 각각의 응고인자가 활성화되는 과정에서 필요하며 혈소판의 활성화에도 주요한 역할을 한다. 즉, 트롬빈이 혈소판 세포막에 작용하여 막의 구조적 변화를 유발하는 과정에도 필요하며 혈소판 세포막이 피브리노겐과 작용할 때, 다른 혈소판 세포막과 접착(adhesion)이 일어나는 과정에서도 칼슘 이온이 필요하다.
본 발명에서, 무수에탄올은 혈소판결핍혈장(PPP)에 염화칼슘을 첨가하여 응고인자를 활성화시켜 트롬빈을 생성하게 한다. 이때, 염화칼슘이 첨가된 혈소판결핍혈장(PPP)에 무수에탄올을 즉시 첨가하여 피브리노겐을 침전시켜 트롬빈이 피브리노겐에 작용하지 못하도록 한다 (Peter R. Morrison, et al ., The solubility of some vertebrate fibronogens in plasma-ethanol mixtures. Biol Bull 101:171-177, 1951).
본 발명에 있어서, 상기 (c)단계의 원심분리된 전혈의 상층액 1cc당 3% 염화칼슘 0.05~0.5cc 및 무수에탄올 0.05~0.5cc를 혼합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 3% 염화칼슘이 0.05cc 미만으로 혼합되면 항응고제를 불활성화시키지 못하며, 0.5cc를 초과하게 되면 혈장이 희석되어 단위 부피당 유효혈소판의 수를 감소시킬 수 있는 현상이 있다. 또한, 무수에탄올이 0.05cc 미만으로 혼합되면 피브리노겐을 침전시키는 정도가 충분치 않아 트롬빈이 피브리노겐에 작용하여 피브린을 형성하게 되므로 트롬빈이 소모되는 문제가 있고, 0.5cc를 초과하여 혼합되면 피부에 시술시 통증이 야기되는 문제가 있다.
특히, 산성도가 pH 7.4에 가까울수록 시술 후 통증이 덜하므로 무수에탄올은 가능한 필요한 최소량만을 사용하는 것이 바람직하므로 혈장 피브리노겐을 90%정도 침전시킬 수 있는 양인 0.05cc/1cc 혈장을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 (c)단계의 실온 방치시간은 5~30분인 것을 특징으로 할 수 있는데, 이때, 방치시간이 5분 미만이면 젤화 속도가 느려 혈소판의 활성화 정도가 약하므로 재생 인자의 유리되는 정도가 낮은 문제가 있고, 30분을 초과하면 과도한 젤화로 인하여 피하에 주사할 수 없어 임상적으로 유용하지 않은 문제점이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d)단계에서 혼합되는 혈소판 풍부 혈장과 혈소판 결핍 혈장의 혼합 비율이 1:0.2~0.4(부피비)인 것을 특징으로 할 수 있는데, 혼합 비율이 1:0.2 미만이면 젤화가 급속히 진행되어 주사가 불가능해 임상적용이 불가능하다는 문제점이 있고, 1:0.4를 초과하면 젤화 속도가 늦고 정도가 낮아 효과적인 임상발현이 힘들다는 문제점이 있다.
상기 혈소판 풍부 혈장과 혈소판 결핍 혈장의 혼합은 손이나 vortex mixing이 가능한 기계 등을 이용하여 10~20초간 흔들어서 혼합한다.
트롬빈이 형성된 혈소판결핍혈장(PPP)이 혈소판풍부혈장(PRP)을 활성화시키는 메커니즘은 다음과 같다.
