ITMI20062080A1 - Trattamento di farine di cereali per il consumo alimentare da parte di pazienti celiaci - Google Patents

Trattamento di farine di cereali per il consumo alimentare da parte di pazienti celiaci Download PDF

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ITMI20062080A1
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Mauro Rossi
Rosa Anna Siciliano
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Description

7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:
“Trattamento di farine di cereali per il consumo alimentare da parte di pazienti celiaci”
a nome di: CONSIGLIO NAZIONALE DELLE RICERCHE
con sede in: P.LE ALDO MORO 7, 00185 ROMA
inventori designati : ROSSI Mauro; GIANFRANI Carmela;
SICILIANO Rosa Anna
dep. il con num.
***************************
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione riguarda la modificazione enzimatica di prodotti cerealicoli per uso alimentare e/o dietetico.
TECNICA ANTERIORE
La celiachia o enteropatia glutine-sensibile è una delle forme più diffuse di intolleranze alimentari. La malattia si manifesta, in individui geneticamente suscettibili, in seguito ad ingestione di gliadina, il maggiore costituente proteico del glutine del frumento, o di proteine analoghe presenti in altri cereali di uso comune quali orzo, segale ed avena. L’intolleranza viene diagnosticata, nella maggior parte dei casi, nei primi tre anni di vita, anche se non mancano casi in cui si manifesta tardivamente o è del tutto asintomatica. La celiachia ha una grande rilevanza epidemiologica: in Europa si calcola che il rapporto per i casi conclamati di malattia sia di 1:1000 nati vivi, ma se si considerano anche i casi latenti e asintomatici, la frequenza diventa in realtà più elevata, raggiungendo un rapporto di 1:200 (Maki et al, 2003). Da un punto di 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
vista clinico i soggetti celiaci soffrono di gravi sindromi da malassorbimento (diarrea, perdita di peso, ritardo della crescita, anemia sideropenica, steatorrea), mentre l’esame istologico della mucosa dell’intestino tenue, sede della lesione, evidenzia iperplasia delle cripte e diversi gradi di atrofia dei villi intestinali.
L’eccesso di mortalità che, purtroppo, si riscontra nei celiaci non è comunque dovuto al malassorbimento, bensì all’aumentato rischio di malattie linfoproliferative, principalmente linfomi intestinali. L’unico approccio terapeutico al momento efficace è la dieta completamente priva di glutine, da seguire per tutta la vita: solo così, infatti, vengono ripristinate e conservate sia la normale architettura tissutale che le funzioni mucosali. Il rigido mantenimento di una tale dieta non è comunque di semplice attuazione, considerato che piccole quantità di glutine sono state identificate in fonti alimentari non sospette e rappresenta, comunque, una restrizione abbastanza forte che giustifica gli sforzi tesi a trovare delle strategie alternative.
Numerose evidenze sperimentali indicano che la lesione mucosale è prodotta da un’alterata risposta immunitaria nei confronti della gliadina. L’analisi di biopsie digiunali prelevate da pazienti celiaci ha messo in evidenza che in queste mucose sussiste una massiva infiltrazione linfocitaria sia nella lamina propria, con prevalenza di cellule T CD4<+>“helper”, che nell’epitelio soprastante, in larga parte CD8<+>“citotossiche”. Un altro importante segno di attivazione immunitaria osservato è l’aumento di cellule esprimenti il recettore per l’interleuchina-2, necessario per il processo di proliferazione linfocitaria .
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La completa normalizzazione sia del quadro clinico che istologico che si raggiunge dopo l’eliminazione del glutine dalla dieta, insieme con la ricomparsa di tutti i fenomeni infiammatori descritti con l’ingestione successiva anche di minime quantità di glutine, forniscono prove ulteriori che la gliadina agisce attivando in maniera reversibile i linfociti T infiltranti la mucosa. Inoltre, la possibilità di isolare cloni di cellule T infiammatorie dalla mucosa di celiaco che rispondono specificamente alla gliadina, avvalora ulteriormente l'ipotesi di un meccanismo immunologico cellulo-mediato gliadina-dipendente (Shan et al, 2002).
Più recentemente è stato osservato che la deamidazione enzimatica di specifici residui di glutammina contenuti nella molecola di gliadina è coinvolta nell’induzione della risposta immune al glutine nei soggetti celiaci. Questa reazione viene effettuata dalla transglutaminasi tissutale (tTG) presente nella mucosa intestinale. In particolare, è stato dimostrato che la trasformazione delle glutammine in acido glutammico ad opera della tTG aumenta l’affinità di legame dei frammenti di glutine per le molecole di istocompatibilità HLA associate alla celiachia (Molberg et al, 1998), cioè HLA-DQ2, espressa dal 95 % dei pazienti celiaci, e HLA-DQ8, espressa dal restante 5%. In particolare si ritiene che l’aumentata affinità di legame sia la conseguenza della presenza di una nuova carica negativa sul peptide gliadinico. Il complesso molecola di istocompatibilità-peptide gliadinico deamidato, esposto sulla superficie delle cellule presentanti l’antigene, interagisce con il recettore presente sulla superficie dei linfociti T gliadina-specifici attivandoli, con conseguente proliferazione linfocitaria e secrezione di citochine 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
infiammatorie, responsabili del danno mucosale (van de Wal et al, 1997; Kim et al, 2004).
