NO174929B - Fremgangsmåte for fremstilling av et lett opplöselig konsentrat av trombinkoagulerbare proteiner - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et lett oppløselig konsentrat av trombinkoagulerbare proteiner avledet fra plasma, omfattende hovedsakelig fibrinogen og faktor XIII.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene.

Denne type konsentrat kan anvendes for ved fornyet oppløsning å oppnå et injiserbart fibrinogen eller et biologisk "lim".

Det er kjent at injeksjoner av fibrinogen gjør det mulig å behandle hypofibrinogese eller konstitusjonelle afibrinogese-tilstander, med eller uten blødninger, og også de akutte defibrinasjonssyndromer med alvorlige blødninger, i assosia-sjon med etiologisk behandling, heparinterapi og antifibrino-lytika.

På den annen side gjør biologiske lim det mulig å gi effektiv hjelp under visse kliniske forhold som f.eks. hudtransplanta-sjon, nerve- eller arteriesuturer, hurtig arrdannelse eller en hvilken som helst anvendelse hvor det søkes en hemostatisk og/eller bakteriostatisk og/eller estetisk effekt. Fibrono-gen, som er en hovedbestanddel i et slikt konsentrat, undergår en enzymatisk nedbrytning i kontakt med trombin aktivert med kalsiumioner. Etter fjernelse av fibrinopeptidene A og B polymeriserer fibrinmonomerene og utvikler spontant oppløselig fibrin. Nærværet av faktor XIII i denne type produkt bidrar til å stabilisere fibrinet ved kovalente bindinger ved å gjøre det uoppløselig, dvs motstandsdyktig overfor løsningsmidler, f.eks. urea. Fibrinet stabilisert på denne måte er i tillegg til sin rolle som koaguleringsmiddel mer motstandsdyktig mot fibrinolyse og mekanisk påkjenning.

For disse forskjellige terapeutiske anvendelser er det nød-vendig å ha adgang til et produkt med plasmaopprinneIse med god oppløselighet og som er stabilt under bruksbetingelsene. I den utstrekning det dreier seg om biologiske lim, er det ytterligere nødvendig for disse at de etter å være anbragt i kontakt med kalsiumtrombinet, har en høy klebeevne og høy elastisitet.

Oppnåelse av disse egenskaper henger faktisk direkte sammen med produktets natur og således fremgangsmåten for rensing av dette ved å gå ut fra plasma. Det er da nyttig å ha en frem-stillingsteknikk som er lett å gjennomføre i industriell målestokk, men som også er tilstrekkelig mild slik at de biologiske egenskaper av produktet for den kliniske anvendelse ikke nedsettes.

Lim som inneholder fibrinogen og faktor XIII er tidligere kjent, særlig fra FR-PS 2.448.900 og 2.448.901. Disse produkter oppnås fra plasmakryopresipitat ved behandling med en bufferoppløsning inneholdende plaminogen inhibitoraktivator eller plasmininhibitor, som er tilstede i limet i den fryse-tørkede tilstand.

Disse produkter har interessante egenskaper. Disse produkter oppnås imidlertid under anvendelse av ganske kompliserte fibrinogenproduksjonsmetoder som for å føre til en tilfredsstillende sluttblanding, krever ekstra tilsetning av andre plasmaproteiner som f.eks. faktor XIII. Under fremstilling må imidlertid inhibitorer tilsettes som f.eks. protease inhibitorer av animalsk opprinnelse som f.eks. bovint aprotinin.

De kjente proteinkonsentrater, særlig dem som anvendes som lim, vil imidlertid ikke oppløses i et vandig medium ved vanlig temperatur og kan endog være vanskelig å oppløse ved 37°C, og dette gjør det nødvendig å tilføre frysetørkings-glasset for produktet en magnetisert stav og tilveiebringe et magnetisk røreverk som anvendes for påskyndelse av oppløselig-gj øringen.

