DK150815B - Fremgangsmaade til fremstilling af et vaevsklaebestof paa basis af humane eller animalske proteiner fra blod - Google Patents

Description

i 150815

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et vævsklæbestof på basis af humane eller animalske proteiner fra blod, med et indhold af fibrinogen og faktor XIII.

5 Det har længe været kendt at tage blodkoagulationsstoffer i betragtning til standsningen af blødninger eller til sårforseglinger. Ifølge de første sådanne forslag blev der anvendt fibrintamponer eller fibrinplader. Under den anden verdenskrig blev der foreslået vævsklæfoninger ved hjælp af 10 blodplasma.

Senere blev der af H. Matras o.a. i "Wiener Medizinischen

Wochenschrift", 1972, side 517 beskrevet et vævsklæbestof på basis af fibrinogen og faktor XIII til sømløs inter-15 fascikulær nervetransplantation i dyreforsøg.

En yderligere undersøgelse stammer fra Spangler o.a. i "Wiener Klinischen Wochenschrift", 1973, side 1-7. Også her blev i dyreforsøg påvist muligheden for ved hjælp af 20 fibrinogen som kryopræcipitat og thrombin at foretage en vævsklæbning.

De kendte præparater har endnu ikke vist sig tilfredsstillende, da de endnu ikke i tilstrækkeligt omfang har kunnet 25 opfylde de til et vævsklæbestof nødvendige fordringer, som er følgende: a) høj belastningsevne af klæbningerne eller sårforseglingerne samt sikker og holdbar blodstandsning, dvs. god 30 adhæsionsevne af klæbemidlet til sår- eller vævs fladerne,) samt høj indre styrke deraf, b) justerbar holdbarhed af klæbningerne i legemet, c) fuldkommen resorberbarhed af klæbestoffet under sårhelingsprocessen, 35 d) sårhelingsfremmende egenskaber.

150815 2 ningen nødvendige koagulationsfaktorer i de kendte præparater ikke var til stede i et i forhold til hinanden optimalt forhold og også til, at den fibrinolytiske aktivitet i klæbeområdet kun blev behersket utilstrækkeligt. Der skete hyp-5 pigt ved enzymatisk indvirkning en for tidlig opløsning af vævsklæbningerne.

Formålet med opfindelsen er at undgå disse ulemper og vanskeligheder og tilvejebringe et lyofiliseret vævsklæbestof 10 af human eller animalsk oprindelse, som yderligere opfylder de ovenfor anførte forudsætninger og foreligger i lyofiliseret form, hvilket er ønskeligt på grund af den længere holdbarhed og bedre transport- og lagringsdygtighed.

15 Den stillede opgave løses ved en fremgangsmåde af den tidligere nævnte art ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved, at der i en vandig fibrinogenholdig blodplasmafraktion indstilles et fibrinogenindhold, som er således, at det færdige produkt indeholder mindst 33 vægt%, et koncentrationsforhold på 8Q en*· 20 heder faktor XIII/g fibrinogen, totalproteinet fibrinogen og albumin i et forhold på 33-90 : 5-40, tilsætter blodplasmafraktionen en plasminogen-aktiyator-inhibitor eller plasmin-inhibitor, fortrinsvis aprotinin, og lyofiliserer produktet.

25

Fra et fibrinogenholdigt plasmakryobundfald fjernes hensigtsmæssigt koldt-opløseligt plasmaprotein ved én eller flere behandlinger med en pufferopløsning, som indeholder natrium-30 citrat, natriumchlorid, en plasminogen-aktivator-inhibitor eller plasmin-inhibitor, det rensede bundfald opløst, humanalbumin tilsat og produktet lyofiliseret.

Blodplasmafraktionen tilsættes fortrinsvis heparin i en mæng-35 de på 0,2 - 200 IE pr. gram fibrinogen.

Kryobundfaldet fremstilles fortrinsvis af humant eller animalsk frisk plasma, som blev nedfrosset ved -20°c. ve(j en 3 150815 forhøjelse af temperaturen til Q-2°C, bliver kryobundfaldet udvundet og fraskilt ved centrifugering. Bundfaldet bliver elueret en eller flere gange med pufferopløs-5 ningen, som har en pH-værdi på 6,0 - 8,0, og centrifugeret ved 0-4°C for at fjerne det koldt—opløselige plasmaprotein. Behandlingen med pufferopløsningen gennemføres indtil opnåelse af det ønskede faktor XIII - fibrinogen - forhold.