Nonostante quindi si stiano chiarendo sempre meglio i meccanismi molecolari alla base della celiachia, risulta sempre sentita nel settore la necessità di disporre di prodotti derivati da cereali, che risultino non tossici per soggetti celiaci. Attualmente infatti, i prodotti dietetici per persone sensibili al glutine sono preparati esclusivamente con farine derivate dal riso o dal mais.
Finora sono stati tentati diversi trattamenti per rendere possibile l’assunzione anche di cereali “tossici" ai celiaci, anche se a partire da un approccio molto diverso da quello degli autori della presente invenzione, quello cioè di determinare la detossificazione dei peptidi immunoreattivi in vivo, nello stesso paziente, attraverso un metodo terapeutico, di somministrazione di molecole in grado di agire in tale contesto. Un esempio di questo approccio è quello proposto in W099/56698 o quello suggerito in Matysiak-Budnik et al., Gastroenterology, 2005,129: 786-796, che propone la somministrazione di enzimi orali insieme con l’assunzione di gliadina o di glutine.
L’approccio dell’invenzione è completamente diverso cioè permette il trattamento dei prodotti e la loro detossificazione, prima dell’assunzione da parte di soggetti celiaci, utilizzando un enzima, la transglutaminasi (proteina-glutammina: ammina γ-glutamil-transferasi, EC 2.3.2.13) la cui forma isolata da batteri (mTG) è già utilizzata nell'industria alimentare. Tale enzima (mTG) è già in uso, anche per prodotti a base di cereali, o di loro derivati, per aumentare la compattezza del prodotto trattato 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
(Collar et al., 2005). Tra gli altri usi della mTG ricordiamo l’uso per aumentare il valore nutrizionale del glutine mediante introduzione di lisina o dipeptidi della lisina (Yokoyama, 2004)
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1. Spettro di massa MALDI-TOF del peptide 56-68 dell'a-gliadina dopo transamidazione con lisina. Gli ioni satelliti sono dovuti ad addotti di sodio e potassio.
Figura 2. Produzione di IFNyda linee iTCLs (intestinal T Celi Lines ) in seguito a stimolazione con PT-gliadina isolata da farine sottoposte a trattamento con mTG lisina o estere metilico di lisina.
Legenda dei simboli: ctrA, farina trattata solo con mTG; ctrB, farina non trattata; K, farina trattata con mTG e lisina; CH3-K, farina trattata con mTG ed estere metilico di lisina; tTG, il PT-gliadina prodotto dopo trattamento delle farine è sottoposto a deamidazione con tTG. Nessuna differenza in termini di efficacia del trattamento è emersa tra le due condizioni di reazione testate: a, 2 ore a temp ambiente con 20 mM lisina o estere metilico della lisina; b, 4 ore a 37°C con 2 M lisina o estere metilico della lisina.
I risultati riportati nella figura rappresentano la media DS dei risultati ottenuti testando 6 delle 12 linee linfocitarie definite nella Tabella I; gli esperimenti per ciascuna linea sono stati ripetuti almeno 2 volte. I risultati sono stati analizzati mediante ANOVA e test di Tukey per la verifica della significatività statistica (P< 0.05).<*>: differente da ctrB+ tTG; #: differente da K+ tTG.
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SOMMARIO
La presente invenzione riguarda un metodo per il trattamento di prodotti cerealicoli e loro derivati contenenti prolammine che comprende un trattamento enzimatico con transglutaminasi (ammina γ-glutamiltransferasi E.C 2.3.2.1.3) in condizioni che favoriscono la transamidazione di residui di glutammina in una catena peptidica ed abbattono l’efficienza di una concomitante deamidazione. In particolare il trattamento riguarda prolammine che comprendono o consistono di glutine e/o gliadina.
Possono essere utilizzate sia transglutaminasi tissutale che microbiche, sia di natura estrattiva che ricombinante, ma preferibilmente food-grade. La reazione avviene in presenza di un derivato alchilico della lisina o di una ammina primaria: preferibilmente tale derivato alchilico della lisina comprende un alchile a catena corta C1-C4ed è preferibilmente un estere alchilico, preferibilmente metilico, della lisina. Il metodo è particolarmente adatto per eliminare la tossicità di prodotti e derivati cerealicoli di avena, frumento, orzo, segale verso i pazienti celiaci ed è applicabile anche e direttamente alle farine o alle semole.
Il metodo quindi è utilizzabile industrialmente per detossificare le farine, prima del loro impiego nella preparazione di prodotti alimentari e/o dietetici.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Oggetto della presente invenzione è un metodo che utilizza l’attività catalitica della transglutaminasi (proteina-glutammina: ammina γglutamil-transferasi, EC 2.3.2.13), preferibilmente microbica per la 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
modificazione di prolammine derivate da cereali, abbattendo la capacità immuno-stimolatoria di alcuni tipi di prolammina su linee linfocitarie isolate da pazienti celiaci, responsabile deH’enteropatia glutine-sensibile. Il procedimento è particolarmente vantaggioso perché è attuabile direttamente su farine e semole che una volta modificate e detossificate sono utilizzate per la preparazione del prodotto alimentare.
