JP2002514960A

JP2002514960A - トロンビンおよびミクロフィブリルコラーゲンを含む組成物、ならびにその調製および使用の方法

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Publication number: JP2002514960A
Application number: JP50479199A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．プリオール，ジェフリー; エイチ．シエラ，デイビッド; ジー．ウォレス，ドナルド; エイ．デラストロ，フランク
Original assignee: コヘージョンテクノロジーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-06-18
Filing date: 1998-06-17
Publication date: 2002-05-21
Also published as: WO1998057678A2; CA2295247C; US6096309A; EP0993311B1; CA2295247A1; WO1998057678A3; EP0993311A2; AU7977298A; US6280727B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、トロンビン含有止血組成物、その調製および使用に関する。詳細には、本発明は、水性媒体において安定化されたトロンビンおよびミクロフィブリルコラーゲンを含む止血組成物に関する。本発明の好ましい実施態様において、組成物は、２つの異なる成分（一方は、フィブリノーゲンの供給源として患者自己血漿であり、他方はミクロフィブリルコラーゲンもまた含むトロンビン含有組成物である）を含むキットにおいて使用される。

Description

【発明の詳細な説明】トロンビンおよびミクロフィブリルコラーゲンを含む組成物、ならびにその調製および使用の方法関連出願本願は、1997年６月18日に出願された米国特許出願第08/878,471号（この明細書は、その全体が本明細書中に援用される）の一部係属出願である。技術分野本発明は、組織の処置および修復の分野における使用のための組成物に関する。より詳細には、本発明の主題は、トロンビンおよびミクロフィブリルコラーゲンを含む止血組成物に関する。背景技術止血および組織修復に関与する生理学的経路は、損傷した細胞からのトロンボプラスチンの放出によって開始される。周辺の血漿における第VII因子との接触の際、第X因子アクチベーターが形成される。第V因子とともに、リン脂質とカルシウムとの結合に伴って、プロトロンビンはトロンビンに変換される。トロンビンの酵素活性はフィブリノーゲンの切断を生じ、フィブリンモノマーを形成させる。フィブリンモノマーは凝集し、第XIIIa因子（これは、第XIII因子のトロンビン活性によって形成される）の活性によって共有結合する。図１を参照のこと。迅速な止血および創傷治癒を促進するために、多くの臨床医が、種々の血液凝固因子を含み、そして身体自体の止血プロセスを利用することによって機能する、止血組成物の開発に焦点をあてた。例えば、フィブリンパウダーが、長年にわたって止血剤として使用されてきた。1900年代半ばでは、外科医が、インサイチュフィブリン重合化剤としてフィブリン含有調製物を使用し始めた。このような組成物においてフィブリン塊形成を開始させるために、濃縮血漿および基底組織（筋肉または肺）を、末梢神経吻合の触媒としてしばしば使用した（Youngら、L ancet 2:126-8，1940）。1944年、Tidrickらは、皮膚移植片を接着させるための二分割密封剤（sealant）として、溶液中のヒト血漿およびウシトロンビンを利用した（Tidrickら、Surgery 15:90-95(1944)）。これらの適用および他の適用のための血漿およびトロンビンの使用は、早すぎる結合の失敗のために、すぐに好まれなくなった。これは、低い力学的強度に起因し、次いで低いフィブリノーゲン濃度に起因した。