JPH02114A - トロンビン凝固性蛋白質の濃縮物、その製造方法及びその治療的用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、トロンビン凝固性蛋白質の濃縮物、全血漿か
らこれを得る方法及び治療を目的としたその用途に関す
る。

この種の濃縮物は、再溶解することにより注射可能なフ
ィブリノゲン又は生物学的膠質（ｂｉｏｌｏｇｔｅａｌ
　ｇｌｕｅｓ）を製造するのに用いられ得る。

周知の如く、フィブリノゲンの注射は、出血を伴うか伴
わない低フィブリノゲン血症又は全身性無フィブリノゲ
ン血症状態の治療を可能とし、さらに重篤な出血を伴う
急性脱線維素症候群の治療をも、病因的治療、ヘパリン
治療又は抗フィブリン溶解治療と併合させて、可能とす
る。

一方、生物学的膠質は、皮膚移植、神経又は動脈縫合、
早期廠痕形成又は止血性及び／又は静菌性及び／又は麻
酔効果が求められるあらゆる用途等のある種の臨床的エ
ピソードにおいて十分に役立つことができる。事実、そ
の様な主要濃縮物の主要成分であるフィブリノゲンは、
カルシウムイオンにより活性化されたトロンビンと接触
する場合、酵素的に分解される。フィブリノペプチドＡ
及びＢを排出した後、フィブリンモノマーが重合し、自
然に可溶性フィブリンを生成する。この種の生成物にお
けるファクターＸＩＩＩの存在は、フィブリンを不溶性
にすることにより、即ち、尿素等の溶媒に対し抵抗性と
することにより、共有結合によるフィブリンの安定化に
寄与する。かくして安定化されたフィブリンは、その凝
固能に加えて、線維素溶解及び機械的トラクチイア（ｔ
　ｒａｃｔ　ｉ　ａ）に対してさらに抵抗性となる。

これらの異なる治療的使用のためには、使用条件下に溶
解性がよく且つ安定性である血症由来の生成物を入手可
能とすることが必要である。生物学的膠質に関する限り
では、石灰性トロンビンと接触して置かれた後、該膠質
が高度な接着性及び高度な弾性を有することが更に必要
である。

この様な特性を得るという事実は、生成物の性質、及び
血漿からのその精製方法に直接的に関連する。従って、
産業的スケールで容易に利用でき、且つ、臨床束による
所望の用途のための生成物の生物化学的特性を損なわな
いように十分に穏やかな方法を得ることが有用である。

フィブリノゲン及びファクターＸＩＩＩを含む膠質は、
特にフランス特許第２４４８９００号及び第２４４８９
０１号において既に公知である。

該膠質は、プラスミノゲン阻害物−活性物又はプラスミ
ン阻害物（これらの物質は、凍結乾燥状態の膠質に存在
する）を含有する緩衝液で処理することにより、血漿寒
冷沈降物から得られる。

上記生成物は、興味深い特性を有する。しかしながら、
これらの生成物は、最終的に良好な混合物を得ることが
できるように、ファクターＸＩＩＩ等の他の血漿蛋白質
の外的添加を必要とする相当複雑なフィブリノゲン製造
法によって得られている。

更に、製造の際、ウシアプロチニンのような動物由来の
プロテアーゼ阻害物質等の阻害物質を添加せねばならな
い。

その上、公知の蛋白質濃縮物は、特に膠質として用いら
れるものは、大気温度では水性溶媒に溶解せず、３７℃
においてさえ溶解しにくいかもしれず、生成物の凍結乾
燥バイアル中に磁石棒を加え、溶解性を促進させるため
に用いられる磁気攪拌機を使用する必要がある。

従って、蛋白質の外的添加を行うことなく、上記の様な
生成物として所望の性質に相当する蛋白質混合物を得る
ことができるように、生物学的膠質を製造できる単純な
方法を得ることが極めて有利である。特に、膠質として
の使用のために、得られた濃縮物は、満足すべきフィブ
リノゲン、ファクターＸＩＩＩ、フィブロネクチン濃度
を持つべきである。

