DE69533188T2 - Stabilisierte transglutaminase und diese enthaltende enzymatische zubereitung - Google Patents

Stabilisierte transglutaminase und diese enthaltende enzymatische zubereitung Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabile Transglutaminasezubereitung mit hervorragender Beständigkeit (im Folgenden wird Transglutaminase gegebenenfalls als TGase abgekürzt).
  • Hintergrund der Erfindung
  • Verringerte Enzymaktivitäten sind in vielen Enzymen beobachtbar, wenn sie über einen längeren Zeitraum gelagert werden.
  • TGase ist ein Enzym, dessen Aktivität hauptsächlich durch Sauerstoff erheblich verringert wird, wenn sie über einen längeren Zeitraum gelagert wird. Deshalb ist ein Verfahren zur Verbesserung der Beständigkeit der TGase entwickelt worden, bei dem eine organische Säure, eine anorganische Säure, ein Polyphenol, eine Thiolverbindung, ein Zuckeralkohol und dergleichen als Additive eingesetzt werden (vergleiche die Japanische Patentanmeldung P 4207194 A). Die Verbesserung der Beständigkeit durch diese Additive ist jedoch nicht ausreichend. Insbesondere ist es, wenn TGase unter verschärften Bedingungen, wie bei einer Lagerung während des Sommers, nach ihrer Herstellung gelagert wird, erforderlich, geeignete Mittel bereitzustellen, wie die Verwendung eines Sauerstofffängers oder eine Vakuumbehandlung bei der Verpackung, diese Mittel sind jedoch immer noch nicht zufrieden stellend.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Angesichts dessen ist es deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Transglutaminaseenzymzubereitung bereitzustellen, die über einen längeren Zeitraum bei Normaltemperatur ohne den Einsatz von Sauerstofffängern, Vakuumverpackung und dergleichen belagert werden kann, und zudem eine Transglutaminaseenzymzubereitung bereitzustellen, welche diese enthält.
  • Zur Lösung dieser Aufgabe haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung eingehende Untersuchungen durchgeführt und gefunden, dass die Behandlung von TGase mit einem spezifischen Verfahren unter Einsatz einer bestimmten Substanz die Stabilität erheblich erhöhen kann, sodass die Enzymaktivität selbst nach längerer Lagerung bei Normaltemperatur nicht abnimmt, und sie haben so die vorliegende Erfindung gemacht.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Transglutaminaseenzymzubereitung, erhältlich durch Trocknen einer Lösung, die TGase und ein Teilproteinhydrolysat enthält.
  • Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung veranschaulicht.
  • Der Ursprung der TGase, die erfindungsgemäß stabilisiert werden soll, ist nicht besonders eingeschränkt, mit der Maßgabe, dass es ein Enzym mit Transglutaminaseaktivität ist. Beispiele eines solchen Enzyms umfassen solche, die aus Säugetieren stammen, wie Meerschweinchen und dergleichen (vergleiche die Japanische Patentveröffentlichung Nr. JP 1050382 ), solche, die aus Mikroorganismen stammen, wie aus der Gattung Streptoverticillium und dergleichen (siehe beispielsweise die Japanische Patentanmeldung JP 1027471 A ) und solche, die aus Fischen stammen, wie Codfisch und dergleichen (siehe beispielsweise Nobuo Seki et al., Japan Journal of Scientific Fisheries, Vol. 56, S. 125, 1990) und solche, die durch rekombinante DNA-Techniken unter Einsatz der Biotechnologie erhalten werden (vergleiche die Japanische Patentanmeldung JP 1300889 A , JP 5199883 A und JP 6225775 A ). Unter diesen Enzymen ist die mikrobielle TGase deswegen vorteilhaft, weil sie im großen Maßstab hergestellt werden kann, um für ihre Enzymaktivität kein Calcium benötigt.
  • Die Reinheit der so stabilisierenden TGase ist nicht besonders eingeschränkt. Das heißt, es kann entweder das Rohprodukt oder ein hoch reines Produkt, das durch Reinigung erhalten wird, stabilisiert werden.
  • Im Folgenden wird das Teilproteinhydrolysat beschrieben, das als Stabilisierungsmittel eingesetzt werden soll.