Det ville da være ganske fordelaktig å ha tilgjengelig en enkel metode for fremstilling av biologisk lim slik at man uten ekstra tilsetning av proteiner kunne oppnå en protein-blanding tilsvarende de ønskede egenskaper for et slikt produkt. For bruk som lim, bør det oppnådde konsentrat spesielt ha tilfredsstillende innhold av fibrogen, faktor XIII og fibronektin.

Angjeldende fremgangsmåte må også lett kunne tilpasses modi-fikasjoner for innføring av et viralt inaktiveringstrinn. Det resulterende produkt bør oppløses i løpet av mindre enn ti minutter ved brukstemperaturen (18 - 20°C) uten å kreve spesielle verktøy. Produktet bør også være stabilt i flere timer slik at bruken lettes og den kliniske virkning garan-teres .

Oppfinnelsen har tilveiebragt en enkel fremgangsmåte for fremstilling av et trombinkoagulerbart proteinkonsentrat som ved den anvendte enkle fraksjoneringsmetode inneholder mer enn 70 % av koagulerbart fibrinogen i forhold til hele mengden tilstedeværende proteiner, og en tilfredsstillende mengde endogen faktor XIII ved hjelp av en teknikk som anvender en plasmafraksjon tilgjengelig i alle fraksjoneringsanstalter.

Oppfinnelsen vedrører således en fremgangsmåte for fremstilling av et lett oppløselig konsentrat av trombinkoagulerbare proteiner avledet fra plasma, omfattende hovedsakelig fibrinogen og faktor XIII, som er kjennetegnet ved følgende trinn: a) utfelling av total plasma som ikke har vært underkastet kryopresipitering, ved hjelp av en 10 % vandig etanol-løsning, ved 4°C og pH 7,2, i en periode på minst 24

timer,

b) fjernelse av supernatanten og vasking av utfellingen med

10 % etanol ved 4°C,

c) utfellingen bringes på nytt i oppløsning i nærvær av lysin ved en konsentrasjon tilsvarende et innhold i

sluttproduktet på fra 0,1 - 0,2 gpr. g proteiner,

d) en viral inaktiveringsbehandling gjennomføres i samsvar med en konvensjonell løsningsmiddeldetergentmetode, e) et annet utfellingstrinn foretas ved hjelp av 10 % etanol, f) fjernelse av supernatanten og utfellingen bringes på nytt i oppløsning i nærvær av lysin, som under trinn c),

hvoretter det foretas diafiltrering, innfylling i flasker og frysetørking.

Oppfinnelsen vedrører således en fremgangsmåte for fremstilling av et trombinkoagulerbart proteinkonsentrat oppnådd ved utfelling og behandling av humant eller animalsk plasma med etanol, som fordelaktig inneholder mer enn 70 vekt% koagulerbart fibrinogen i forhold til totale proteiner og endogen faktor XIII.

Dette konsentrat, i motsetning til de hittil kjente prepa-rater, oppløses hurtig i et vandig medium ved vanlig temperatur i løpet av mindre enn ti minutter med et proteininnhold som kan nå 150 g/l. Videre forblir det stabilt etter rekonstitusjon i minst 24 timer når det holdes ved en temperatur mellom f.eks. 4 og 37°C.

Dette konsentrat inneholder fordelaktig minst 0,10 IU endogen faktor XIII pr. gram proteiner.

Det inneholder videre en avpasset mengde fibronektin, spesielt mellom 0,03 og 0,10 g/gram proteiner.

For bruk som injiserbart fibrinogen blir konsentratet sammen-satt og behandlet slik at det etter rekonstitusjon ved fornyet oppløseliggjøring får et totalt proteininnhold på 17 - 2 9 g/l. For bruk som biologisk lim vil dette innhold være mellom omtrent 100 og 120 g/l.

Konsentratet fremstilt i samsvar med oppfinnelsen oppnås ved hjelp av en fremgangsmåte omfattende et trinn for utfelling med fortynnet etanol, med pH nær nøytralitet og ved en lav temperatur, av et totalt plasma som ikke har vært underkastet kryopresipitering.