また、その様な方法は、ウィルス不活性化ステップを導
入するための修飾にも容易に適応できるものでなければ
ならない。得られる生成物は、特別の器具を必要とせず
、使用温度（一般に１８−２０℃）で１０分以内に溶解
しなければならない。

また、該生成物は、使用を容易にし、その臨床的効率を
促進し、保証すべく、数時間は安定であらねばならない
。

従って、本発明者は、全ての血液分画センターで入手で
きる血漿分画を用いる方法によって、用いられる簡単な
分画法を通じ、存在する全蛋白質に対して７０％以上の
凝固性フィブリノゲン及び十分量の内在性ファクターＸ
ＩＩＩを含有するトロンビン凝固性蛋白質濃縮物の簡単
な製造方法を完成した。

従って、本発明は、エタノールを用いるヒト又は動物の
血漿の沈澱及び処理によって得られ、全蛋白質に対して
７０重量％以上の凝固性フィブリノゲン及び内在性ファ
クターＸＩＩＩを含有するトロンビン凝固性蛋白質濃縮
物にも関する。

本発明の濃縮物は、公知の物質とは反対に、大気温度に
おいて急速に、即ち、水性媒体中１５０ｇ／ｌにも達す
る蛋白質濃度で１０分以内に溶解する。更に、これを例
えば４−３７℃で保つ場合、再構成の後、少なくとも２
４時間は安定である。

本濃縮物は、蛋白質１ｇ当り内在性ファクターＸＩＩＩ
を少くとも０．１０ＩＵ含有するのが有利である。

更に、該濃縮物は、特に０．０３−０．１０ｇ／　１　
ｇ蛋白質の均等曾のフィブロネクチンを含有する。

注射用フィブリノゲンとするために、再溶解による再構
成後の全蛋白質含量が１７−２９ｇ／ｌ程度となるよう
に、濃縮物を製剤化し、調整する。

生物学的膠質としての用途のためには、該全蛋白質含量
を約１００−１２０ｇ／ｌとする。

本発明の濃縮物は、中性に近いｐＨ及び低温度にて希エ
タノールを用い、寒冷沈降されていない全血漿を沈澱さ
せることにより、得られる。

方法の操作条件は、殆ど変性しない沈澱物が得られる様
に調整され、従って、従来の工業的血漿処理条件下に沈
澱ステップを実施する場合、蛋白質が供される分解を回
避する。従って、払われる注意とは別に、特にエタノー
ル濃度と温度に関する限り、磁石棒を備えた小さい容器
（例えば１０Ｑ）中で血漿を処理することが望ましい。

次いで、血漿を、２４時間以上数日間までの一定期間、
例えば８−１２％の低濃度エタノールと接触させておく
。上清みをデカントし、これを他の派生物の調製に利用
できる。

遠心分離後、得られた沈澱物を、例えば０−６℃の低温
度にて、６−１２％、好ましくは１０％のアルコールで
洗浄し、全体を遠心分離にかける。

次いで、トリス／クエン酸緩衝液に沈澱物を再溶解し、
出来れば濃縮し、濾過し、好ましくは、次の処理に供す
る前に、凍結乾燥する。所望であれば、そのまま、即ち
、非凍結乾燥状態で処理してもよい。

本発明の蛋白質濃縮物を得るための次の処理は、２種の
明確に異なる方法により行うことができる。

第１の方法において、凍結乾燥物又はそれに相当する新
鮮なペーストを、好ましくはリジンを含有する水又はト
リス／クエン酸緩衝液に再溶解し、得られた溶液を温希
エタノールで処理する。