Il procedimento messo a punto sfrutta una proprietà deH’enzima transglutaminasi identificata dai presenti inventori per la prima volta, che si attiva utilizzando l’enzima in presenza del substrato (la prolammina da modificare presente nella farina o nel derivato cerealicolo) e di un derivato alchilico della lisina, preferibilmente in condizioni basiche.
L’enzima transglutaminasi catalizza normalmente la reazione di trasferimento di un acile tra residui di lisina e glutammina inseriti all’interno di catene proteiche, portando così alla formazione di legami iso-peptidici intermolecolari, importanti in diversi processi biologici, come ad esempio la formazione del coagulo sanguigno.
Gli inventori hanno individuato le condizioni di reazione alle quali l’enzima transglutaminasi in presenza di un donatore di gruppi amminici non proteico (cioè libero), opera una transamidazione con formazione di un legame iso-peptidico ad alta efficienza, rendendo al contempo virtualmente pari a zero l’efficienza della reazione parallela di deamidazione.
Questa possibilità è stata dapprima verificata utilizzando una transglutaminasi tissutale (tTG) di mammifero ( guinea pig) su un digesto peptico-triptico di gliadina, in condizioni di reazione che favoriscono la 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
reazione di transamidazione (con formazione di legame iso-peptidico) rispetto a quella di deamidazione.
Tali condizioni risultano essere principalmente la presenza di un derivato alchilico della lisina o di un donatore di gruppi amminici alchilato libero in concomitanza, per la tTG, preferibilmente, di un pH alcalino (superiore a 7.5, preferibilmente compreso tra 8 e 9). Successivamente il metodo è stato messo a punto direttamente su farina di frumento utilizzando la transglutaminasi microbica (mTG), un enzima food-grade, ed un donatore di gruppi amminici, quali ad esempio un ammina primaria o un derivato della lisina, preferibilmente un derivato alchilico della lisina, ancor più preferibilmente un estere metilico della lisina.
Pertanto un aspetto preferito dell’invenzione riguarda un metodo per il trattamento di prodotti cerealicoli sfarinati (farine e semole) e loro derivati che comprende un trattamento enzimatico con transglutaminasi in condizioni che favoriscono la transamidazione di residui aminoacidici di un composto prolamminico e azzerano l’efficienza della reazione di deamidazione. Tali condizioni sono la presenza di un donatore di gruppi amminici alchilato, quali ad esempio un ammina primaria o un derivato della lisina, preferibilmente un derivato alchilico della lisina, ancor più preferibilmente un estere metilico della lisina.
Secondo la presente invenzione, per prodotti cerealicoli si intendono sfarinati, semole di varia granatura ottenuti da cereali, preferibilmente da frumento, orzo, segale ed avena. Sono compresi anche derivati di tali cereali ottenuti per trattamento chimico o chimico-fisico da farine semole o da chicchi interi o sminuzzati, quali ad esempio estratti proteici 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
comprendenti glutine e/o gliadina, digesti peptico-triptici oppure amido di frumento che può contenere glutine come contaminante.
Il metodo diventa di grande interesse quando il prodotto prolamminico comprende glutine e/o gliadina, in quanto il trattamento messo a punto nella presente invenzione blocca le frazioni altamente immunoreattive di prodotti cerealicoli, responsabili del morbo celiaco.
Senza essere vincolato ad alcuna teoria, ma solo per dovere di citazione è stato osservato che nel paziente celiaco, la transglutaminasi tissutale endogena (tTG) può, in assenza di amine primarie o in particolari condizioni di pH, deamidare i residui di glutammina in acido glutammico introducendo cariche negative nella molecola. Queste cariche negative aumentano l’affinità di legame della gliadina per le molecole HLA, per cui i frammenti di gliadina sono presentati con maggiore efficienza ai linfociti T innescando il processo infiammatorio che è alla base della patologia intestinale nella MC (Sollid and Khosla, 2002).
L’abbattimento della capacità di immunostimolazione della gliadina ottenuto con il procedimento dell’invenzione, è stato dapprima verificato in diversi sistemi sperimentali, utilizzando transglutaminasi di origine diversa, e quindi ottimizzato per il trattamento di prodotti per uso alimentare.
Nei sistemi sperimentali utilizzati, quali ad esempio un digesto pepticotriptico di gliadina, sia l’enzima tTG di guinea pig che la transglutaminasi microbica (mTG) hanno dato risultati comparabili. Nello stesso sistema sperimentale è stato inoltre verificato che la sola presenza di un donatore di gruppi amminici quale l’amminoacido lisina non è condizione 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
sufficiente ad abolire completamente l’attività immunostimolatoria delle prolammine tossiche (Anderson et al., 2000), anche se ai valori di pH alcalino utilizzati non si forma alcuna traccia della forma deamidata. Infatti è solo in presenza di derivati alchilici di donatori di gruppi amminici, preferibilmente di un estere alchilico della lisina, ancor più preferibilmente un estere metilico della lisina, che si forma una sola forma molecolare corrispondente all’isopeptide e che tale forma è priva di qualsiasi attività immunostimolatoria sulle cellule derivate da pazienti celiaci.