Arbeidsbetingelsene ved fremgangsmåten innstilles slik at det oppnås et bunnfall som er lite denaturert, slik at man unngår de nedbrytninger som proteinene ville utsettes for hvis utfel-lingstrinnet foregikk under konvensjonelle industrielle plasmabehandlingsbetingelser. Bortsett fra de tatte forholds-regler, særlig med hensyn til etanolkonsentrasjonen og tempe-raturen, blir plasmaet således foretrukket behandlet i små beholdere (f. eks 10 liter) utstyrt med magnetiserte staver. Plasmaet blir så anbragt i kontakt med den lave konsentrasjon av etanol, f.eks. fra 8 - 12 %, i en tid som kan utgjøre flere døgn og i alle fall minst 24 timer. Supernatanten blir så dekantert og er tilgjengelig for fremstilling av andre derivater.

Det bunnfall som oppnås etter sentrifugering vaskes med etanol, fremdeles ved en lav temperatur, f.eks. mellom 0 og 6°C, og med 8 - 12 % alkohol, og hele blandingen sentrifugeres .

Bunnfallet blir så oppløseliggjort pånytt i en Tris/citrat-buffer, eventuelt konsentrert, filtrert og foretrukket frysetørket før etterfølgende behandling. Om nødvendig kan det behandles direkte, dvs i ikke-frysetørket tilstand.

Den etterfølgende behandling for oppnåelse av et proteinkonsentrat kan gjennomføres i to utførelsesvarianter.

Ved den første variant blir det frysetørkede produkt eller den tilsvarende friske pasta oppløseliggjort pånytt i vann eller Tris/citratbuffer som fordelaktig inneholder glycin og opp-løsningen behandles med varm fortynnet etanol.

I samsvar med denne variant blir det fibrinogenholdige frysetørkede produkt eller den tilsvarende friske pasta oppløseliggjort på nytt ved et proteininnhold på omtrent 50 g/l og underkastet behandling med 8 - 12 % etanol, ved en temperatur mellom 30 og 40°C, og foretrukket 35°C og i en tid på omtrent halvannen time. Dette trinn som foretrukket gjennomføres i nærvær av lysin bidrar til korrekt oppløselig-gjøring av det frysetørkede biologiske lim, som tilveiebringer økt sikkerhet med hensyn til inaktivering av mulige patogene virus, inklusive AIDS-virus.

Mengden anvendt lysin gjør det mulig f.eks. å ha en konsentrasjon på 0,1 - 0,2 g/gram proteiner i det bruksferdige produkt.

Etanolen fjernes ved ultrafiltrering eller diafiltrering mot en buffer som foretrukket inneholder en mengde lysin tilsvarende, den ønskede mengde i det bruksferdige produkt, men fordelaktig uten citrat slik at konsentrasjonen av denne forbindelse i sluttproduktet er den lavest mulige under hensyn-tagen til dets mulige skadelige virkning i forbindelse med koagulasjon. Det anvendes f.eks. Tris/NaCl-lysinbuffer.

Produktet blir så filtrert i en steril atmosfære, helt inn i sin bruksflaske og frysetørket.

Ved den annen variant blir det frysetørkede produkt, eller den tilsvarende friske pasta, etter fornyet oppløseliggjøring underkastet et viralt inaktiveringstrinn, f.eks. behandling med løsningsmiddel og detergent. Restene fra denne behandling blir så fjernet, foretrukket ved hjelp av et utfellingstrinn under anvendelse av kald fortynnet etanol.