この方法に従って、フィブリノゲン凍結乾燥物又はそれ
に相当する新鮮なペーストを５０ｇ／ｌ程度の蛋白質含
量で再溶解し、３０−４０℃、好ましくは３５℃にて、
約１．５時間、８−１２％エタノールで処理する。好ま
しくはリジンの存在下に実施されるこのステップは、凍
結乾燥された生物学的膠質の良好な溶解に寄与し、一方
、ＡＩＤＳウィルス等の存在しうる病原菌の不活性化に
ついて安全性を増大させる。

用いられるリジンの量により、利用可能な製品中のリジ
ン濃度を０．１−０．２ｇ／Ｉｇ蛋白質とすることがで
きる。

緩衝液を使用する限外濾過又は透析濾過によりエタノー
ルを除去する。該緩衝液は、好ましくは利用可能な製品
中の所望量に相当する量のリジンを含有するが、凝固現
象におけるクエン酸の明らかに有害な作用を考慮すると
、最終生成物におけるクエン酸の濃度が出来るだけ小さ
くなるように、クエン酸を含有しないほうが有利である
。

得られた生成物を無菌濾過し、使用バイアルに充填し、
凍結乾燥する。

第２の方法によれば、凍結乾燥物又はそれに相当する新
鮮なペーストを、再溶解後、ウィルス不活性化ステップ
、例えば、溶媒及び洗浄剤による処理に供する。次に、
この処理による残渣を好ましくは希エタノールを用いた
寒冷沈降によって除去する。

この方法において、フィブリノゲン凍結乾燥物又はそれ
に相当する新鮮なペーストを約２０ｇ／ｌの蛋白質濃度
で再溶解する。次いで、本発明に従って、ウィルス不活
性化処理、例えば、溶媒及び洗浄剤による処理に供する
。

このステップは、好ましくは、２４℃以上で６時間以上
実施され、ＡＩＤＳウィルス、肝炎ウィルス等の存在し
うる病原ウィルスの不活性化について安全性を増加させ
る。これは、利用可能な製品中のリジン濃度０．１−０
．２ｇ／Ｉｇ蛋白質に相当する濃度のリジンの存在下に
実施されることが好ましい。

蛋白質濃縮物の純度の増加を伴うウィルス不活性化剤の
除去は、８−１２％エタノールを用いる低温度での蛋白
質の再沈澱により、実施される。

遠心分離の後、ウィルス不活性化剤及びアルブミン等の
混在蛋白質を上清み中に除去する。所望であれば、沈澱
物をエタノール溶液で再沈澱させることにより、ウィル
ス不活性化剤をより良好に除去できる。

滅菌、濾過及び分散（ｄｌｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）の前
に、沈澱物をトリス／クエン酸／リジン緩衝液に再び溶
解し、限外濾過し、透析濾過する。限外濾過の目的は、
クエン酸及びエタノールの除去並びに蛋白質１ｇ当り０
．１−０．２ｇの一定量のリジン含量を維持することに
ある。

本発明の濃縮物を生物学的膠質として用いる場合、製品
の使用前の膠質の再構成は、１００００ＩＵ／ｍｌのア
プロチニン水溶液によって実施され、得られた溶液を５
００ＩＵ／ｍｌの石灰性トロンビンと混合する。

製品は、ダブルニードルシステム（ｄｏｕｂｌｅｎｅｅ
ｄｌｅ　ｓｙｓｔｅｍ）により調剤された液体の形状（
−方では再構成された生物学的膠質、他方では石灰性ト
ロンビン）又は乾いた形状（粉末）又はスプレーの形で
用いる。

下記に実施例を挙げ、本発明を説明するが、本発明はこ
れに限定されるものではない。

実施例　１ 用いられる血漿は、採血の６時間以内に、血液を遠心分
離して得られ、−３５℃で凍結させる。

濃縮物を製造するために、３７℃で解凍する。次いで、
ｐＨ７，２、蛋白質含量５２ｇ／ｌ、４℃の１０％エタ
ノールを用いて、沈澱させる。混合物を３０分間攪拌し
、次いで、４℃で最小限２４時間放置して、沈降させる
。