同種低温沈降物の形態の濃縮フィブリノーゲンを利用するフィブリン密封剤は、Matrasら、Oral Maxillofac．Surg．43:605-611(1985)によって報告された。こ a，J．Biomater．Appl.，7:309-352(1993)に総説されている。しかし、これらの型のフィブリン密封剤は、一般に、プールされた血液産物の投与に関与する。プールされた血液産物の投与に関する問題を避けるための努力において、幾人かの研究者は、患者の自己血漿をフィブリノーゲンの供給源として利用する組織密封剤組成物（これは、次いで、塩化カルシウム溶液中のウシ局所トロンビンと組み合わせて適用される）の使用に関心を向けた（例えば、Sledentopら、Laryn goscope 95:1074-1076(1985)を参照のこと）。しかし、これらの物質の性能は、すぐに使用できる（ready-to-use）同種の産物と比較して劣っているので、いくらか制限された。さらに、これらの物質の使用は、自己血漿の性質の多様性に関連する、性能および使用方法の問題のために制限される。これらの問題は、接着剤として重合物質の使用に基づく止血組成物の開発を導いた。例えば、シアノアクリレートのような合成的に重合可能な組成物が、接着組成物において使用されている（Ellisら、J．Otolaryngol．19:68-72(1990)）。しかし、多くのこれらの合成重合組成物の毒性は、それらの有用性を制限する。天然の物質もまた、結合特性を示し得る。特に、コラーゲンは、止血剤として有用であることが報告されている（米国特許第4,215,203号）。しかし、コラーゲンまたは合成ポリマーのいずれかと比較した場合、フィブリンに依存する接着剤は、増強した止血を示す（Racculaら、Am．J．Surg．163(2):234-238(1992)）。止血剤としての使用のためのトロンビンに基づく処方物もまた以前に記載されている。例えば、米国特許第2,433,299号および第4,363,319号を参照のこと。しかし、止血処方物におけるトロンビンの使用は、貯蔵の間の不安定さによって制限される。従って、多くの研究者は、乾燥形態のトロンビンの使用、または固体マトリックスのような基質との組み合わせでの使用に関心を向けた。詳細には、米国特許第4,515,637号は、創傷処置での使用のためのスポンジ形成における、トロンビンおよびコラーゲンの使用を記載する。さらに、米国特許第5,464,471 号は、フィブリンモノマーと組み合わせて使用される乾燥トロンビン処方物の形成を記載する。最近の開発はまた、トロンビン-フィブリン組成物の産生に導く。これは、「二重成分（dual component）」組成物または「一成分（single component）」組成物のいずれかとして処方され、そして使用される。いずれの場合においても、このような組成物は、接着剤（glue）の「触媒」成分として機能するトロンビンおよび接着剤の「樹脂」成分として機能するフィブリンを有し、時々「フィブリン接着剤」といわれる。二重成分（dual-component）組成物は、一般に、別々のフィブリノーゲン含有成分およびトロンビン含有成分の使用に関与し、これらは、投与の直前または投与と同時に互いに混合される。例えば、米国特許第5,290, 552号を参照のこと。これは、必要に応じて、フィブリノーゲン含有成分中にコラーゲンを含有し得る二重成分組成物を記載する。一成分組成物は、一般に、トロンビンの供給源およびフィブリンの供給源の両方を含む。一成分組成物または二重成分組成物のいずれかにおいて、フィブリンは、通常、フィブリノーゲンの形態で供給され、次いで、これは、トロンビンによってフィブリンに変換される。一成分系は、より使用に都合よいが、これらの組成物は、一般に、早すぎる凝集を防ぐために、使用する前の不活性状態で維持されるべきトロンビンを必要とする。この問題は、以下の２つの米国特許において取り組まれている：米国特許第5,318,524号は、不活性化された、または使用前にフィブリノーゲンから物理学的に分離された（異なる相を使用する）かのいずれかのトロンビンを含む一成分止血組成物の開発を記載する；そして米国特許第5,407, 671号は、トロンビンとともにトロンビンインヒビターを含む一成分組成物を記載する。