  • Das Teilproteinhydrolysat kann auf übliche Weise erhalten werden. Das heißt, unter Einsatz von Papain, Bromelain, Trypsin oder ähnlichen Enzymen, Chlorwasserstoffsäure oder einer ähnlichen Säure oder Natriumhydroxid oder einer ähnlichen Base als Teilhydrolysierungsmittel wird ein Proteinmaterial unter üblicher Weise eingesetzten Teilhydrolysierungsbedingungen teilweise hydrolysiert. Es versteht sich von selbst, dass auch häufig erwerbbare Teilhydrolysate eingesetzt werden können. Der Grad der Hydrolyse des Teilhydrolysats ist nicht besonders eingeschränkt, mit der Maßgabe, dass es die TGase stabilisieren kann. Zusätzlich kann das Teilproteinhydrolysat, das in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, nicht nur ein gereinigtes Produkt sein, sondern auch ein Produkt, das teilweise mit Verunreinigungen kontaminiert ist, wie Aminosäuren, die während der Proteinhydrolyse gebildet werden, mit der Maßgabe, dass das Produkt TGase stabilisieren kann.
  • Das Trocknen einer Lösung, die TGase und ein Teilproteinhydrolysat enthält, das heißt die Stabilisierung der TGase durch das vorstehend genannte Verfahren unter Einsatz eines Teilproteinhydrolysats kann beispielsweise durch ein beliebiges Verfahren bewirkt werden, bei dem (1) ein Teilproteinhydrolysat während des Produktionsverfahrens für die TGase zugegeben wird oder (2) ein Teilproteinhydrolysat als Stabilisierungsmittel zu dem hergestellten TGase-Pulver in einem Lösungsmittel gegeben wird, das Pulver dann dispergiert und gemischt wird und anschließend eine Trocknung durchgeführt wird.
  • Wenn das Verfahren (1) eingesetzt wird, worin ein Teilproteinhydrolysat während des Verfahrens zur Herstellung der TGase zugegeben wird, wird ein Teilproteinhydrolysat als Stabilisierungsmittel zu einer Enzymlösung gegeben, die nach dem vollständigen Ablauf der Kultivierung für die Produktion von TGase in einem Produktionsverfahren, beispielsweise offenbart in der Japanischen Patentanmeldung JP 1027471 A (entsprechend US-Patent 5,156,956), unmittelbar oder während der Konzentrationsstufe sterilisiert wurde, wobei danach die Trocknung des Gemisches folgt. Bei den beiden Arten der Zugabe ist der letztgenannte Fall bevorzugt, bei dem ein Teilproteinhydrolysat zu der Enzymlösung nach der Konzentration bis zu einem gewissen Grad vorteilhaft, weil das Teilproteinhydrolysat sich leicht löst. Insbesondere kann Weizenprotein und dergleichen sehr einfach gleichförmig aufgelöst werden, wenn eine Transglutaminaselösung durch die Konzentration bis zu einem gewissen Grad viskos wird.
  • Wenn das Verfahren (2) eingesetzt wird, werden das hergestellte Transglutaminasepulver und ein Teilproteinhydrolysat in einem Lösungsmittel dispergiert und gemischt. Dies ist ein Verfahren, bei dem ein Teilproteinhydrolysat als Stabilisierungsmittel und TGase durch Dispergieren oder Auflösen in einem Lösungsmittel, wie Wasser, einer Pufferlösung, Ethanol oder dergleichen, gleichförmig gemischt werden und anschließend getrocknet werden.
  • In beiden Verfahren (1) und (2) ist es nicht erforderlich, eine Verweilzeit nach der Zugabe des Teilproteinhydrolysats und vor dem Trocknen festzusetzen, es ist jedoch wünschenswert, einen solchen Zeitraum festzusetzen, sodass die Enzymaktivität nicht abnimmt.
  • In diesem Zusammenhang kann das Trocknen durch üblicherweise eingesetzte Verfahren durchgeführt werden, wie Trocknen unter vermindertem Druck, Gefriertrocknen oder dergleichen, wobei die TGase nicht inaktiviert wird.
  • Als nächstes werden die Menge der TGase und des einzusetzenden Stabilisierungsmittels, wenn TGase erfüllungsgemäß stabilisiert wird, beschrieben. In den Stabilisierungsverfahren (1) und (2), die vorstehend beschrieben wurden, besteht kein Unterschied, wenn diese Mengen auf die Trockenmasse umgerechnet werden. Das heißt, wenn TGase eine spezifische Aktivität von etwa 0,1 bis 10 Einheiten/mg hat, wird das Proteinmaterial in einem Zugabeverhältnis von 0,01 bis 200 Gewichtsteile, vorzugsweise von 0,5 bis 100 Gewichtsteile pro 1 Gewichtsteil des Enzyms zugesetzt. Wenn die Menge des Teilproteinhydrolysats unter 1 Gewichtsteil ist, ist die Schutzwirkung für Transglutaminase so schwach, dass die Stabilisierung des Enzyms nicht erzielt werden kann. Andererseits kann, wenn die Menge 200 Gewichtsteile übersteigt, die Schutzwirkung erzielt werden, die erhaltene stabilisierte TGase hat jedoch eine so geringe Aktivität, dass sie für den praktischen Einsatz in Nahrungsmitteln aufgrund der geringen Transglutaminasefunktion nicht geeignet ist.