エタノール上清液を遠心分離により除去し、特にフィブ
リノゲン及びファクターＸＩＩＩに富んだ沈澱物を回収
する。予め４℃に冷却した１０％エタノール溶液を用い
て、該沈澱物を完全に洗浄し、再度遠心分離にかける。

次いで、沈澱物をトリス／クエン酸緩衝液に再溶解し、
蛋白質濃度１５−２０ｇ／ｌに濃縮し、濾過し、所望で
あれば、凍結乾燥する。

３ｇ／ｌのリジン溶液（最終製品中の蛋白質１ｇ当りの
リジン濃度０．１−０．２ｇに相当する）を用いて、得
られた生成物を５０ｇ／ｌの蛋白質濃度で懸濁状態に戻
す。次いで、３５℃にて１゜５時間１０％エタノールに
よる第二次処理にかける。

クエン酸及びエタノールを除去し、蛋白質含量を例えば
３５ｇ／ｌの適当な値にするために透析濾過した後、濃
縮物を濾過し、無菌下に調整し、例えば、０．５．１．
２、又は５ｍｌ溶液としての以後の使用のための最終バ
イアル中で凍結乾燥させる。

Ｂ、蛋白質濃縮物の生化学的分析 生成物の蛋白質組成は、下記のとおりである（蛋白質１
ｇ当りで表す）： フィブリノゲン　　　　　　０．７０−０．７５　ｇ内
在性フｙ　’７　ター　Ｘ　ｍ　　　　Ｏ，１０−０，
２５ＩＩＪフィブロネクチン　　　　　０．０５−０．
１０　ｇ実施例　２ Ａ、蛋白質濃縮物の生成 用いられる血漿は、採血の６時間以内に、血液を遠心分
離して得られ、−３５℃で凍結させる。

濃縮物を製造するために、３７℃で解凍する。次いで、
ｐＨ７，２、蛋白質含量５２ｇ／ｌ、４℃の１０％エタ
ノールを用いて、沈澱させる。混合物を３０分間攪拌し
、次いで、４℃で最小限２４時間放置して、沈降させる
。

エタノール上清液を遠心分離により除去し、特にフィブ
リノゲン及びファクターＸＩＩＩに富んだ沈澱物を回収
する。予め４℃に冷却した１０％エタノール溶液を用い
て、該沈澱物を完全に洗浄し、再度遠心分離にかける。

次いで、沈澱物をトリス／クエン酸緩衝液に再溶解し、
蛋白質濃度１５−２０ｇ／ｌに濃縮し、濾過し、所望で
あれば、凍結乾燥する。

リジン溶液（最終生成物中の蛋白質１ｇ当りのリジン濃
度０．１−０．２ｇに相当する）を用いて、得られた生
成物を約２０ｇ／ｌの蛋白質濃度の懸濁状態に戻す。次
いで、２４℃以上で６時間以上、０．３％ＴＮＢＰ及び
１％Ｔｗｅｅｎ８０を用いる溶媒及び洗浄剤による処理
に供する。

次いで、得られる溶液を４℃で１０％エタノールによる
アルコール沈澱に供し、約１０時間デカントさせる。

遠心分離し、上清み（ウィルス不活性化剤を含有するこ
ともある）を除去した後、沈澱物を回収し、蛋白質１ｇ
当りのリジン０．１−０．２ｇに相当するリジンを含有
するトリス／クエン酸緩衝液に溶解する。

イオン強度を調節し、クエン酸及びエタノールを除去し
くしかし、リジンは保持する）、蛋白質含量を例えば３
５ｇ／ｌの適当な値にするための透析濾過した後、濃縮
物を濾過し、無菌下に調整し、０．５．１．２、又は５
ｍｌ溶液としての以後の使用のための最終バイアル中で
凍結乾燥させる。