本発明は、トロンビンに基づく止血組成物に関する。これは、再生可能であり、そして一成分としてまたはフィブリノーゲンの供給源（例えば、自己血漿）と組み合わせて、効果的に使用され得る。ミクロフィブリルコラーゲンを、組成物中のさらなる成分として使用することによって、多くの上記の他の止血剤の短所を避け得る。発明の開示本発明に従って、トロンビンとミクロフィブリルコラーゲンとを一緒に組み合わせることによって、特定の効果的な止血組成物が処方され得ることが発見された。ミクロフィブリルコラーゲンは、組成物の機能性を改善するように作用し、そしてまたフィブリン塊形成の動力学、ならびにフィブリン塊の全体の物理学的特性において重要な役割も演じる。トロンビンは、プールされた動物の血漿由来のような、種々の天然の供給源に由来し得る。例えば、ウシトロンビンは、広範な種々の市販の供給源から容易に利用可能である。さらに、組換えトロンビンが利用され得、形質転換宿主（細菌、酵母、または哺乳動物）細胞のような種々の組換え供給源から合成され得る。さらに、特定のタンパク質分解性ヘビ毒のようなトロンビン様化合物、ならびにプロトロンビンのようなトロンビン前駆体もまた、本発明における使用のためのトロンビンの供給源として使用され得る。本発明において有用なミクロフィブリルコラーゲンは、好ましくは、平均約3 〜30nmのフィブリルの直径を有する。そのような性質において、示差走査熱量測定を使用して決定されるように、その融点は約42℃〜46℃の間である。本発明の１つの実施態様において、止血組成物はさらにカルシウムイオンを含み、それは、適用の部位における有効なカルシウムイオンの濃度を、十分な血塊形成を提供する量まで増加させるために添加される。十分な内在性のカルシウムイオンの存在を有する部位において使用される場合、カルシウムイオンを添加する必要はない。しかし、カルシウムイオンは、フィブリルコラーゲンからミクロフィブリルの形成を促進することにおいて効果的である。従って、本発明の組成物がフィブリルコラーゲンから形成される場合、ミクロフィブリルコラーゲンを形成するために組成物に十分なカルシウムイオンを添加することが所望される。本発明の止血組成物は、意図した適用のために有用であるために十分な活性を保持するトロンビンを含む。安定性は、温度、およびトロンビンの安定化または不安定化のための付加的な手段の存在／非存在といった種々の要因に依存する。しかし、トロンビンが、少なくとも６ヶ月の間、2〜8℃においてその活性の80％以上を保持することが好ましい。本発明の組成物の好ましい実施態様において、PEGがトロンビンを安定化させるために含まれる。PEGは、任意の適切な分子量であり得、例えば約1,000〜8,00 0である。さらに、PEGは、広範な濃度（例えば、0.1〜2％）で存在し得るが、好ましくは、0.1〜0.3％の濃度で存在する。本発明の止血組成物の貯蔵に際してトロンビンの安定性を維持することが所望されるので、本発明のさらなる局面は、トロンビンを安定化させるための手段の使用を含み、これはpHを6.6より下に低下させること、糖の添加、PEGの添加、可逆的トロンビンインヒビターの添加、カルシウムキレート剤の添加およびタンパク質の添加を含み得る。本発明の別の局面は、組成物およびフィブリノーゲンの供給源を含む、トロンビンおよびミクロフィブリルコラーゲンを含むキットである。フィブリノーゲンはトロンビン含有組成物に直接的に添加され得るか、または水性媒体（aqueous medium）中に別々の構成成分として供給され得る。フィブリノーゲンを含む好ましい水性媒体は血漿であり、そしてさらに好ましくは、それはヒト血漿であり、そして最も好ましくは、自己血漿である。本発明のキットの別の局面において、血小板の懸濁物は、トロンビン含有組成物と組み合わせて使用され得る。なぜなら、血小板はトロンビンによって活性化され、血塊カスケードを開始し、そして外来性に供給されるフィブリノーゲンの非存在下でフィブリン塊の形成をもたらし得るからである。