  • Ein bei der vorliegenden Erfindung zu beachtender Aspekt ist, dass die Transglutaminase nicht stabilisiert werden kann, wenn das Trockenpulver von Transglutaminase einfach mit dem Trockenpulver eines Proteinmaterials gemischt wird, selbst wenn die Transglutaminase und das Proteinmaterial innerhalb des vorstehend genannten Bereiches eingesetzt werden. Die Stabilisierung von TGase kann zum ersten Mal durch Trocknen einer Lösung, die TGase und ein Teilproteinhydrolysat enthält, erzielt werden. Wenn dies durchgeführt wird, scheint es, dass Transglutaminase in die Matrix eines Teilproteinhydrolysats einverleibt wird, insbesondere in die Matrix eines Teilproteinhydrolysats in flüssiger Form, worin Vernetzung (die später beschrieben wird) durch die Transglutaminase bewirkt wird und somit die Transglutaminase vor dem Luftsauerstoff geschützt und stabilisiert wird.
  • Die Transglutaminasezubereitung (trockene Form), die auf diese Weise erhalten wird, kann in der vorliegenden Form eingesetzt und vertrieben werden, es können jedoch auch andere Komponenten (trockene Form) zu der Transglutaminasezubereitung (trockene Form), die auf diese Weise erhalten wird, zugesetzt werden und in der Form einer Enzymzubereitung eingesetzt und vertrieben werden.
  • Obwohl die Komponente in Abhängigkeit von der Verwendung der erfindungsgemäßen Enzymzubereitung abhängt, kann sie gegebenenfalls unter Additiven, die üblicherweise in Enzymzubereitungen eingesetzt werden, ausgewählt sein, oder sie kann in der Transglutaminaseenzymzubereitung des Standes der Technik verwendet werden. Als solche Additive können verschiedene Proteinmaterialien eingesetzt werden, einschließlich Milchproteine, wie Milchpulver, Casein, Caseinnatrium, Caseincalcium und dergleichen, sowie Weizenprotein, Sojabohnenprotein und dergleichen. Zusätzlich können Polyphenol, organische Säuresalze, wie Citrat und dergleichen, zugemischt werden. Es können auch Geschmacksstoffe zugegeben werden, wie Salz, Pfeffer, Zucker, Natriumglutamat, Natriuminosinat, Natriumguanylat und dergleichen, und Emulgiermittel, wie Lecithin, Monoglycerid und dergleichen.
  • In diesem Zusammenhang ist der Transglutaminaseanteil in der erfindungsgemäßen Enzymzubereitung im Allgemeinen 0,1 bis 99 Gewichtsteile, vorzugsweise 1 bis 90 Gewichtsteile pro 100 Gewichtsteile der Zubereitung. Ein Gehalt von weniger als 0,1 Gewichtsteil hat keine Enzymwirkung, selbst wenn eine deutlich erhöhte Dosis der Enzymzubereitung eingesetzt wird, und wenn der Anteil 99 Gewichtsteile übersteigt, wird die Handhabung der Zubereitung schwierig, weil die dem Nahrungsmittel zugesetzte Menge extrem gering werden würde.
  • Im Vergleich mit den Transglutaminasezubereitungen, die nicht stabilisiert sind, zeigt die erfindungsgemäße Transglutaminasezubereitung eine über die Zeit deutlich verringerte Abnahme der Enzymaktivität, und es wird ein Anteil von mindestens etwa 80% der ursprünglichen Aktivität selbst ein Jahr nach der Herstellung aufrechterhalten, sodass sie für breite Anwendungsbereiche effektiv eingesetzt werden kann, einschließlich für die Modifikation und die Vernetzung von Milchprodukten, wie Eiscreme, Joghurt, Käse und dergleichen, Pasten aus Tieren oder Fisch, wie Schinken, Wurst, gekochte Fischpaste und dergleichen, um verschiedene Typen von Fleisch, wie Rindfleisch, Schwein, Hähnchenfleisch und dergleichen, sowie für gebackene Weizenprodukte, wie Brot und dergleichen, und Nudeln, wie Spaghetti und dergleichen. Solche Wirkungen können durch Modifikation der Proteine und Peptide, die in den Materialien dieser Produkte enthalten sind, durch die Bildung von intramolekularen oder intermolekularen Vernetzungen, die durch die Enzymaktivität der TGase erzeugt werden, erzielt werden.