Ved denne variant blir det fibrinogenholdige frysetørkede produkt, eller den tilsvarende friske pasta, oppløseliggjort med et proteininnhold på omtrent 20 g/l. Det blir så underkastet en viral inaktiveringsbehandling f.eks. ved behandling med løsningsmiddel og detergent. Dette trinn, som fordelaktig gjennomføres ved temperatur over 24°C og i en tid på mer enn seks timer, gir økt sikkerhet med hensyn til inaktivering av mulige patogene virus inklusive AIDS-virus og hepatittvirus. Det gjennomføres foretrukket i nærvær av lysin ved en konsentrasjon tilsvarende et lysininnhold i det bruksferdige produkt på omtrent 0,1 - 0,2 g/gram proteiner.

Fjernelse av de virale inaktiveringsmidler samtidig med økningen i renheten av proteinkonsentratet tilveiebringes ved fornyet utfelling av proteinene ved en lav temperatur under anvendelse av 8 - 12 % etanol. Etter sentrifugering blir de virale inaktiveringsmidler og de forurensende proteiner som f.eks. albumin faktisk eliminert i supernatanten. Om nødven-dig kan utfellingen på nytt anbringes kontakt med etanolop-pløsningen slik at det tilveiebringes bedre fjernelse av de virale inaktiveringsmidler.

Utfellingen blir på nytt oppløseliggjort i en Tris/citrat/- lysinbufferoppløsning og deretter ultrafiltrert og diafiltrert før steriliseringsfiltrering og fordeling. Formålet med ultrafiltrering er å fjerne etanolen såvel som citratet, men også å opprettholde et konstant lysininnhold på 0,1 - 0,2 g pr. g proteiner.

Når konsentratet i samsvar med oppfinnelsen tjener som et biologisk lim blir rekonstitueringen av limet før bruk av produktet tilveiebragt ved hjelp av en vandig aprotininopp-løsning i en mengde på 10.000 IU/ml, idet den resulterende oppløsning blandes med kalsiumtrombin i en mengde på

500 IU/ml.

Produktet anvendes enten i flytende form tilført ved hjelp av et dobbelt nålesystem (rekonstituert biologisk lim på den ene side og kalsiumtrombin på den annen side) eller i tørr form (brukt som et pulver) eller ved hjelp av et forstøvnings-system.

De etterfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

A. Fremstilling av proteinkonsentratet

Det anvendte plasma oppnås ved sentrifugering av blod og fryses til -25°C innen seks timer etter blodoppsamlingen. For fremstillingen av konsentratet blir det tint til 37°C. Det utsettes så for utfelling med 10 % etanol med pH 7,2, et proteininnhold på 52 g/l og en temperatur på 4°C. Blandingen omrøres i 30 minutter og får så avsette seg i en tid på minst 24 timer ved 4°C.

Etanolsupernatanten fjernes ved sentrifugering, og bunnfallet, som er særlig rikt på fibrinogen og faktor XIII, isoleres. Utfellingen vaskes grundig med en 10 % oppløsning av etanol foravkjølt til 4°C og sentrifugeres på nytt.

Utfellingen blir så oppløseliggjort på nytt under anvendelse av en Tris/citratbufferoppløsning og deretter konsentrert til 15 - 20 g/l proteiner, filtrert og om nødvendig frysetørket.

Det resulterende produkt blir så på nytt tilbakeført i suspensjon i en mengde på 50 g/l proteiner under anvendelse av en 3 g/l lysinoppløsning (tilsvarende et lysininnhold i sluttproduktet fra 0,1 - 0,2 g/gram proteiner) og deretter underkastet en annen behandling med 10 % etanol, i halvannen time ved 3 5°C.

Etter diafiltrering for fjernelse av citrat og etanol og for å bringe proteininnholdet til den passende verdi, f.eks. 35 g/l, blir konsentratet filtrert, anordnet i en steril atmosfære og frysetørket i det endelige glass for etterfølgende bruk som f.eks. en 0,5, 1, 2 eller 5 ml oppløsning, ved brukstidspunktet .