Questi risultati indicano che la transglutaminasi può essere utilizzata in totale sicurezza anche a pH alcalino in modo da non generare, come sottoprodotto della reazione di transamidazione, molecole di gliadina deamidate altamente immunoreattive. Il presente trovato costituisce quindi un risultato sorprendente rispetto a quanto riportato in letteratura (Anderson et al, 2000)
Poiché il principio per cui prolammine diverse dalla gliadina risultano tossiche per individui particolarmente sensibili, è analogo, l’invenzione si estende a prolammine diverse da gliadina, che possono essere trattate nelle stesse condizioni di reazione individuate nel presente brevetto ed in cui la tossicità può essere completamente abbattuta dal metodo dell’invenzione.
In accordo con il metodo dell’invenzione ed in base alle conferme sperimentali ottenute, è possibile utilizzare transglutaminasi tissutale (tTG), da altra fonte animale (Sano et al 1996), vegetale (Serafini-Fracassini and Del Duca, 2002) e microbica (mTG) (Iranzo et al 2002).
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Transglutaminasi microbiche, quali quelle descritte in Yokoyama K. et al., 2004, sono preferite: esse presentano infatti il vantaggio di non richiedere Ca<++>quale cofattore.
Particolarmente preferita è la mTG di Streptomyces mobarensis che può essere estrattiva o ricombinante (Zhu et al 1995) e che esiste in forma food-grade. Altre mTG sono utilizzabili, anche se sono preferite mTG che abbiano come substrato naturale la lisina. L’enzima viene utilizzato in quantità usuali per il tecnico del ramo, preferibilmente in quantità di circa 1-10 U/g substrato
La reazione enzimatica con mTG procede per almeno 1 ora a temperatura superiore a 4°C, o, preferibilmente, a temperatura superiore a 25°C. Secondo una applicazione preferita il prodotto da trattare è disciolto in una sospensione acquosa, per le farine in concentrazione non superiore a 100 mg/ml.
Il gruppo donatore di gruppi amminici è preferibilmente un derivato alchilico della lisina, preferibilmente un estere alchilico della lisina dove particolarmente preferiti sono alchili a catena corta C1-C4. L’estere alchilico della lisina è aggiunto o disciolto in quantità compresa tra 10 e 40 mM.
Particolarmente preferiti sono i substrati, comprendendo con il termine farine, estratti prolamminici o proteine purificate, comprendenti glutine, avenina, ordeina o secalina e quindi, più in generale, qualsiasi derivato di frumento, avena, orzo, segale preferibilmente sotto forma di farina, semola, polvere o granulati, anche e preferibilmente, per uso alimentare. Come già messo in evidenza precedentemente, il metodo può essere 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
attuato direttamente sulla farina, semola o estratto da detossificare. E’ già riportato in letteratura che il trattamento con mTG dà farine ad alto grado di qualità e che mantengono le qualità organolettiche e quelle visco-elastiche e meccaniche ottimali (Collar, 2005).
Secondo un aspetto che risulta particolarmente preferito, il trattamento diretto del prodotto alimentare, si articola nelle seguenti fasi:
- discioglimento o diluizione del composto da detossificare (digesto enzimatico, farina, semola, soluzione) in proporzioni preferibilmente deducibili dalle seguenti condizioni sperimentali ottimali: 1,2 g di farina di frumento di commercio risospesi in 10 mi di acqua o tampone acquoso contenente circa 10 U mTG transglutaminasi);
- aggiunta di gruppo donatore di gruppi amminici come sopra definito e preferibilmente di un derivato, preferibilmente un estere, alchilico della lisina, preferibilmente in concentrazione compresa tra 10 e 40 mM nel caso di estere metilico di lisina;
- incubazione a 20 - 40°C per almeno 1-2 ore, con opzionale agitazione nel caso in cui il substrato sia una polvere o una semola,
- eventuale precipitazione o purificazione, ad esempio mediante separazione delle fasi (liquida e solida).
I prodotti ottenuti dalla reazione risultano chimicamente modificati e dimostrano anche proprietà antigeniche diverse dai prodotti non trattati o trattati in altre condizioni, risultando meno abili o del tutto incapaci di stimolare in vitro i linfociti di pazienti celiaci. Come dimostrato sperimentalmente nel prosieguo della presente domanda di brevetto, essi risultano avere almeno un residuo di glutammina, compreso nel 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
peptide corrispondente al frammento p56-68 dell’a-gliadina, impegnato nel legame isopeptidico con la lisina contenente in posizione a il gruppo alchilico .
Le modifiche chimiche indotte sul peptide corrispondente al frammento p56-68 della gliadina (transamidazione in presenza di estere alchilico) possono essere monitorate mediante spettrometria di massa che permette di osservare la presenza di un forte segnale a m/z 1697,94 con uno spostamento di massa di 129 kDa rispetto al valore m/z teorico del peptide p56-68 tal quale. In maniera analoga, è rilevabile la presenza di una sola forma molecolare corrispondente all’isopeptide.