일반적으로, 혈관이 손상되면 혈관내피세포에서 유리되는 조직인자(tissue factor: TF)가 혈액 내 응고인자 중 하나인 인자(factor) Ⅶa와 결합하여 FⅦa-TF결합체가 되어 Ca++의 존재하에 인자에 작용하여 인자 ⅠⅨ에 작용하여 인자 Ⅸa로 활성화시키고 이는 다시 Ca++의 존재 하에 인자 Ⅹ을 인자 Ⅹa로 활성화시킨다. 이렇게 활성화된 인자 Ⅹa는 역시 Ca++의 존재 하에서 프로트롬빈 Ⅱ가 트롬빈으로 활성화된다. 혈소판결핍혈장(PPP)에서 형성된 트롬빈은 피브리노겐에 작용하여 가용성 피브린 단량체(soluble fibrin monomers)로 만들고 이러한 단량체들이 결합하여 fibrin clot을 형성하게 되고, 또한, 트롬빈은 혈소판에도 작용하여 혈소판막의 GP Iba chain과 인자 ⅩⅠ의 상호작용으로 혈소판 막의 인지질(phospholipid)이 구조적으로 변형이 생겨 혈소판 내부의 물질들이 혈소판막 외부로 나오게 된다. 이때 혈소판 내부에 있는 vWF(von Willebrand factor)도 유리되는데 이는 다시 혈소판 세포막에 작용하여 혈소판을 활성화시킴으로써 혈소판풍부혈장(PRP)을 활성화시키게 되는 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조되고, 혈소판 풍부 혈장과 혈소판 결핍 혈장의 혼합 비율이 1:0.2~0.4(부피비)인 자가혈장을 함유하는, 상피조직 또는 피하조직 재생용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 자가혈장을 함유하는 상피조직 및 피하조직 재생용 조성물을 피부에 주입하게 되면, 활성화된 혈소판, 성장인자가 방출되고, 방출된 성장인자는 결체조직의 재생을 촉진하고 줄기세포의 이동을 유도하여 상처를 치유하거나, 주변에 새로운 혈관 조직을 만들어 피부의 잔주름을 개선하고, 피부탄력과 피부색 개선 등의 피부 재생 효과를 가지게 되는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
자가 혈장의 활성화 시험
실시예
1-1:
혈소판풍부혈장
(
PRP
) 제조
먼저, BD사(Becton Dickinson Vacutainer Systems, Franklin Lakes, N.J.)의 ACD-A(Anticoagulant Citrate-Dextrose Solution, Formula A) 항응고제를 0.9cc 넣은 주사기로 10cc까지 채혈하고, 이를 4개 채혈하여 총 40cc를 채혈하였다. 상기 40cc 중 34cc를 500g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 분리하여 혈소판풍부혈장(Platelet-Rich Plasma, PRP)을 수득하였다.
실시예
1-2:
자가트롬빈이
형성된
혈소판결핍혈장
(
PPP
) 제조
상기 채혈된 40cc에서 혈소판풍부혈장(PRP)을 제조하고 남은 6cc를 1500g에서 5분간 원심분리하고, 상층액을 분리하여 혈소판결핍혈장(Platelet-Poor Plasma, PPP)을 수득하였다. 상기 혈소판결핍혈장(PPP) 1cc 당 3% 염화칼슘 0.1cc 및 100% 무수에탄올 0.1cc를 혼합하여 실온(22~26℃)에 10분간 방치하였다. 그 다음, 상기 혼합액을 1500g에서 3분간 원심분리시켜 상층액을 분리하여 자가트롬빈(autologous thrombin)이 형성된 혈소판결핍혈장(PPP)을 제조하였다.
실시예
1-3:
혈소판풍부혈장(PRP)과
혈소판결핍혈장(PPP)혼합액
제조
실시예 1-1에서 제조된 혈소판풍부혈장(PRP) 1cc 및 실시예 1-2에서 제조된 혈소판결핍혈장(PPP) 0.2~0.4cc를 혼합하여 20초간 세게 흔들어 혼합액을 제조하였다.
실시예
1-4: 다양한 혼합액 제조
실시예 1-3의 혈소판풍부혈장(PRP)과 혈소판결핍혈장(PPP) 혼합액 제조과정에서, 혈소판의 활성화 정도를 다르게 하기 위하여, 상기 혈소판결핍혈장(PPP) 제조시 첨가되는 에탄올의 양, 실온에 방치하는 시간 및 상기 1cc 혈소판풍부혈장(PRP)과 혼합되는 혈소판결핍혈장(PPP)의 양을 하기 [표 1]과 같이 달리하여 다양한 혼합액을 제조하였다.
| 첨가되는 에탄올의 양(cc) | 방치시간(분) | 혼합되는 PPP의 양(cc) | |
| a | 0.05 | 10 | 0.2 |
| b | 0.05 | 10 | 0.3 |
| c | 0.05 | 10 | 0.4 |
| d | 0.05 | 15 | 0.2 |
| e | 0.05 | 15 | 0.3 |
| f | 0.05 | 15 | 0.4 |
| g | 0.1 | 10 | 0.2 |
| h | 0.1 | 10 | 0.3 |
| i | 0.1 | 10 | 0.4 |
| j | 0.1 | 15 | 0.2 |
| k | 0.1 | 15 | 0.3 |
| l | 0.1 | 15 | 0.4 |
| m | 0.15 | 10 | 0.2 |
| n | 0.15 | 10 | 0.3 |
| o | 0.15 | 10 | 0.4 |
실시예
1-5: 혈소판 활성화 측정
실시예 1-4에서 제조된 다양한 혼합액을 이용하여 혈소판 활성화 정도를 측정하였다. 혈소판의 활성화 정도는 응고과정이 진행될 때 볼 수 있는 현상인 혈장의 젤화과정을 움직임의 둔화정도로 수치화한 것으로, 1cc 주사기에 전혈 0.8cc 채취하여 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 공기방울이 이동하는 시간으로 젤화과정을 다음 [표 2]와 같이 등급화하였다.