10 Det rensede bundfald opløses med en yderligere pufferopløsning, som indeholder humanalbumin og eventuelt glycin, glu= cose eller saccharose, en plasminogen-aktivator-inhibitor eller plasmin-inhibitor samt heparin og har en pH-værdi på 6,5 - 9,0, og fortyndes til en proteinkoncentration på 4,0-15 9,0%. Opløsningen filtreres over membranfilter af en pore størrelse indtil 0,2 -μια, fyldes i s lutbeholderen og lyofi-liseres.

Det således opnåede lyofiliserede vævsklaebemiddel kan lag-20 res ved stuetemperatur eller fortrinsvis ved +4°C. Efter rekonstitution med Aqua ad injectabilia, som om ønsket kan tilsættes en plasminogen-aktivator-inhibitor eller plasmin-inhibitor, fortrinsvis aprotinin, er det klar til brug. Ved opløsningen af det lyofiliserede præparat skal det påses, 25 at den brugsfærdige opløsning indeholder mindst 70 mg fi= brinogen pr. ml.

Det ifølge opfindelsen fremstillede vævsklæbestof har således følgende kendetegn: 30 a) det indeholder mindst 33 vægt% fibrinogen, b) forholdet af faktor XIII til fibrinogen, udtrykt som enheder af faktor XIII pr. gram fibrinogen, udgør mindst 80, 35 c) i totalproteinet indgår fibrinogen og albumin i et forhold på 33-90:5-40, d) det har et indhold af plasminogen-aktivator-inhibitor λ! Ί /"\v* v"\T rim-? v\_·» V\-t ·ΡΛη4·ν·ΐ vnctt-i e? r->t-\v/-N4—! τ-ιΊ -n -f-/—νκ'-ί-ν'ί 'ΤΝοττ"ΐ o 0£fi—.

4 150815 25.000 kallikrein-inaktivator-enheder (KIE) pr. gram fibrinogen, e) præparatet foreligger i lyofiliseret form.

5 Ifølgeen foretrukken udførelsesform indeholder vævsklæbestof fet yderligere glycin, hvorved genopløseligheden af det lyo-filiserede produktbliver forbedret.

Desuden kan vævsklæbestoffet indeholde yderligere glucose 10 eller saccharose, hvilke komponenter ligeledes kan fremme opløseligheden.

Vævsklæbestoffet kan desuden indeholde 0,2-200 IE heparin pr. gram fibrinogen, hvorved der opnås en stabiliserende 15 virkning.

Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnåede vævsklæbestof besidder karakteristiske tværbindingsegenskaber efter opløsningen, hvilke egenskaber er væsentlige for den klæbende virkning, og kan fae-2 o bestemmes efter natriumlaurylsulfat- (SDS) -polyacrylamid-gelelektrophorese- metoden. Testen gennemføres således, at efter blanding af vævskla±)estoffet med' det samme volumen af en opløsning indeholdende 40 ymol CaC^ og 15 NIH-enheder (US National Institute of Health-Units) thrombin pr. ml, bliver blandingen inkuberet ved 37°C. Tværbindings-25 graden bestemmes efter standsning af reaktionen og reduktiv spaltning af de i proteinerne indeholdte disulfidbroer ved tilsætning af en blanding af urinstof, natriumdodecylsulfat og β-mercaptoethanol ved gelelektrophorese. Karakteristisk for vævsklæbestoffet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge 30 opfindelsen er en fuldstændig tværbinding af fibrin-γ-kæderne efter 3-5 minutters forløb og en mindst 35%1 s tværbinding af fibrin-α-kæderne efter 2 timers forløb.

Fibrinogen, albumin og ligeledes i kulde uopløseligt globu= 35 lin i totalproteinet skal i det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnåelige vævsklæbestof fortrinsvis stå i et bestemt forhold. Dette forhold udgør 33 - 90 : 5 - 40· ^ 0,2 - 15, 150815 5

Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede vævs-klæbestof udviser en universel anvendelighed. Det kan anvendes til sømløs forbinding af humane eller animalske vævs- eller organdele, til sårforsegling og blodstandsning samt til fremme 5 af sårhelinger.

