NL8000935A - Weefselkleefstof. - Google Patents

Description

70 00k0

- V

·+

Ir t

Weefselkleefstof.

De uitvinding heeft betrekking op een weefsel-kleefstof op basis van menselijke of dierlijke proteïnen, die fibrinogeen en factor XIII bevat.

Het is sinds lang bekend bloedstollingsstoffen 5 toe te passen voor het stelpen van bloedingen resp. voor het verzegelen van wonden.. Volgens de eerste desbetreffende voorstellen werden fibrinetampons resp. fibrineplaatjes gebruikt. Tijdens de tweede wereldoorlog werd voorgesteld het kleven van weefsel uit te voeren met behulp van bloedplasma.

10 Later werd door EL Matras c -s. in het "Wiener

Medizinischen Wöchenschrift"1912, blz. 517, een veefselkleef-stof op Basis· van fibrinogeen en factor XIII beschreven voor naadloze interfascciculaire zenuwtransplantatie bij proeven met dieren.

15 Een verdere studie is afkomstig van Spangler c.s.

in het "Winer Klinischen Wöchenschrift", 1973, blz. 1 - 7· Ook hier werd bij proeven met dieren de mogelijkheid aangetoond om met behulp van fibrinogeen als cryoprecipitaat en trombine een weefselkleving uit te voeren.

20 De bekende preparaten zijn nog niet bevredigend· gebleken, omdat zij nog niet in toereikende mate voldoen aan de eisen welke aan een weefselkleefstof worden gesteld en die de volgende zijn: ai een hoge belastbaarheid van de klevingen resp. de wondverzege-2 5 lingen. alsmede een zekere en aanhoudende bloédstelping, nl. een goede hechting van het klëefmiddel aan de wond- resp. weefselvlakken, en een grote inwendige sterkte van het kleef-middel; hl een regelbare houdbaarheid van de klevingen in het lichaam; 30 cl een volledig resorbeerbaar zijn van de kleefstof in de loop van het heelproces van de wond; en dl wondhelingbevorderende eigenschappen.

•;1 800 0 9 35 f 2

Dit kan voor een deel hieraan te wijten zijn, dat de voor de bloedstelping noodzakelijke stollingsfactoren in de "bekende preparaten niet in een optimale verhouding tot elkaar aanwezig waren en ook hieraan, dat de fibrinolytische activiteit in het 5 kleefgehied slechts onvoldoende werd beheerst. Door enzymatische inwerking kwam het dikwijls tot een voortijdige oplossing van de weefselklevingen.

De uitvinding beoogt het vermijden van deze nadelen en moeilijkheden en heeft als doel een gelyofiliseerde 10 weefselkleefstof van menselijke of·dierlijke oorsprong te verschaffen, welke aan de hierboven opgesomde eisen voldoet en in gelyofiliseerde vorm..voorkomt, waaraan behoefte bestaat wegens de'langere houdbaarheid en de betere transporteerbaarheid resp. bevaarbaarheid.

15 Bijgevolg bestaat de uitvinding uit de combina tie van de volgende kenmerken: ai dat. de weefselkleefstof ten minste 33 gew.% fibrinogeen bevat; b.[ dat de verhouding van de factor XIII tot fibrinogeen, uitgedrukt in eenheden van de factor XIII per g fibrinogeen, ten 20 minste 8 CF bedraagt; cT dat in Het totale proteïne fibrinogeen en albumine aanwezig zijn in een verhouding van 33 - 90 : 5 - ^0; d) dat de weefselkleefstof een plasminogeen-activator-inhibitor of plasmine-inhibitor, bij*voorkeur aprotinine, bevat in een 25 hoeveelheid van 250 - 25.000 Kallikrein-inactivator-eenheden (KIE) per gram fibrinogeen; en e) dat het preparaat gelyofiliseerd is.

/ "Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm bevat de weefselkleefstof bovendien glycine, waardoor het weer oplosbaar 20 worden van het gelyofiliseerde produkt wordt verbeterd.

Bovendien kan de weefselkleefstof nog glucose of saccharose bevatten, welke componenten eveneens de oplosbaarheid bevorderen.