  • Obwohl die erfindungsgemäße Transglutaminasezubereitung eine deutlich erhöhte Stabilität hat und einen extrem geringen Grad an Inaktivierung über die Zeit hat, wie vorstehend beschrieben, kann der Grad der Inaktivierung über die Zeit durch Konservieren oder durch Vertreiben in einen Sauerstoffundurchlässigen Behälter mit geringer Sauerstoffpermeabilität weiter verringert werden. Es ist wünschenswert, dass das Material eines solchen Behälters eine Sauerstoffpermeabilität von 100 ml/m2·101325 Pa·24 h oder weniger hat, vorzugsweise 30 ml/m2·atm·24 h oder weniger. Beispiele eines solchen Behälters, der die vorstehenden Kriterien erfüllt, umfassen Behälter in der Form einer Tasche, einer Flasche oder andere Formen aus einer Aluminiumfolie, einem Aluminiumabscheidungsfilm, einem Polyvinylalkoholharz, einem Nylonharz, einem Polyvinylidenchloridharz und dergleichen.
  • In diesem Zusammenhang wird die Aktivitätseinheit der TGase wie nachfolgend beschrieben gemessen. Die Enzymreaktion wird durch Einsatz von Benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycin und Hydroxylamin als Substrate durchgeführt, die so hergestellte Hydroxamsäure bildet in Anwesenheit von Trichloressigsäure einen Eisenkomplex, und dann wird die Absorption bei 525 nm gemessen, um die Menge der Hydroxamsäure unter Einsatz einer Eichkurve zu bestimmen und die Enzymaktivität zu berechnen (vergleiche die vorstehend erwähnte Japanische Patentanmeldung JP 1027471 A ).
  • Wie allgemein bekannt, ist Transglutaminase ein Enzym, das die Acylumordnungsreaktion der γ-Carboxyamidgruppe von Glutaminresten in Peptidketten katalysiert. Wenn die ε-Aminogruppe von Lysinresten in einem Protein als Acylrezeptor wirkt, katalysiert TGase die Bildung einer ε-(γ-Glu)-Lys-Vernetzungsbindung in oder zwischen den Proteinmolekülen. Unter Einsatz einer solchen Funktion von TGase kann die Modifikation von Proteinen oder Peptiden durchgeführt werden (vergleiche die Verwendungsbeispiele 1 bis 5, die nachstehend beschrieben werden). Wenn Wasser als Acylrezeptor dient, katalysiert dieses Enzym eine Reaktion, bei der ein Glutaminrest deaminiert und in einen Glutaminsäurerest umgewandelt wird.
  • Wie vorstehend beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung eine Transglutaminasezubereitung, die durch Trocknen einer Lösung, die TGase und ein Teilproteinhydrolysat enthält, erhalten wird. Da die so erhaltene Transglutaminasezubereitung vor Beeinträchtigung ihrer Enzymaktivität aufgrund Oxidation geschützt ist, besteht der große Vorteil darin, dass sie über einen langen Zeitraum bei Normaltemperatur in einer Sauerstoff-enthaltenden Atmosphäre stabil konserviert werden kann.
  • Es versteht sich von selbst, dass die erfindungsgemäße Transglutaminasezubereitung mit noch höherer Stabilität be reitgestellt werden kann, indem sie nicht nur in einem Sauerstoffundurchlässigen Behälter, wie vorstehend beschrieben, enthalten ist, sondern auch dadurch, dass zusätzlich ein Sauerstofffänger zugegeben wird, oder dadurch, dass Vakuumverpackung oder eine Stickstoff-gefüllte Verpackung eingesetzt wird.
  • Beste Ausführungsform der Erfindung
  • Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf einige Beispiele eingehender beschrieben. Es versteht sich von selbst, dass die vorliegende Erfindung durch diese Beispiele nicht beschränkt wird.
  • Erfindungsbeispiel 1
  • Unter Einsatz eines Hovert®-Mixers (hergestellt von Bokusui) wurde 1 kg mikrobielle TGase (1,0 Einheit/mg spezifische Aktivität), hergestellt gemäß dem Verfahren in Beispiel 1 der vorstehend genannten Japanischen Patentanmeldung JP 1027471 A , mit 1 kg jeweils eines Teilproteinhydrolysats, die in der folgenden Tabelle 1 gezeigt sind, oder im Vergleich dazu mit 10 g Natriumcitrat, offenbart in der vorstehend genannten Japanischen Patentanmeldung JP 4207194 A (Kontrolle (2)), gründlich gemischt, und das erhaltene Gemisch wurde zu 5 kg Wasser gegeben. Nach dem Auflösen der Komponenten durch Mischen und Stehenlassen der Lösung bei Raumtemperatur während etwa 30 Minuten wurde TGase durch Trocknen der Lösung unter vermindertem Druck behandelt. In jedem Fall war die spezifische Aktivität nach der Behandlung etwa 0,45 Einheit/mg.