| 등급 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 시간 | 0~5 | 5~7 | 7~9 | 9초 이상 | 뚜렷한 겔화 | 완벽한 겔화 |
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 혈소판결핍혈장(PPP)에 에탄올과 염화칼슘을 넣어 실온에 방치하여 제조된 자가트롬빈이 형성된 혈소판결핍혈장(PPP)만으로도 혈소판이 풍부한 혈장을 활성화시킬 수 있었다. 또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 혈소판이 활성화되어 혈장이 젤화된 후, 23분, 50분 점검에서 혼합액 j, k, l, m, n, o 가 90% 이상의 젤화를 유지하였다.
또한, 혈소판풍부혈장(PRP)과 자가트롬빈을 안정화시킨 혈소판결핍혈장(PPP)의 혼합 비율도 혼합되는 혈소판결핍혈장(PPP)의 비율이 높을수록 젤화 시간은 빠르나, 혼합하자마자 젤화가 진행되면 피하에 주사할 수 없어 임상적으로 유용하지 않으며, 무수에탄올이 그만큼 더 주입되게 되므로 pH 가 낮아져 시술 후 통증이 심할 수 있다.
따라서 임상시술 시간이 적절한 20분 내외에서 90%이상의 젤화가 진행되는 혈소판결핍혈장(PPP)의 최소량인 0.2cc가 혼합되고, 생리적 pH에 근접할수록 시술시 통증의 정도가 약하므로 90% 이상의 젤화 효율을 나타낸 혼합액 중 에탄올의 농도가 0.1cc로 가장 낮은 검체 j가 임상적으로 가장 바람직한 것으로 나타났다.
비교예
1: 종래 기술과 본 발명에 따른
자가혈장의
비교
혈장만을 사용한 혈소판풍부혈장(PRP) 1cc인 혼합액 p에 염화칼슘 0.1cc를 혼합한 혼합액 q의 시간에 따른 젤화 정도를 관찰하였다 (도 3).
그 결과, 활성화제를 넣지 않은 혼합액 p는 젤화 되지 않는 것으로 나타났고, 염화칼슘만 첨가한 혼합액 q의 젤화 정도는 22%로 나타나, 종래기술에 비하여 본 발명의 방법에 따라 제조된 자가혈장의 젤화의 정도가 현저하게 높은 것으로 나타났다 (도 4).
실험예
1:
자가혈장의
피부재생 임상시험
실시예 1에 제조된 혼합액 j를 제조한 후, 상기 검체 j를 시술이 필요한 피부부위의 2~2.5㎜ 깊이에 0.1~0.3cc 주입하는 시술을 수행하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 그 결과, 검체 j를 시술한 후의 피부가 개선된 것을 육안으로 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 검은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (7)
- 다음 단계를 포함하는 상피조직 또는 피하조직 재생용 자가혈장의 제조방법:
(a) 전혈을 200g 이상 내지 1000g 미만에서 원심분리하여 혈소판풍부혈장(PRP)이 포함된 상층액을 수득하는 단계;
(b) 전혈을 1000g 이상 내지 2000g 이하에서 원심분리하여 혈소판결핍혈장(PPP)이 포함된 상층액을 수득하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 수득된 혈소판결핍혈장(PPP)에 염화칼슘 및 무수에탄올을 혼합하여 실온에서 방치한 후, 원심분리하여 자가트롬빈이 안정화된 혈소판결핍혈장(PPP)이 포함된 상층액을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 (a)단계에서 수득된 혈소판풍부혈장(PRP) 및 상기 (c)단계의 혈소판결핍혈장(PPP)을 1:0.2~0.4(부피비)로 혼합하는 단계.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 (c)단계의 혈소판결핍혈장(PPP) 1cc당 3% 염화칼슘 0.05~0.5cc 및 무수에탄올 0.05~0.5cc를 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (c)단계는 22 내지 26℃의 실온에서 5 내지 30분 동안 방치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 방법으로 제조되고, 혈소판 풍부 혈장과 혈소판 결핍 혈장의 비율이 1:0.2~0.4(부피비)인 자가혈장을 함유하는, 상피조직 또는 피하조직 재생용 조성물.
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|---|---|
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| US20100226909A1 (en) | 2009-03-06 | 2010-09-09 | Biomet Biologics, Llc | Method And Apparatus For Producing Autologous Thrombin |
-
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- 2010-12-09 KR KR1020100125796A patent/KR101313755B1/ko active IP Right Grant
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