B. Biokjemisk analyse av proteinkonsentratet Proteinsammensetningen av produktet er følgende (uttrykt pr. gram proteiner):

EKSEMPEL 2

A. Fremstilling av proteinkonsentratet

Det anvendte plasma oppnås ved sentrifugering av blod og fryses til -35°C innen seks timer etter blodoppsamlingen. For fremstilling av konsentratet tines dette til 37°C. Det underkastes så utfelling ved 10 % etanol med pH 7,2, et proteininnhold på 52 g/l og en temperatur på 4°C. Blandingen omrøres i 30 minutter og får så avsette seg i en tid på minst 24 timer ved 4°C.

Etanolsupernatanten fjernes ved sentrifugering og utfellingen, som er særlig rik på fibrinogen og faktor XIII, isoleres. Utfellingen vaskes grundig med 10 % oppløsning av etanol avkjølt til 4°C og sentrifugeres på nytt.

Utfellingen ..blir .så bragt tilbake i oppløsning, under anvendelse av en Tris/citratbufferoppløsning, deretter konsentrert til 15 - 20 g/l proteiner, filtrert og om nødvendig fryse-tørket .

Det resulterende produkt blir så bragt tilbake i suspensjon med et innehold på omtrent 2 0 g/l proteiner under anvendelse av en lysinoppløsning tilsvarende et lysininnhold i sluttproduktet på 0,1 - 0,2 g/gram proteiner og blir deretter underkastet behandling med løsningsmiddel og detergent med 0,3 % TNBP og 1 % "Tween 80" i en tid på mer enn seks timer og ved en temperatur på over 24°C.

Oppløsningen blir så underkastet alkoholutfelling under anvendelse av 10 % etanol ved 4°C og settes bort for avsetning i omtrent tolv timer.

Etter sentrifugering og fjernelse av supernatanten (som kan inneholde virale inaktiveringsmidler) blir utfellingen isolert og deretter oppløseliggjort under anvendelse av en Tris/- citratbuffer inneholdene lysin i en mengde tilsvarende 0,1 - 0,2 gram lysin pr. gram proteiner.

Etter diafiltrering for innstilling av ionestyrken, fjernelse av citratet og etanolen (men beholdelse av lysinet) og ved å bringe proteininnholdet til en passende verdi, f.eks. omtrent 35 g/l, blir konsentratet filtrert, anordnet i en steril atmosfære og frysetørket i det endelige glass for etter-følgende bruk som en 0,5, 1, 2 eller 5 ml oppløsning ved brukstidspunktet.

B. Biokjemisk analyse av proteinkonsentratet Proteinsammensetningen av produktet er følgende (uttrykt pr. gram proteiner):

Det vedføyde figurark viser resultatene av analyse ved elektroforese oppnådd for dette konsentrat (kurve la) hen-holdsvis for kommersielle konsentrater anvendt som biologiske lim (kurve lb - ld) .

Den vesentlig større renhet i bestandeler i sone y (fibrinogen) av produktet fremstilt i samsvar med oppfinnelsen går klart frem fra disse kurvene.

Som nevnt i det foregående har konsentratet fremstilt i samsvar med oppfinnelsen utmerket oppløselighets- og stabili-tetsegenskaper .

Oppløselighetstiden er faktisk mindre enn ti minutter, endog fem minutter, ikke bare ved 37°C, men også ved 20°C, uten særlig apparatur og ved anvendelse av enkel manuell rotasjons-bevegelse.

Videre iakttas ingen destabilisering av det rekonstituerte produkt holdt ved 4°C, 20°C eller 37°C i en periode på 24 timer.

Med hensyn til et biologisk lim fremstilt i samsvar med oppfinnelsen, kan det sees at dette har utmerkede egenskaper for bruk som sådan. Dets klebeevne er faktisk 100 g/cm<2 >uttrykt ved testen med å klebe hudstrimler på dyr, og dette er en verdi større enn dem som oppnås med andre lim fremstilt fra kryopresipitater. Denne klebeevne opprettholdes med 90 % av sin verdi etter rekonstituering av det biologiske lim og kon-servering i 24 timer ved 4°C eller 20°C. Videre iakttas ingen eksudasjon under blanding av proteinkonsentratet med kalsiumtrombinet. Kliniske tester som er gjennomført har vist den bedre egnethet for dette lim overfor bruksbegrensninger, nemlig behov for hurtig oppløsning, stabilitet med tempera-turer i operasjonsrom og muligheter for forsinket anvendelse.