  • Die so behandelte Transglutaminasezubereitung wurde in einen Behälter aus einer Aluminiumlaminatfolie (PET 12 μ/PE 15 μ/Al 9 μ/PE 15 μ/L-LDPE 70 μ) gepackt und versiegelt und 1 Jahr bei 24°C gehalten. Die Ergebnisse der Aktivitätsmessungen der Transglutaminasezubereitungsproben sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • Eine Transglutaminaseprobe, die ohne Zugabe eines Teilproteinhydrolysats oder ähnlichem Stabilisierungsmittels behandelt wurde, wurde auch als Kontrolle hergestellt (Kontrolle (1)). Ebenso wurde ein Pulvergemisch aus 1 kg derselben Transglutaminase mit einer spezifischen Aktivität von 1,0 Einheit/mg und 1 kg "Sun Lacto"® unter denselben Bedingungen als Kontrolle eingesetzt (Kontrolle (3)).
  • Tabelle 1 zeigt, dass jede der Transglutaminaseproben, die der erfindungsgemäßen Stabilisierungsbehandlung unter Einsatz eines Teilproteinhydrolysats als Stabilisierungsmittel unterworfen wurden, im Vergleich zu den Kontrollen deutlich stabilisiert waren. Das Teilproteinhydrolysat war auch im Vergleich mit Natriumcitrat, das üblicherweise als Stabilisierungsmittel eingesetzt wird, deutlich überlegen. Zusätzlich zeigte sich, dass die Stabilisierungswirkung eines Teilproteinhydrolysats nicht gefunden wurde, wenn es als Pulvergemisch eingesetzt wurde.
  • Tabelle 1
    Figure 00110001
  • Erfindungsbeispiel 2
  • Eine Fermentationsbrühe von TGase, hergestellt nach dem Verfahren in Beispiel 1 der vorstehend genannten Japanischen Patentanmeldung JP 1027471 A , wurde filtriert, das erhaltene Filtrat wurde einer Ethanolabtrennung unterworfen, wobei ein Präzipitat erhalten wurde (0,5 Einheit/mg spezifische Aktivität), und dann wurde 1 Gewichtsteil jedes der in Tabelle 2 gezeigten Stabilisierungsmittel zu einem Gewichtsteil (Feststoff) des so erhaltenen Präzipitats gegeben und unter Einsatz eines Mischers gleichförmig gemischt. Die Mischung wurde dann unter vermindertem Druck getrocknet, wobei die erfindungsgemäße Transglutaminasezubereitung erhalten wurde. In jedem Fall war die spezifische Aktivität etwa 1,5 Einheit/mg.
  • Die so behandelte Transglutaminasezubereitung wurde in demselben Aluminiumlaminatfolienbehälter wie in Erfindungsbeispiel 1 verpackt und versiegelt und 1 Jahr bei 24°C gelagert. Die Ergebnisse der Messung der Aktivitäten der gelagerten Enzymproben sind auch in Tabelle 2 gezeigt. Eine Transglutaminaseprobe, die ohne Zugabe eines Teilproteinhydrolysats als Stabilisierungsmittel behandelt wurde, wurde als Kontrolle eingesetzt.
  • Tabelle 2 zeigt, dass jede der Transglutaminaseproben, die der erfindungsgemäßen Stabilisierungsbehandlung unterworfen wurden, im Vergleich zu der Kontrolle deutlich stabilisiert war. Die Enzymaktivität unmittelbar nach dem Trocknen jeder Probe, die erfindungsgemäß behandelt wurde, ist auch in dieser Tabelle gezeigt, und die Ergebnisse bestätigen auch, dass der Verlust der Enzymaktivität während der Stabilisierungsbehandlung des Enzyms durch Zugabe des Stabilisierungsmittels verringert werden kann.
  • Tabelle 2
    Figure 00130001
  • Unter den Transglutaminasezubereitungsproben des Erfindungsbeispiels 2, die während eines Jahres nach Herstellung gelagert wurden, wurde die Probe, die unter Einsatz eines Weizenproteinteilhydrolysats ("Glutamine Peptide"®, hergestellt von DMV Japan) ausgewählt und zu verschiedenen Nahrungsmitteln, die nachstehend genannt sind, gegeben, um die Enzymfunktion der Transglutaminase zu untersuchen. Die Transglutaminasezubereitung, die unter Einsatz von "Glutamine Peptide"® stabilisiert ist, wird hier einfach als typisches Beispiel eingesetzt, und es versteht sich von selbst, dass Transglutaminasezubereitungsproben, die unter Einsatz anderer Stabilisierungsmittel als "Glutamine Peptide"® hergestellt sind, ähnliche Funktion zeigen. Wenn die erfindungsgemäße Transglutaminasezubereitung auf Proteine oder Peptide wirkt, werden ε-(γ-Glu)-Lys-Vernetzungsbindungen in oder zwischen Proteinen oder Peptiden gebildet, wodurch die Modifikation der Peptide oder Proteine möglich wird.