Foretrukne anvendelsesområder, hvortil det ifølge opfindelsen opnåelige vævsklæbestof kan anvendes med held, er: Indikationer i området hals-, næse-, øre- og kæbekirurgi, tand-10 lægevidenskab, neurokirurgi, plastisk kirurgi, almen kirurgi, abdominalkirurgi, thorax- og karkirurgi, orthopædi, ulykkeskirurgi, urologi, ophthalmologi og gynækologi.

Før applikationen af vævsklæbestoffet, der fremstilles ved 15 fremgangsmåden ifølge opfindelsen, på vævet, der skal forbindes, påføres fordelagtigt en blanding af thrombin og calciumchlorid på klæbestoffet eller på vævet.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved hjælp 20 af følgende eksempler.

Eksempel 1.

21 liter humant, ved -20°C nedfrosset frisk plasma, opvarmes 25 til +2°C. Det dannede kryopræcipitat (435 g) separeres ved +2°C ved centrifugering og behandles med 4,3 liter af en pufferopløsning med pH-værdi 6,5, som indeholder 6,6 g Na3~ citrat,2H20, 3,4 g NaCl, 10,0 g glycin, 13,0 g glucose, ΙΕ^Ο, 50.000 KIE aprotinin og 200 IE heparin pr. liter og 30 centrifugeres endnu engang ved 2°C. Det fraskilte bundfald opløses i endnu en pufferopløsning med pH-værdi 7,9, som indeholder 35,0 humanalbumin, 20,0 g glycin, 50.000 KIE aprotinin og 200 IE heparin pr. liter og fortyndes til en koncentration på 70 mg protein pr. ml.

Opløsningen sterilfiltreres over et membranfilter indtil 35 150815 6 én porestørrelse på 0,2 yin, 2,2 ml fyldes i en slutbeholder, dybfryses og lyofiliseres. Efter rekonstitution af det lyo= filiserede produkt til en fibrinogenkoncentration på 90 mg/ ml udviste det brugsfærdige vævsklæbestofpræparat i tvær-5 bindingstesten en fuldstændig fibrin-v-tværbinding efter 5 minutters forløb og en 66%' s fibrin-a-tværbinding efter 2 timer ved 37°C.

Forholdet af det i vævsklæbestoffet indeholdte proteinfibri= 10 nogen til albumin til i kulden uopløseligt globulin blev fastslået til 64,0:22,3:7,7. Heparinindholdet udgjorde 4,5 IE pr. gram fibrinogen. Aprotinin indgik i en koncentration på 1133 KIE pr. g fibrinogen. Indholdet af faktor XIII udgjorde 161 enheder pr. gram fibrinogen. Indholdet af total-15 protein i det lyofiliserede præparat udgjorde 72,2%, indholdet af fibrinogen i det lyofiliserede præparat 46,2%.

Bestemmelsen skete på følgende måde: Bestemmelsen af faktor XIII-enhederne skete ved hjælp af en tværbindingstestived 20 faktor XIII-frit fibrinogen anvendt som substrat^og den ved tilsætningen af den ubekendte fortyndede prøve bevirkede fibrintværbinding tjente som mål for den deri indeholdte mængde af faktor XIII. En tilsvarende målekurve blev opnået med samlet human citratplasma, hvorhos der pr. definition 25 i 1 ml plasma indgik 1 enhed faktor XIII. De kvantitative proteinbestemmelser skete ved hjælp af Kjeldahl-metoden.

Bestemmelsen af proteinerne i forhold til hinanden skete ligeledes ifølge SDS-polyacrylamid-gelelektrophoresemetoden 30 a) med en ikke-reduceret og b) med en med β-mercapto= ethanol reduceret prøve af vævsklæbestoffet.

7 150815

Eksempel 2, 9,0 1 opsamlet human citratplasma blev behandlet med 130.000 KIE aprotinin og langsomt tilsat 1350 g pulverformigt glycin under omrøring. Derpå blev pH-værdien indstillet på 7,4, og blandingen omrørt i yderligere 3 timer. Det resulterende bund-5 fald blev skilt fra ved centrifugering og behandlet med 2,0 1 af en pufferopløsning med en pH-værdi 7,4, indeholdende 9,0 g NaCl, 2,9 g Na^-citrat, 2^0, 131 g glycin og 20.000 KIE aprotinin/1 og centrifugeret endnu en gang. Behandlingen med den nævnte pufferopløsning og den efterfølgende centrifu- 10 gering blev gentaget to gange.