Tale modifica è anche evidenziabile in peptidi corrispondenti a quello della gliadina di prolammine diverse dalla gliadina quali: avenina e/o ordeina e/o secalina. sono transamidati ed impegnati in un legame isopeptidico. Pertanto rientrano nella presente invenzione anche i prodotti derivati ed ottenibili secondo il procedimento descritto ed i prodotti alimentari contenenti prolammine modificate come sopra descritto.
Le condizioni di reazione enzimatica in presenza di derivati alchilici della lisina in cui si riscontra la totale assenza di contaminanti deammidati, sono estendibili ad altri usi della transglutaminasi tissutale o microbica nei quali sia preferibile avere con alta efficienza transamidazione rispetto a deamidazione. Pertanto l’invenzione si estende all’uso di una transglutaminasi (ammina γ-glutamil-transferasi E.C 2.3.2.1.3) quando tissutale (tTG) preferibilmente in condizioni alcaline (pH superiore a 7.5 e preferibilmente compreso tra 8 e 9) ed in presenza di un derivato 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
alchilico della lisina per transamidare e legare in legame isopeptidico residui aminoacidici di glutammina con alta efficienza.
Il metodo dell’invenzione è applicabile industrialmente in tutti i processi per la preparazione di prodotti alimentari speciali o dietetici, formulati per individui sensibili al glutine, e comprende un trattamento delle farine, delle semole o dei derivati di cereali o delle loro miscele secondo quanto descritto sopra, in particolare utilizzando l’enzima food-grade (mTG). PARTE SPERIMENTALE
Materiali e Metodi
Preparazione di un digesto peptico-triptico di gliadina (PT-gliadina). 20 mg di gliadina sono risospesi in 200 μΙ HCI 0.2 N pH 1,8 in presenza di pepsina (rapporto proteina:enzima 100:1) ed incubati per 4 ore a 37 °C. Il pH è quindi portato a 8,5 mediante aggiunta di Tris (concentrazione finale 0.125 M). Alla soluzione viene aggiunta tripsina (rapporto proteina:enzima 100:1) e l’incubazione a 37 °C è proseguita per altre 2 ore. La reazione è infine bloccata mediante bollitura del campione per 10 min. I campioni vengono conservati a -20°C fino al momento di utilizzo.
Deamidazione di PT-gliadina. 2 mg PT-gliadina sono risospesi in 1 mi Tris/HCI 0,125 M pH 8,5 contenente cloruro di calcio 1 mM, ditiotreitolo 10 mM e 200 μg tTG. La reazione è condotta per 4 ore a 37°C, quindi bloccata mediante bollitura del campione per 10 min. I campioni vengono conservati a -20°C fino al momento di utilizzo.
Transamidazione di PT-gliadina. PT-gliadina (2 mg) e lisina o estere metilico di lisina (20 mM) sono risospesi in 1 mi Tris/HCI 0,125 M pH 8,5 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
contenente cloruro di calcio 1 mM, ditiotreitolo 10 mM e 200 pg tTG. La reazione è condotta per 4 ore a 37°C, quindi bloccata mediante bollitura del campione per 10 min. I campioni vengono conservati a -20°C fino al momento di utilizzo.
Analisi di spettrometria di massa MALDI-TOF. La reazione di transamidazione viene monitorata utilizzando come modello un peptide di sintesi dell’a-gliadina (residui 56-68, LQLQPFPQLPY). Dopo reazione gli spettri di massa sono acquisiti mediante accumulo di 100 laser shots, usando come standard interni i picchi monoisotopici di angiotensina (m/z 931,5154) e ACTH (m/z 2465, 1989), così da ridurre l’errore sperimentale a meno di 20 ppm; i valori sono riportati come masse monoisotopiche.
Trattamento enzimatico della farina. 1,2 g di farina di frumento di commercio sono risospesi in 10 mi di acqua contenente 8 U mTG (N-Zyme Biotec, GMbH, Darmstadt, Germany) e 20 mM o 2 M lisina o estere metilico di lisina; la reazione è condotta per 2 ore a temp. ambiente o per 4 ore a 37°C.
Estrazione della gliadina. La sospensione acquosa di farina è trasferita in tampone sodio fosfato 67 mM pH 7,6 contenente NaCI 0,4 M ed estratta mediante agitazione per 30 min, seguita da centrifugazione per 15 min a 15.500 g. Il pellet viene recuperato e risospeso in 20 mi di soluzione acquosa di etanolo (70%) ed estratto mediante agitazione per 45 min, seguita da centrifugazione per 15 min a 15.500 g. Il supernatante costituito da gliadina viene quindi liofilizzato e conservato a -20°C fino al momento di utilizzo.