  • Verwendungsbeispiel 1 (Fleischwurst)
  • Zu 1.000 g, in 3 mm große Würfel geschnittenen Schweinefleisch mit einem Fettanteil von etwa 30% wurden 20 g Salz und 450 g Eiswasser gegeben, und danach wurde unter Einsatz eines Stefan Cutters gründlich gemischt. Es wurden 70 g eines Sojabohnenproteinprodukts ("Ajipron S2"®, hergestellt von Ajinomoto), 5 g Polyphosphat, 10 g Geschmacksmittel ("I-7"®, hergestellt von Ajinomoto) und 10 g (15.000 Einheiten) der vorstehend genannten Transglutaminasezubereitung gegeben, und danach wurde mit einem Stefan Cutter gemischt, bis die Endtemperatur des Gemisches 10°C oder darunter war. Die Menge der zugegebenen TGase war 2,5 Einheiten pro 1 g Protein. Die so erhaltene Fleischpaste wurde in eine Haut verpackt, 15 Minuten bei 80°C in einer Räucherkammer geräuchert und 45 Minuten bei 75°C gekocht und dann abgekühlt, wobei ein Frankfurter erhalten wurde.
  • Als Kontrolle wurden zwei Produkte durch Wiederholen desselben Vorgangs erhalten, außer dass die vorstehend genannte Transglutaminasezubereitung in einer Kontrolle nicht zugegeben wurde und dass die vorstehend genannte Transglutaminasezubereitung in der anderen Kontrolle nicht zugegeben wurde und die Menge des Eiswassers auf 250 g verringert wurde.
  • Wenn die so erhaltenen drei Arten von Frankfurtern organoleptisch verglichen wurden, zeigte sich, dass die Kontrolle, worin 450 g Eiswasser, jedoch keine TGase zugegeben war, einen schwachen Biss ohne Elastizität hatte. Die Form des Endprodukts weich. Wenn jedoch Transglutaminase eingesetzt wurde, zeigte das Produkt, das unter Einsatz von 450 g Eiswasser hergestellt wurde, hervorragende Qualität, ein Beibehalten der Elastizität und der Form, die ähnlich oder überlegen denjenigen Eigenschaften des Produkts waren, das unter Einsatz von 250 g Eiswasser hergestellt wurde. Somit hat der Einsatz der vorstehend genannten Transglutaminasezubereitung eine weitere Verdünnung mit Wasser ermöglicht (Erhöhung des Wasserzugabeanteils), während die Produktqualität der Wurst erhalten blieb.
  • Verwendungsbeispiel 2 (Eiscreme)
  • Eine Portion von 200 g Milch wurde in ein 1-Liter-Gefäß gegeben und bei geringer Hitze auf 50°C erwärmt, und danach wurden drei sorgfältig ausgelöste Eigelb zugegeben. Es wurde 0,2 g der vorstehend genannten Transglutaminasezubereitung (1 Einheit pro 1 g Proteingemisch) zugegeben, und danach wurde das erhaltene Gemisch 10 Minuten stehen gelassen. Während dieses Zeitraums wurde die Temperatur des Gemisches bei 40 bis 50°C kontrolliert. Danach wurden 150 g Zucker und ein Esslöffel Maisstärke zugegeben und gründlich gemischt, und dann wurde das Gemisch bei geringer Hitze unter gründlichem Rühren erwärmt, bis es dick wurde. Dann wurde der Boden des Behälters in Eiswasser gegeben, und es wurden einige Tropfen Vanillees senz unter Mischen des Inhalts des Behälters zugegeben. Eine 150 g Portion rohe Creme wurde unter gründlichem Mischen zugegeben. Dann wurde das so erhaltene Eiscremegemisch in einen Gefrierschrank gegeben und 1 bis 2 Stunden darin aufbewahrt, bis die Oberfläche fest wurde, und dann wurde die gesamte Portion gemischt. Durch dreimaliges Wiederholen dieser Stufe wurde eine Eiscreme erhalten. Als Vergleich wurde eine Eiscreme (Kontrollprodukt) durch dasselbe Verfahren hergestellt, außer dass TGase nicht zugegeben wurde.