Det fraskilte bundfald blev bragt i opløsning ved dialyse mod en pufferopløsning med pH-værdi 7,4, indeholdende 9,0 g NaCl og 2,9 g Na^-citrat,2H2O/I, og efterfølgende opvarm-15 ning til 37°C og fortyndet med en yderligere pufferopløsning med pH-værdi 7,4, indeholdende 19,0 g humanalbumin, 9,0 g glycin og 1,0 g Na^-citrat,2H2O/I til en proteinkoncentration på 50 g/1 og tilsat 200.000 KIE aprotinin samt 200 I.E. hepa= rin/1.

20

Derpå blev opløsningen sterilt filtreret over membranfilter til en porestørrelse på 0,2 μπι, og hver 2,3 ml fyldt i slut-beholder, dybfrosset og lyofiliseret.

25 Efter rekonstitution af det lyofiliserede produkt til en fi- brinogenkoncentration på 90 mg/ml udviste det brugsfærdige vævsklæbestof .i tvaerbindingstesten en fuldstændig fibrin-γ-tværbinding efter 5 minutter og en 79% fibrin-a-tværbinding efter 2 timer ved 37°C.

30

Forholdet fibrinogen : albumin = 79,1 : 18,0.

Aprotinin: 5060 KIE/g fibrinogen.

Heparin: 5,1 I.E./g fibrinogen.

35 Faktor XIII: 130 enheder/g fibrinogen

Samlet proteinindhold i lyofiliseret præparat: 82,0%.

Indhold af fibrinogen i lyofiliseret præparat: 64,9%.

8 150815

Eksempel 3.

3,5 1 opsamlet human citratplasma blev langsomt under omrøring behandlet med 665 ml af en ved stuetemperatur mættet ammonium-sulfatopløsning, pH-værdien indstillet på 7,0 og blandingen omrørt natten over ved 4°C. Det resulterende bundfald blev 5 skilt fra ved centrifugering og opløst med 900 ml af en puf feropløsning med pH-værdi 7,4, indeholdende 18,0 g NaCl og 14,7 g Na^-citrat,21^0/1, ved 37°C. En ringe mængde uopløst stof blev filtreret fra og opløsningen langsomt under omrøring behandlet med 129 ml af den ovenfor nævnte ammoniumsulfatop-10 løsning. Efter indstilling af pH-værdien på 7,0 blev blandingen igen omrørt natten over ved 4°C. Det resulterende bundfald blev skit fra ved centrifugering og bragt i opløsning ved dialyse mod en pufferopløsning med pH-værdi 7,4, indeholdende 9,0 g NaCl og 2,9 g Na^-citrat,21^0/1, og efterfølgende 15 opvarmning til 37°C og fortyndet med yderligere pufferopløsning med pH-værdi 7,4, indeholdende 19,0 g humanalbumin, 9,0 g glycin og 1,0 g Na^-citrat^I^O/l,til en proteinkoncentration på 50 g/1 og tilsat 100 KIE aprotinin/ml.

20 Derpå blev opløsning sterilt filtreret over membranfilter til 0,2 μπι, og hver 2,8 ml fyldt i slutbeholder, dybf rosset og lyofiliseret.

Efter rekonstitution af det lyofiliserede produkt til en fi-25 brinogenkoncentration på 90 ml/ml viste det brugsfærdige vævsklæbestof i tværbindingstesten en fuldstændig fibrin-γ-tvær binding efter 5 minutter og en 68% fibrin-a-tværbinding efter 2 timer.

30 Forholdet fibrinogen : albumin : i kulden uopløseligt glo= bulin = 64,6 : 23,3 : 6,2.

Aprotinin: 3084 KIE/g fibrinogen.

Faktor XIII: 142 enheder/g fibrinogen.

Samlet proteinindhold: 82,4%.

35 Indhold af fibrinogen i lyofiliseret præparat: 53,3%.