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Generazione di linee linfocitarie T intestinali gliadina-specifiche. Dodici pazienti celiaci adulti consenzienti HLA-DQ2<+>di cui otto trattati con dieta (intervallo di età 18-49 anni, media 29,49) e 4 non trattati (intervallo di età 18-34, media 27) sono stati arruolati per lo studio. Espianti mucosali digiunali di questi pazienti sono digeriti con collagenasi A. Le cellule intestinali sono risospese in mezzo di coltura RPMI supplementato con antibiotici, amminoacidi non essenziali, sodio piruvato, glutammina e siero umano inattivato (10%) ad una densità di 2x10<5>/ml. Le cellule sono quindi stimolate con cellule di sangue periferico autologo (PBMCs; 1x10<6>/ml) irradiate (3500 Rad) e PT-gliadina deamidata mediante trattamento con tTG (50 pg/ml). Ventiquattro ore più tardi alle colture viene aggiunto mezzo fresco contenente IL-15 10 ng/ml. Al giorno 7, le linee intestinali T (iTCLs) prodotte sono stimolate nuovamente con antigene e PBMCs seguite da aggiunta di mezzo fresco e IL-15 il giorno dopo e ad intervalli di 3-4 giorni. Tutte le iTCLs ottenute risultano positive per l’espressione della molecola CD4.
Analisi delle iTCLs. Le linee T sono testate quando sono nella fase di resting, utilizzando come cellule presentanti l’antigene (APCs) linee linfoblastoidi B trasformate dello stesso aplotipo HLA. APCs irradiate (5x10<s>/ml) sono incubate per 18 ore con PT-gliadina (50 pg/ml) in micropiastre da 96 pozzetti. A ciascun pozzetto sono aggiunte le iTCLs (1,5x10<5>/ml) in un volume finale di 200 pi. Dopo 48 ore di incubazione sono raccolte aliquote del supernatante per la determinazione della produzione di IFNy (marker infiammatorio) mediante metodica ELISA.
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Esempio 1. Caratterizzazione delle modifiche strutturali indotte sul peptide dal trattamento enzimatico .
Allo scopo di determinare le modifiche strutturali inducibili dalla transglutaminasi, un peptide sintetico dell'a-gliadina p56-68, contenente un epitopo immunodominante della gliadina (Shan et al 2002) è incubato in presenza o in assenza di lisina o estere metilico della lisina e tTG. Le modifiche indotte dalla reazione sono monitorate mediante spettrometria di massa. Si può osservare che p56-68 reagisce con la lisina originando un forte segnale a m/z 1697,94 (Fig. 1) con uno spostamento di massa di 129 kDa rispetto al valore m/z teorico del peptide tal quale. E’ interessante osservare che, ai valori di pH alcalino utilizzati non si forma alcuna traccia della forma deamidata. In maniera analoga una sola forma molecolare corrispondente aH’isopeptide si forma in seguito a trattamento enzimatico in condizioni alcaline con l’estere metilico della lisina. Pertanto questi risultati indicano che, contrariamente a quanto riportato in letteratura (Anderson et al, 2000), la transglutaminasi può essere utilizzata in totale sicurezza a pH alcalino in modo da non generare, come sottoprodotto della reazione di transamidazione, molecole di gliadina deamidate altamente immunoreattive ed in particolare che la transglutaminasi in condizioni alcaline converte il 100% di substrato nella sua forma transamidata.
Esempio 2. Valutazione della produzione di IFN-γ da linfociti di pazienti celiaci in seguito a stimolazione con i peptidi modificati secondo l’invenzione o secondo l’arte anteriore.
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La transamidazione è in grado di inibire la risposta immune in vitro verso la gliadina. La capacità della reazione di transamidazione in condizioni alcaline di inibire la risposta immune alla gliadina è valutata utilizzando iTCLs provenienti da pazienti celiaci. Le iTCLs sono incubate in presenza di un digesto peptico-triptico di gliadina di frumento (PT-gliadina) trattato con tTG in presenza o meno di donatore di gruppo amminico. I risultati relativi alla produzione di IFNy secreto nel supernatante delle colture sono riportati in Tabella I. Tutte le linee iTCLs dimostrano di produrre specificamente la citochina infiammatoria in seguito a stimolazione con PT-gliadina deamidata; alcuni campioni producono una buona risposta anche in presenza di PT-gliadina nativa, probabilmente a causa di deamidazione aspecifica indotta dal trattamento acido durante la digestione con pepsina. E’ interessante notare che la reazione di transamidazione in condizioni alcaline è in grado di abbattere la produzione della citochina, ad eccezione del campione CD2.
Esempio 3. Ottimizzazione della reazione di transamidazione.
Sorprendentemente, la comparazione tra i risultati ottenuti con lisina ed estere metilico della lisina dimostra in maniera inequivocabile che quest’ultima è molto più efficace neH’inibire la produzione di IFNy riducendo i valori ai livelli trascurabili di base riportati per il solo mezzo in buona parte dei campioni esaminati, ad eccezione di CD2 (Tabella 1). La linea isolata da questo paziente in realtà reagisce bene anche alla gliadina non deamidata (vedi tabella) e questo può spiegare l'inefficacia per questo campione della reazione di transamidazione. Nell'insieme i 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
dati ottenuti suggeriscono che la residua carica negativa del gruppo carbossilico della lisina, legata con legame isopeptidico alla glutammina, determina ancora un certo grado di affinità per la molecola HLA; la presenza di un gruppo metilico annulla invece tale carica riducendo in maniera ottimale l’interazione.