De weefselkleefstof kan voorts 0,2 - 200 IE hepa- r;', 80 0 0 9 35 3 ί#ν ' λ rine per g fibrinogeen bevatten, waardoor een stabiliserende werking wordt bereikt.

De weefselkleefstof volgens de uitvinding bezit karakteristieke verknoopbaarheidseigenschappen na oplossing, 5 die kunnen worden bepaald volgens de natriumlaurylsulfaat (SDS)-polyacrylamide-gelelectroforese-methode. De proef wordt zodanig uitgevoerd» dat na vermenging van de weefselkleefstof met een gelijk volume van een oplossing, die UO ^umol CaClg en 15’ ÏÏIH-een-heden (U. S. National Institute of Health-eenbeden) trombine per 10 cm^ bevat» het mengsel bij 37°C wordt geïncubeerd. De verknopings-graad wordt na stoppen van de reactie en. reductieve splitsing van de in de proteïnen aanwezige disulfidebruggen door toevoeging van een mengsel van ureum, natriumdodecylsulfaat en (3-mer-capto-ethanol door gelelectroforese bepaald. Karakteristiek voor 15 de onderhavige weefselkleefstof is een volledige verknoping van de fibrine-Y-ketens na 3 - 5 minuten en een verknoping van ten minste 35% van de fibrine-a-ketens na 2 uur.

Fibrinogeen, albumine en koud onoplosbaar glo-buline in het totale nroteïne dienen in de onderhavige weefsel-20 kleefstof in een "bepaalde onderlinge verhouding aanwezig te zijn; deze'verhouding.bedraagt 33-20 : : 0,2-15-

De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor het bereiden van de- beschreven weefselkleefstof uitgaande van plasmaacryoprecipitaat, welke werkwijze wordt ge-5 kenmerkt doordat uit het cryoprecipitaat door een enkel- of meervoudige behandeling met een bufferoplossing, die natriumcitraat, natriumchloride» glycine, glucose en een plasminogeen-activator-inhibitor of plasmine-inhibitor en heparine bevat» koud oplosbaar plasmaprotexne wordt verwijderd, het gezuiverde neerslag wordt op-3Q gelost, menselijk albumine wordt toegevoegd en de oplossing wordt gelyofiliseerd.

Het is gunstig het cryoprecipitaat te bereiden uit vers menselijk of dierlijk plasma, dat bij -20°C werd ingevroren. 3ij verhoging van de temperatuur tot 0 - 2°C wordt het . 80 0 0 9 35 A· ί u cryoprecipitaat gewonnen en door centrifugeren afgescheiden. Het neerslag wordt door eenmaal of meerdere malen elueren met de bufferoplossing, die een pH-waarde heeft van 6 - 8,0, geëlueerd en hij 0 - U°C gecentrifugeerd, teneinde het koud oplosbare plasmaproteï-5 ne te verwijderen. De behandeling met de bufferoplossing wordt uitgevoerd tot de gewenste factor XlII-fibrinogeen-verhouding is bereikt.

Het gezuiverde neerslag wordt opgelost met een volgende bufferoplossing, die menselijk albumine, glycine en 10 eventueel glucose of saccharode, een plasminogeen-activator-inhi-bitor of -plasmine-inhib it or, alsmede heparine bevat en een pH-waarde heeft van 6,5 - 9,0, en verdund tot een proteïneconcentra-tie van ^,0 - 9,0¾· De oplossing wordt gefiltreerd door een membraanfilter met een poriëngrootte van ten hoogste 0,2 ^um, 15 in de uiteindelijke houder gebracht en gelyofi-liseerd.

De aldus verkregen gelyofiliseerde weefselkleef-stof kan bij kamertemperatuur of bij voorkeur bij +k°C worden bewaard en is gebruiksklaar na reconstitutie met water af iniectabilia, waaraan naar keuze een plasminogeen-activator-inhibitor of piasmi -20 ne-inhibitor, bij voorkeur aprotinine, kan worden toegevoegd. Bij het oplossen van het gelyofiliseerde preparaat dient er te worden op gelet, dat de gebruiksklare oplossing ten minste 70 mg fibrinogeen/cm bevat.