  • Bei der organoleptischen Beurteilung der so erhaltenen zwei Arten von Eiscremes war die Eiscreme, die erfindungsgemäß hergestellt wurde, hinsichtlich der Handhabung mit einem Löffel, der Glätte, des öligen Gefühls hervorragend und auch hinsichtlich des Geschmacks und des Aromas hervorragend. Die Formstabilität nach 20 Minuten Stehenlassen bei Raumtemperatur war im Vergleich mit dem Kontrollprodukt ebenfalls hervorragend, wobei die ursprüngliche Form fast vollständig erhalten wurde, obwohl eine leichte Klebrigkeit beobachtet wurde. Diese charakteristischen Eigenschaften können auf die Stabilisierung der Milchproteinemulsion zurückgeführt werden, die durch die Wirkung der Transglutaminase auf das Milchprotein unter Bildung von Glu-Lys-Bindungen bewirkt wird.
  • Verwendungsbeispiel 3 (Joghurt)
  • Eine 1-kg-Portion Milch (8,3% fettfreier Feststoffgehalt) wurde in einen 2-Liter-Becher gegeben und mit der vorstehend genannten Transglutaminasezubereitung in einem Verhältnis von 1 Einheit pro 1 g Milchprotein gemischt, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 25°C gerührt. Nach 1-stündigem Stehenlassen wurde das Gemisch auf 95°C erhitzt, um die Transglutaminase zu inaktivieren. Nachdem die Temperatur 95°C erreicht hatte, wurde das Gemisch unmittelbar danach auf 44°C abgekühlt und mit 1,5% (Betonung auf das Milchmaterial) eines käuflich erwerbbaren Milchsäurebakteriumstarters "Joghurt V2"®, hergestellt von WIESY) gemischt, und danach wurde eine Fermentation bei derselben Temperatur während etwa 4,5 Stunden durchgeführt (erfindungsgemäßes Produkt). Das so erhaltene Joghurtversuchsprodukt hatte einen pH-Wert von 4,65. Als Vergleich wurde eine Joghurtprobe durch dasselbe Verfahren hergestellt, außer dass die vorstehend genannte Transglutaminasezubereitung nicht eingesetzt wurde (Kontrollprodukt).
  • Beim Stehenlassen jedes dieser Versuchsprodukte während 3 Wochen in einem Kühlschrank (etwa 15°C) erreichte der Wasserabscheidungsanteil (Gewichtsverhältnis des abgetrennten Milchserums zu dem Gesamtjoghurt) der Transglutaminase-freien Kontrolle 4,5%, das erfindungsgemäße Produkt mit zugegebener Transglutaminase zeigte ein Abscheidungsverhältnis von nur 0,2%, wobei augenscheinlich kaum Wasser abgeschieden wurde, und dieser Effekt war noch stärker 40 Tage nach der Herstellung.
  • Die organoleptische Beurteilung durch 20 Experten 40 Tage nach der Herstellung zeigte, dass das Kontrollprodukt einige rohe Granulate enthielt und es beim Verzehr rau war, während Rohgranulate in dem erfindungsgemäßen Produkt nicht gefunden wurden, welches einem dem Joghurt eigenes glattes Gefühl beim Verzehr zeigte. Ähnlich wie im vorstehend genannten Fall können diese charakteristischen Eigenschaften auf die Stabilisierung der Milchproteinemulsion zurückgeführt werden, die durch die Wirkung von TGase auf das Milchprotein unter Bildung von Glu-Lys-Bindungen bewirkt wird.
  • Verwendungsbeispiel 4 (Brot)
  • Eine 700-g-Portion Weizenmehl (hartes Mehl Klasse 1) wurde mit 20 g Hefe, 1,3 g Hefenährstoffe und 380 g Wasser unter Einsatz eines Mischers gemischt, und das Gemisch wurde 4 Stunden bei 25°C und einer Luftfeuchtigkeit von 75% unter Bewirken einer primären Fermentation stehen gelassen, wodurch ein schwammartiger Teig erhalten wurde. Nach dem vollständigen Ablauf der Fermentation zeigte der Teig eine Temperatur von 28°C und einen pH-Wert von 5,3. Unter Einsatz eines Mischers wurde dieser schwammartige Teig mit 300 g eines weiteren Teigmaterials (halb hartes Weizenmehl Klasse 1), 20 g Salz, 30 g Zucker, 30 g Glucose, 30 g Würzmittel, 220 g Wasser und 0,2 Einheit pro 1 g Protein der vorstehend genannten Transglutaminasezubereitung weiter geknetet. Nach dem Stehenlassen während etwa 10 Minuten bei derselben Temperatur wie das Kneten wurde der Teig in 5 gleich große Kugeln geteilt, die 10 Minuten bei 28°C stehen gelassen und dann in eine Backform gegeben wurden. Danach wurde erneut eine Fermentation während 50 Minuten bei 37°C und einer Luftfeuchtigkeit von 85% durchgeführt. Dann wurde der so fermentierte Teig in einen Ofen gegeben und 40 Minuten bei 220°C gebacken, wobei Weißbrot erhalten wurde (erfindungsgemäßes Produkt). Als Kontrolle wurde ein weiteres Weißbrot durch dasselbe Verfahren hergestellt, außer dass die vorstehend genannte Transglutaminasezubereitung nicht eingesetzt wurde (Kontrollprodukt).