Tabella 1. Produzione di IFNy valutata nel supernatante di coltura delle iTCLs da pazienti celiaci preparazioni di PT-gliadina trattate con tTG.
IFNy<1 2>
iTCL Mezzo PT-gliadina PT-gliadina PT-gliadina-lisina PT-gliadina-estere nativa deamidata pH alcalino metilico di lisina CD1 <ls<3>7 100 54 25
CD2 2 76 100 105 99
CD3 0 3 100 2 0
N) CD4 <ls 20 100 2 <ls
CD5 11 19 100 14 9
CD6 3 42 100 63 16
CD7 0 9 100 58 28
CD8 1 14 100 17 8
CD9 <ls 23 100 13 <ls
CD10 <ls 100 <ls <ls
CD11 2 24 100 25 7
CD12 <ls 19 100 34 3
<1>I valori si riferiscono a 1x10<6>cellule e sono espressi in termini percentuali rispetto alla produzione indotta da PT-gliadina deamidata.
<2>limite di sensibilità ELISA: 62.5 pg/ml
<3><ls: al di sotto del limite di sensibilità del test.
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Dai dati di tabella 1 è possibile concludere che un certo abbattimento della reattività della PT-gliadina si ottiene mediante reazione di transamidazione in condizioni alcaline, ma che solo la transamidazione in presenza di estere metilico della lisina, anziché lisina, quale donatore di gruppi amminici, inibisce drasticamente la risposta infiammatoria alla gliadina.
Esempio 4. Abbattimento deirimmunoreattività del glutine in farine cerealicole mediante trattamento diretto con mTG.
Sulla base dei risultati precedenti ottenuti su preparazioni di gliadina viene valutata la possibilità di sottoporre a transamidazione con estere metilico della lisina direttamente la farina dei cereali tossici. La tTG non può essere utilizzata a tale scopo essenzialmente perché non è un enzima food-grade, ha alti costi di produzione ed un peso molecolare elevato (76 kDa) che rende difficile l’interazione su una matrice alimentare complessa. Da questo punto di vista risulta invece di particolare interesse la transglutaminasi microbica (mTG), un enzima già ampiamente utilizzato nell’industria alimentare allo scopo di migliorare la qualità di prodotti a base di carne, pesce, latte e soia (Zhu et al '95; Motoki and Seguro ’98). Un ulteriore vantaggio di questo enzima è che non richiede calcio come cofattore ed è di piccole dimensioni (MW38 kDa) tali da consentirgli potenzialmente l’interazione con i residui di glutammina anche in condizioni native.
A tale proposto abbiamo incubato in presenza di mTG e lisina o estere metilico della lisina una sospensione acquosa di farina di commercio in due differenti condizioni di reazione: a) 2 ore a temp ambiente 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
con/senza lisina o estere metilico della lisina 20 mM; b) 4 ore a 37°C con/senza lisina o estere metilico della lisina 2 M. Al termine si è proceduto all’estrazione della frazione gliadinica come descritto in Materiali e Metodi. La gliadina è stata quindi digerita con pepsina e tripsina (PT-gliadina). La preparazione di PT-gliadina è stata quindi suddivisa in due aliquote una delle quali è stata sottoposta a reazione di deamidazione con tTG. Le diverse preparazioni sono state infine sottoposte a test in vitro con le iTCLs. I risultati sono riportati in Fig.2 e si riferiscono al trattamento secondo il protocollo a); infatti non sono state riscontrate differenze in termini di efficienza tra il protocollo a) e b). Sorprendentemente si è trovato che la mTG risulta in grado di operare una reazione di transamidazione che inibisce l’attività immunostimolatoria della gliadina. In particolare, è possibile osservare che, in analogia con i precedenti dati ottenuti con PT-gliadina utilizzando tTG, la transamidazione con l’estere metilico della lisina risulta in maniera statistica più efficace della lisina nell’azione di riduzione della risposta infiammatoria (Fig.2). I valori medi finali di produzione di IFNy ottenuti in seguito al trattamento con estere metilico della lisina e mTG sono prossimi ai valori basali.
Quindi viene confermato che il pre-trattamento di farina con transglutaminasi microbica ed estere metilico della lisina abbatte le proprietà immunostimolatorie della gliadina anche con trattamento diretto sulla farina alimentare.
In conclusione i dati ottenuti confermano in pieno la validità della presente invenzione come metodo di pre-trattamento per le farine, 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
semole o estratti proteici finalizzato alla reintroduzione dei cereali tossici nell’alimentazione dei celiaci.
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Claims (29)

  1. 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A. RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per il tratamento di prodoti cerealicoli e loro derivati contenenti prolammine che comprende un tratamento enzimatico con transglutaminasi (ammina γ-glutamil-transferasi E.C 2.3.2.1.3) in condizioni che favoriscono la transamidazione di residui di glutammina in una catena peptidica ed abbatono l’efficienza di una concomitante deamidazione.
  2. 2. Il metodo secondo la rivendicazione 1 dove tali prolammine comprendono o consistono di glutine e/o gliadina.