Ｂ、蛋白質濃縮物の生化学的分析 生成物の蛋白質組成は、下記のとおりである（蛋白質１
ｇ当りで表す）： フィブリノゲン　　　　　　０．９０−０．９５　ｇ内
在性ファクターＸｍ　　　　Ｏ，１５−０，３０ＩＵフ
イブロネクチン　　　　　０．０３−０．０６　ｇ添付
の図面は、本発明の上記の濃縮物（カーブ１ａ）及び生
物学的膠質として利用されている市販濃縮物（カーブ１
ｂ−１ｄ）から各々得られた電気泳動法による分析結果
を示す。

本発明の生成物のゾーンγ（フィブリノゲン）の成分の
著しく高い純度が、これらのカーブから明らかである。

上記のごとく、本発明の濃縮物は、優れた溶解性及び安
定性を持つ。

事実、その溶解時間は、特別な機器を必要とせず、単純
な手動の回転運動により、３７℃ばかりか２０℃におい
ても、１０分以下、５分でさえある。

更に、４℃、２０℃又は３７℃に２４時間保たれた再構
成生成物においても、膜安定化（ｄｅｓｔａｂｌｌｉｚ
ａｔｉｏｎ　）はみられない。

本発明の生物学的膠質に関する限り、そのまま使用して
も、優れた特性を有するものと考えることができる。事
実、その接着能力は、動物に皮膚切片を接着させる試験
において、１００ｇ／ｃＪ以上であり、その値は寒冷沈
降法により製造された他の膠質で得られたものよりも大
きい。この接着能力は、生物学的膠質を再構成し、４℃
又は２０℃で２４時間保存した後、数値の９０％で維持
される。その上、蛋白質濃縮物と石灰性トロンビンとを
混合する間、滲出をみない。実施された臨床試験は、こ
の生物学的膠質の使用上の制約、即ち、迅速な溶解の必
要性、手術室温度での安定性、使用の遅延可能性に対す
る大きな適応性を明らかにした。

本発明の膠質の用途は、その特性から以下のとおりであ
る：その接着及び止血能力により、外科的手術において
、その手術時間の延長を可能とする貴重なアジュヴアン
トとして用いられる。更に、その静菌能力は、傷又は縫
合部の廠痕形成を増強し、促進する。

従って、その用途は、種々の外科領域に応用されるニ ー形成外科術及び顕微外科術：火傷の皮膚移植、切片の
膠着、しわ延ばし術、眼瞼形成術。

−神経外科術：形成外科術、硬膜縫合、腫瘍切除止血（
ｔｕｍａｒａｌ　ｅｘｅｒｅｓｉｓ　ｈｅｍｏｓｔａｓ
ｉｓ　）　、静脈洞止血。

一心臓血管外科術二人工血管の縫合の封鎖、大動脈切開
、動脈瘤。

一一般及び腹腔外科術：内臓裂の膠着（碑臓、腎臓、肝
臓等）又は肝臓バイオプシー、消化器の吻合、フィステ
ル、手術腔の止血。

一骨格外科術：皮質接着、鍵の縫合、骨髄炎シ−ト（ｓ
ｅａｔ）の接着。

口腔外科術：出血危険性の高い（血友病）患者における
抜歯シートの止血。

一耳鼻咽喉外科術：鼓膜の傷の修復、扁桃摘出。

本発明の膠質は、ヒト又は動物の血漿から製造すること
ができ、ヒト又は動物の治療に有利に用いることができ
る。

本発明の注射用フィブリノゲンに関する限り、優れた使
用特性を有し、そのバランスされた組成は、低フィブリ
ノゲン血症又は無フィブリノゲン血症状態の治療及び急
性脱線維素症候群の治療に有用な貴重な治療剤となる。

全身的欠乏症について、通常の投与量は、フィブリノゲ
ンの半減期が３−４日であり、十分な止血に要求される
血漿中濃度が約１ｇ／ｌであることを考慮する場合、患
者の体重に応じて１−４ｇである。