Anvendelse av limet fremstilt i samsvar med oppfinnelsen følger fra dets egenskaper, idet dets klebende og hemostatiske evne gjør det til .et . verdifullt hjelpemiddel-ved-kirurgiske operasjoner hvorunder det sikrer en gevinst i operasjonstid. Videre forsterker og påskynder dets bakteriostatiske evne arrdannelsen av sår og suturer.

Dets anvendelse vedrører således meget varierte kirurgiske områder, nemlig plastisk kirurgi og mikrokirurgi, hudtrans-plantasjon ved forbrenninger, liming av strimler, løfting, blefaroplasti, videre nevrokirurgi, plastisk kirurgi og dura mater sutur, tumoral ekseresehemostase, venøs sinushemostase, og ved kardiovaskulær kirurgi som forsegling av suturer av karproteser, aortakutting, aneurisme, og videre generell og bukhulekirurgi, fastsetting av innvollselementer (milt, nyrer, hepatisk) eller hepatisk biopsi, fordøyelsesanastomose, fistuler, hemostase av operasjonshulrom, samt ved benkirurgi, kortikal binding, sutur av sener, osteomyelitt, og ved stomatologi som hemostase ved tannutrekkning i pasienter med høy fare for blødninger (blødere), og ved otorinolaryngologi som tympanisk sårreperasjon og tonsillektomi .

Limet kan fremstilles fra humant eller animalsk plasma og kan således fordelaktig anvendes for behandling av mennesker og dyr.

Med hensyn til et injiserbart fibrinogen, iakttas det at det også har utmerkede bruksegenskaper og at dets avveide sammen-setning gjør det til et verdifullt middel for behandling av tilstander med hypo- eller afibrinogenese og syndromet med akutt defibrinering.

For behandling av konstitusjonelle mangler, er den vanlige dose 1 - 4 g avhengig av pasientens vekt i betraktning av at halveringstiden for fibrinogenet er tre til fire døgn og det plasmainnhold som er nødvendig for tilstrekkelig hemostase er omtrent 1 g/l.

Ved akutte defibrineringsbetingelser varierer dosene fra 2 - 10 g avhengig av omstendighetene.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et lett oppløselig konsentrat av trombinkoagulerbare proteiner avledet fra plasma, omfattende hovedsakelig fibrinogen og faktor XIII, karakterisert ved følgende trinn: a) utfelling av total plasma som ikke har vært underkastet kryopresipitering, ved hjelp av en 10 % vandig etanol-løsning, ved 4°C og pH 7,2, i en periode på minst 24 timer, b) fjernelse av supernatanten og vasking av utfellingen med 10 % etanol ved 4°C, c) utfellingen bringes på nytt i oppløsning i nærvær av lysin ved en konsentrasjon tilsvarende et innhold i sluttproduktet på fra 0,1 - 0,2 g pr. g proteiner, d) en viral inaktiveringsbehandling gjennomføres i samsvar med en konvensjonell løsningsmiddeldetergentmetode, e) et annet utfellingstrinn foretas ved hjelp av 10 % etanol, f) fjernelse av supernatanten og utfellingen bringes på nytt i oppløsning i nærvær av lysin, som under trinn c) , hvoretter det foretas diafiltrering, innfylling i flasker og frysetørking.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at trinn e) gjennomføres ved en temperatur mellom 30 og 40°C i en periode på omtrent 90 minutter.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at trinn e) gjennomføres ved en temperatur på 4°C i en periode på omtrent tolv timer.