De weefsel kleefstof volgens de uitvinding kan 25 universeel worden toegepast. Zij kan worden gebruikt voor het naadloos verbinden van menselijke of dierlijke weefsel- of orgaan- t delen voor het verzegelen van wonden en voor bloedstelping, alsmede voor het bevorderen van het helen van wonden.

Voorkeurstoepassingsgebieden, waarvoor de onder-'30. havige weefselkleefstof met succes kan worden gebruikt zijn: indicaties in het gebied van de hals-, neus-, oor- en kaakchirur-gie, tandheelkunde, neurochirurgie, plastische chirurgie, algemene chirurgie, abdominale chirurgie, thorax- en vaatchirurgie, orthopedie, ongevallenchirurgie, urologie, cftalmologie en gyneco- 80 0 0 § 35 5 logie.

Voor het aahbrengen van de onderhavige weefsel-kleefstof op het te verbinden weefsel is het nuttig een mengsel van trombine en calciumchloride aan de kleefstof toe te voegen 5 of op het weefsel aan te brengen.

De onderhavige werkwijze wordt nader toegelicht aan de hand van het volgende voorbeeld.

Voorbeeld 21 Liter menselijk, bij -20°C ingevroren vers 10 plasma werd verwarmd op +2°C. Het gevormde cryoprecipitaat (435 g) werd bij +2°C door centrifugeren afgescheiden en bij +2°C behandeld met 4,3 1 van een bufferoplossing met een pH-waarde van 6,5, die 6,6 g Ua^-eitraat.2^0, 3,4 g HaCI, 10,0 g glycine, 13.0 g glucose. 1^0, 50.000 KIE aprotinine en 200 IE heparine per 15 1 bevatte, en nogmaals gecentrifugeerd bij +2°C. Het afgescheiden neerslag werd opgelost in een volgende bufferoplossing met een pH-waarde van 7,9, die 35,0 g menselijk albumine, 20,0 g glycine, 50.000 KIE aprotinine en 200 IE heparine per 1 bevatte, en ver-

O

dund tot een concentratie van 70 -mg proteïne/cm .

20 Vervolgens werd de oplossing steriel gefiltreerd door een memhraanfilter met een poriëngrootte van ten hoogste . 3 0-,2 yum, m een hoeveelheid van 2,2 cm aangebracht m een uiteindelijke houder, diepgevroren en gelyofiliseerd. Ha reconstitutie van het gelyofiliseerde produkt tot een fibrinogeenconcentratie

O

25 van 90 mg/cm vertoonde het gebruiksklare weefselkleefstofprepa-raat bij de verknopingsproef een volledige fibrine-γ-verknoping na 5 minuten een fibrine-α-verknoping van 66% na 2 uur bij 37°C.

De verhouding van de in de weef3elkleefstof aanwezige proteïnen fibrinogeen tot albumine tot koud onoplosbare 3Q globuline werd bepaald op 64,0 : 22,3 : 7,7. Het heparinegehalte bedroeg 4,5 IE/g fibrinogeen. Aprotinine was aanwezig in een concentratie van 1133 KIE/g fibrinogeen. Het gehalte aan factor III bedroeg 161 eenheden/g fibrinogeen. Het gehalte aan totaal-pro-teïne in het gelyofiliseerde preparaat bedroeg 12,2% en het gehal- C 80 0 0 9 35 A- 6 te aan fibrinogeen in het gelyo fills eerde preparaat "bedroeg b6,2%.

De bepalingen werden op de volgende wijze uitgevoerd: De bepaling van de factor ΧΙΙΙ-eenheden geschiedde door middel van een verknopingsproef, waarbij factor XlII-vrij fibrino-5 geen als substraat werd gebruikt en de door de toevoeging van het onbekende verdunde monster bewerkte fibrineverknoping als maat diende voor de daarin aanwezige hoeveelheid factor XIII. Een overeenkomstige ijkingskromme werd verkregen met gepoold mense- . 3 lijk citraatplasma, waarbij per definitie 1 cm plasma 1 eenheid 10 factor XIII bevat. De kwantitatieve proteinebepalingen werden uitgevoerd volgens de methode van Kjeldahl.