急性脱線維素症状において、状況に応じて、投与量は２
−１０ｇの範囲で変化する。

本発明の治療用生成物は、ヒトまたは動物の血漿から生
成され、従って、ヒト用ばかりか動物用医薬品への適応
についても利益がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の濃縮物（カーブｌａ）及び生物学的
膠質として利用されている市販濃縮物（カーブ１ｂ−１
ｄ）から各々得られた電気泳動法による分析結果を示す
。 （以　上） 代理人　弁理士　三　枝　英　二 区 一 ト Ｉｆト υ１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）７０％以上の凝固性フィブリノゲンを含有し、内
   在性ファクターＸIIIを含有し、大気温度にて約１５０
   ｇ／ｌ蛋白質濃度まで水性溶媒に急速に溶解することを
   特徴とするトロンビン凝固性蛋白質濃縮物。 （２）蛋白質１ｇ当り、少くとも０．１０ＩＵの内ター
   ＸIII及び０．３５ｍｇ以下のアルブミンを含有する請
   求項１に記載の濃縮物。 （３）蛋白質１ｇ当り０．０３−０．１０ｇのフィブロ
   ネクチンを含有する請求項１又は２に記載の濃縮物。 （４）請求項１乃至３のいずれかに記載の濃縮物から得
   られる注射用フィブリノゲン。 （５）蛋白質含有量が１７−２０ｇ／ｌである請求項４
   に記載の注射用フィブリノゲン。（６）請求項１乃至３
   のいずれかに記載の濃縮物から得られる生物学的膠質。 （７）蛋白質含有量が１００−１２０ｇ／ｌである請求
   項６に記載の生物学的膠質。 （８）希エタノールを用いて全血漿を低温沈澱させる工
   程を含む請求項１乃至３のいずれかに記載の濃縮物の製
   造方法。 （９）１０％エタノールを用い、ｐＨ７．２、４℃にて
   、少くとも２４時間、全血漿を沈澱させる請求項８に記
   載の製造方法。 （１０）沈澱物をリジンの存在下に再溶解する請求項８
   又は９に記載の製造方法。 （１１）最終生成物物中のリジン含量が蛋白質１ｇ当り
   ０．１−０．２ｇに相当する量となるリジンを添加する
   請求項１０に記載の製造方法。 （１２）再溶解した沈澱物を３０−４０℃で希エタノー
   ルで処理する請求項８乃至１１のいずれかに記載の製造
   方法。 （１３）７０−７５％のフィブリノゲン、及び蛋白質１
   ｇ当り０．１０−０．２５ＩＵの内在性ファクターＸI
   II及び０．０５−０．１０ｇのフィブロネクチンを含有
   する、請求項１２に記載の方法により得られるトロンビ
   ン凝固性蛋白質濃縮物。 （１４）請求項１３に記載の濃縮物から得られる注射用
   フィブリノゲン。 （１５）請求項１３に記載の濃縮物から得られる生物学
   的膠質。 （１６）再溶解した沈澱物をウィルス不活性化処理に供
   する請求項８乃至１１のいずれかに記載の製造方法。 （１７）ウィルス不活性化処理が溶媒及び洗浄剤を用い
   る処理である請求項１６に記載の製造方法。 （１８）ウィルス不活性化処理の後に希エタノールを用
   いる低温沈澱処理を行う請求項１６又は１７に記載の製
   造方法。 （１９）１０％エタノールを用い、４℃にて約１２時間
   沈澱させる請求項１８に記載の製造方法。 （２０）９０−９５％のフィブリノゲン、及び蛋白質１
   ｇ当り０．１５−０．３０ＩＵの内在性ファクターＸI
   II及び０．０３−０．０６ｇの内因性フィブロネクチン
   を含有する請求項１８又は１９に記載の製造方法により
   得られるトロンビン凝固性蛋白質濃縮物。 （２１）請求項２０に記載の濃縮物から得られる注射用
   フィブリノゲン。 （２２）請求項２０に記載の濃縮物から得られる膠質。