  3. 3. Il metodo secondo le rivendicazioni 1-2 dove tale transglutaminasi è tissutale o microbica.
  4. 4. Il metodo secondo la rivendicazione 3 dove tale transglutaminasi è estrativa o ricombinante.
  5. 5. Il metodo secondo le rivendicazioni 3-4 dove tale enzima è food-grade
  6. 6. Il metodo secondo le rivendicazioni 3-5 dove tale transglutaminasi è microbica (mTG).
  7. 7. Il metodo secondo la rivendicazione 3 caraterizzato dal fato che la transglutaminasi è tissutale e dal fato che il pH utilizzato è superiore a 7.5 e preferibilmente compreso tra 8 e 9.
  8. 8. Il metodo secondo le rivendicazione 1-7 dove la transglutaminasi è utilizzata in presenza di un derivato alchilico della lisina o di una ammina primaria.
  9. 9. Il metodo secondo la rivendicazione 8 dove tale derivato alchilico della lisina comprende un alchile a catena corta C1-C4.
  10. 10. Il metodo secondo le rivendicazioni 8-9 dove tale derivato alchilico è 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A. un estere alchilico, preferibilmente metilico, della lisina.
  11. 11. Il metodo secondo le rivendicazioni 1-10 dove il prodotto contenente glutine e/o gliadina è disciolto in una sospensione acquosa, l’enzima aggiunto in quantità compresa tra 1-10 U/g e l’estere alchilico della lisina in quantità compresa tra 10 e 40 mM.
  12. 12. Il metodo secondo la rivendicazione 11 dove la reazione enzimatica è fatta procedere per almeno 1 ora a temperatura superiore a 4°C.
  13. 13. Il metodo secondo la rivendicazione 12 dove la reazione enzimatica è fatta procedere per almeno 1 ora a temperatura superiore a 25°C.
  14. 14. Un metodo secondo le rivendicazioni 1-13 dove tale prodotto cerealicolo e/o suoi derivati comprende avena.
  15. 15. Un metodo secondo le rivendicazioni 1-13 dove tale prodotto cerealicolo e/o suoi derivati comprende frumento
  16. 16. Un metodo secondo le rivendicazioni 1-13 dove tale prodotto cerealicolo e/o suoi derivati comprende orzo.
  17. 17. Un metodo secondo le rivendicazioni 1-13 dove tale prodotto cerealicolo e/o suoi derivati comprende segale.
  18. 18. Un metodo secondo le rivendicazioni 14-17 dove il prodotto comprendente un cereale scelto tra frumento, orzo, segale o avena è in forma di farina o semola.
  19. 19. Un metodo secondo le rivendicazioni 1-18 dove tale prodotto cerealicolo e/o suoi derivati comprende o consiste di gliadina e/o avenina e/o ordeina e/o secalìna.
  20. 20. Un metodo secondo le rivendicazioni 1-18 dove tale prodotto comprende amido di grano. 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
  21. 21. Derivati di prodotti cerealicoli in cui i residui di glutammina di una prolammina scelta nel gruppo consistente di: gliadina, avenina e/o ordeina e/o secalina sono transamidati ed impegnati in un legame isopeptidico
  22. 22. Derivati secondo la rivendicazione 21 ottenibili secondo il procedimento di cui alle rivendicazioni 1-20.
  23. 23. Derivati secondo le rivendicazioni 21-22 caratterizzati dal fatto di essere farine, semole, amidi o estratti proteici di prolammine .
  24. 24. Uso dei derivati secondo le rivendicazioni 21-23 per la preparazione di prodotti alimentari.
  25. 25. Uso di una transglutaminasi microbica (ammina γ-glutamiltransferasi E.C 2.3.2.1.3) in presenza di un derivato alchilico della lisina per eliminare la tossicità, per pazienti celiaci, di composti presenti in prolammine derivate da prodotti cerealicoli.
  26. 26. Uso secondo la rivendicazione 25 dove tale prolammina è gliadina , avenina, ordeina, secalina o una loro miscela.
  27. 27. Uso di una transglutaminasi tissutale, vegetale o animale (ammina γ-glutamil-transferasi E.C 2.3.2. 1.3) a pH alcalino, preferibilmente compreso tra 8 e 9, ed in presenza di un derivato alchilico della lisina per eliminare la tossicità per pazienti celiaci di composti presenti in prolammine derivate da prodotti cerealicoli.
  28. 28. Un metodo per la preparazione di prodotti alimentari per individui sensibili al glutine che comprende un trattamento delle farine, delle semole o dei derivati di cereali o delle loro miscele, secondo le rivendicazioni 1-20. 7774PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
  29. 29. Un metodo per la preparazione di prodotti dietetici per individui sensibili al glutine che comprende un trattamento delle farine, delle semole o dei derivati di cereali o delle loro miscele secondo le rivendicazioni 1-20. (SM/as)
    Milano 30 Ottobre 2006 p. CONSIGLIO NAZIONALE DELLE RICERCHE Il Mandatario Dr. Diego Pallini NOTARBARTOLO & GERVASI S.p.A
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