  • Die so erhaltenen zwei Arten von Weißbrotproben wurden auf die folgende Weise organoleptisch beurteilt. Jede der Weißbrotproben wurde 4 Tage nach dem Backen in Scheiben mit 1,5 cm Dicke geschnitten, um eine organoleptische Beurteilung durch 10 Testpersonen (5 Männer und 5 Frauen) hinsichtlich der Struktur, des Aussehens, der Elastizität und des Essgefühls durchzuführen, wobei gefunden wurde, dass das Produkt hinsichtlich aller Beurteilungskriterien im Vergleich zum Transglutaminasefreien Kontrollprodukt hervorragend war.
  • Verwendungsbeispiel 5 (Spaghetti)
  • Eine 2.000-g-Portion Durum-Semolina-Mehl ("Leone B"®, hergestellt von Nisshin Flour Milling) wurde mit 1 Einheit pro 1 g Mehlprotein der vorstehend genannten Transglutaminasezubereitung und 600 g Leitungswasser gemischt, und das Gemisch wurde 10 Minuten geknetet, und unmittelbar danach wurden mit einer Nudelmaschine Spaghetti hergestellt, die auf eine Länge von etwa 40 cm geschnitten wurden (erfindungsgemäßes Produkt). Gleichzeitig wurden Spaghetti durch dasselbe Verfahren hergestellt, außer dass die vorstehend genannte Transglutaminasezubereitung nicht zugegeben wurde (Kontrollprodukt).
  • Die Beurteilung der so erhaltenen Nudelproben zeigte, dass das Transglutaminase-versetzte Produkt hinsichtlich der Härte und der Elastizität, nämlich der Viskoelastizität, und der organoleptischen Beurteilung im Vergleich zum Transglutaminasefreien Kontrollprodukt hervorragend war.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Durch die vorliegende Erfindung kann eine Transglutaminasezubereitung, die einen extrem niedrigen Grad an Aktivitätsverlust selbst nach Stehenlassen bei Normaltemperatur zeigt, leicht erhalten werden. Diese erfindungsgemäße Transglutaminasezubereitung kann bei Normaltemperatur über einen langen Zeitraum gelagert werden.
  • Zusätzlich kann die erfindungsgemäße Transglutaminasezubereitung nicht nur für die Herstellung verschiedener Nahrungsmittel, wie Wurst, Eiscreme, Joghurt, Brot, Spaghetti und dergleichen, eingesetzt werden, es können durch die Verwendung dieser Zubereitung auch Proteine oder Peptide, die in Rohmaterialien dieser Nahrungsmittel enthalten sind, modifiziert werden und somit die Qualität dieser Nahrungsmittel verbessert werden.

Claims (6)

  1. Transglutaminasezubereitung, umfassend eine Transglutaminaseenzym und ein Teilproteinhydrolysat, erhältlich durch Trocknen einer Lösung, die Transglutaminase und ein Teilproteinhydrolysat enthält.
  2. Transglutaminasezubereitung nach Anspruch 1, die in gefriergetrockneter Form vorliegt.
  3. Transglutaminaseenzymzubereitung, welche die stabilisierte Transglutaminasezubereitung nach Anspruch 1 oder 2 und ein Zusatzmittel umfaßt.
  4. Transglutaminaseenzymzubereitung nach Anspruch 3, worin das Zusatzmittel mindestens ein Mitglied ist, ausgewählt aus Polyphenol und Salzen organischer Säuren.
  5. Verfahren zur Modifizierung von Proteinen oder Peptiden, umfassend das Ermöglichen des Einwirkens der stabilisierten Transglutaminasezubereitung nach Anspruch 1 oder 2 oder deren Enzymzubereitung der Ansprüche 3 oder 4 auf ein Protein oder ein Peptid, wodurch die Bildung einer ε-(γ-Glu)-Lys-Vernetzungsbindung in oder zwischen Molekülen des Protein oder Peptids bewirkt wird.
  6. Transglutaminasepackung, in welcher die stabilisierte Transglutaminasezubereitung nach Anspruch 1 oder 2 oder die Enzymzubereitung von Anspruch 3 oder 4 in einem Behälter aus einem Material mit einer Sauerstoffdurchlässigkeit von 100 ml/m2·101325 Pa·24 h oder weniger verpackt oder versiegelt ist, oder einer Vakuumverpackung unterzogen wurde, oder einer Stickstoff-gefüllten Verpackung, normalerweise zusammen mit einem Sauerstofffänger.
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