De bepaling van de onderlinge verhouding van de proteïnen geschiedde eveneens volgens de SDS-polyacrylamide-gel-electroforese-methode, en wel 15 a) met een niet-gereduceerd, en b) met een met S-mercaptoëthanol gereduceerd monster van de weef-selkleefstof. .

4 'i- 80 0 0 9 35

Claims (7)

1. Weefselkleefstof op basis van menselijke of dierlijke proteïnen, die fibrinogeen en factor XIII bevat, gekenmerkt door de combinatie van de volgende kenmerken: a) dat de weefselkleefstof ten minste 33 gew.$ fibrinogeen bevat; 5 b) dat de verhouding van de factor XIII tot fibrinogeen, uitge-dxukt in eenheden van de factor XIII per g fibrinogeen, ten minste 80 bedraagt; c) dat in het totale proteïne fibrinogeen en albumine aanwezig zijn in een verhouding van 33 - 19 : 5-^0; **0 d) dat de weef selkleef stof een plasminogeen-activat or-inhibit or of plasmine-inhibitor, bij voorkeur aprotinine, bevat in een hoeveelheid van 250 - 25.000 KIE/g fibrinogeen; en e) dat het preparaat gelyofiliseerd is.

2. Weefselkleefstof volgens conclusie 1, met het ^ kenmerk, dat de weefselkleefstof bovendien glycine bevat.

3· Weefselkleefstof volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de weefselkleefstof bovendien glucose of saccha-rode bevat. Weefselkleefstof volgens conclusies 1-3, met 20 het kenmerk,dat de weefselkleefstof 0,2 - 200 IE heparine/g fibrinogeen bevat.

5. Weefselkleefstof volgens conclusies 1 - k, gekenmerkt door een volledige verknoopbaarheid van de fibrine-Y-ke-tens door incubatie na 3 - 5 minuten en een verknoopbaarheid van ’/ ^5 ten minste’35% van de fibrine-a-ketens na een incubatie van 2 uur, bepaald volgens de SDS-polyacrylamide-gelelectroforese-methode, na oplossing van het gelyofiliseerde preparaat.

6. Weefselkleefstof volgens conclusies 1-5, met het kenmerk, dat de verhouding van fibrinogeen tot albumine 30 tot koud onoplosbaar globuline in het totale proteïne 33 - 90 : 5 - ^0 : 0,2 - 15 bedraagt. . i. 80 0 0 9 35 _ ' .J

7. Werkwijze voor het bereiden ran een weefsel- kleefstof volgens conclusies 1 - 6 uit plasmacryoprecipitaat, met het kenmerk, dat uit het cryoprecipitaat door enkel- of meervoudige behandeling met een bufferoplossing, die natriumcitraat, 5 natriumchloride, glycine, glucose en een plasminogeen-activator-inhibitor of plasmine-inhibitor en heparine bevat, koud oplosbaar plasmaproteïne wordt verwijderd,' het gezuiverde neerslag wordt opgelost, menselijk albumine wordt toegevoegd en de oplossing wordt gelyofiliseerd.

8. Toepassing van de weefselkleefstof volgens con clusies 1 — 7 voor het naadloos verbinden van menselijke of dierlijke weefsel- of orgaandelen, voor de verzegeling van wonden en voor bloedstelping alsmede voor het bevorderen van het helen van wonden. J5 9« Toepassing van de weefselkleefstof volgens con clusie 8, met het kenmerk, dat voor het aanbrengen daarvan op het te verbinden weefsel, een mengsel van trombine en calciumehloride aan de kleefstof wordt toegevoegd of op het weefsel wordt aange-bracht. • f 800 0 9 35 VEREENIGDE OCTROOIBUREAUX o.a., no. 80.00935 'S-gravenhage (Holland) "bell, bij schrijven dd. -j_8 maart 1980 Vos/Ah ' ‘ Verbetering(en) van. erratum(a) in de beschrijving, behorende bij octrooiaanvrage no. 80.00935 „ voorgesteld door aanvrager(ster) onder datum 18 maart 1980 -ooo— - blz. 3, regel 21: "5-" toevoegen voor "40"; - blz. 5, regel 32: "III" vervangen door "XIII"; - blz. 7, regel 9 : "19" vervangen door "90". % 80 0 0 9 35