本発明のなお別の局面において、哺乳動物被験体上または被験体内の組織部位の止血を促進するための方法が提供され、これは、ミクロフィブリルコラーゲンを１つの成分としてさらに含む、トロンビン含有組成物を提供する工程、および別の成分として水性媒体中に別々のフィブリノーゲン溶液を提供する工程、組織部位と接触させる直前にこれら２つの成分を混合する工程、次いでこの混合物を組織部位と接触させる工程を必要とする。本方法の好ましい実施態様において、フィブリノーゲンは、血漿の形態で、そしてより好ましくは、被験体の血液からの血漿を分離するさらなる工程を含む自己血漿の形態で供給される。本方法はさらに、処置部位に多成分組成物を投与するために設計される送達デバイスの使用を含む。このような送達デバイスは、それらがデバイスの外へ送達される直前に２つの成分を混合する工程を提供し得るか、またはそれらがデバイスから出た後（例えば、デバイスから噴霧されたが、組織部位と接触する前である場合）で２つの成分の混合工程を代替的に提供し得る。本発明のなお別の局面において、止血剤を製造する方法が提供され、これは特定の順番なしで、トロンビン、フィブリルコラーゲン、および線維分解剤（フィブリルをミクロフィブリルに分解させるのに十分な量存在する）を互いに組み合わせる工程、およびミクロフィブリルが形成され、そして安定になるために、混合液を適切な時間の長さおよび適切な温度でインキュベートする工程を含む。本法の好ましい実施態様において、フィブリル分解剤はカルシウムイオンであり、これは好ましくは10と200mMとの間の濃度で存在する。本発明の別の実施態様は、ミクロフィブリルおよび非ミクロフィブリルフィブリルコラーゲンの混合物の形態である、コラーゲンを含む組成物に関する。用語非ミクロフィブリルフィブリルコラーゲンによって意図されるのは、ミクロフィブリルよりも大きいフィブリルを有するコラーゲンである。特に、それぞれ、少なくとも1：1（w/w）の比で、ミクロフィブリルコラーゲンと非ミクロフィブリルフィブリルコラーゲンとの混合物を含む組成物は、特定の適用のために有用であり得る。例えば、ミクロフィブリルコラーゲンおよびより大きいフィブリルサイズを有するフィブリルコラーゲンの混合物は、より流動可能であり、従って噴霧装置における使用がより容易である。本発明の他の局面は、明細書の全体にわたって提供され、そしてこの節では特に言及されないが、それらは本発明の一部であると理解される。図面の簡単な説明図１は、血液凝固カスケードを示すフローチャートである（Enzyme Reseach L aboratories．Inc.，South Bend，IN.より）。種々の血液凝固因子に関する略語は、表１に含まれる。発明実施の最良の形態本発明は、止血を促進するためのトロンビンに基づく組成物の使用に関する。より詳細には、トロンビンに基づく組成物は、トロンビンおよびミクロフィブリルコラーゲンを含む。血液凝固は、フィブリン鎖の形成を生じる事象の複雑なカスケードである。図１は、血液凝固カスケードを図示する。種々の因子、それらの分子量および代表的な血漿濃度は、表１に与えられる。表１血液凝固因子の血漿濃度トロンビン血液凝固経路におけるトロンビンの主要な役割は、フィブリノーゲン（これは、適用の部位にすでに存在し得、そして／または外来的に供給され得る）の、フィブリン単量体への変換を触媒するその能力である。トロンビンはまた、血液凝固において他の重要な役割を演じる。例えば、トロンビンはまた、血小板を活性化すること（これは血液凝固カスケードを引き起こす）によって血液凝固を誘導するように機能する。さらに、トロンビンは、第XIII因子のその活性型への変換を触媒し、第XIIIa因子は、次には、フィブリン塊の共有結合性架橋を引き起こす。一旦形成すると、フィブリン単量体は、互いに集合してフィブリン塊を形成する。次いで、塊は、第XIIIa因子を介する共有結合性架橋によってさらに安定化される。本組成物中に含まれ、従って血塊形成のこのプロセスの間に存在するミクロフィブリルコラーゲンは、フィブリン塊の欠くことのできない部分となり、それによって有益な様式におけるその性質を変化させる。本発明の組成物において必要とされるトロンビンの量は、安定なフィブリン塊の形成を触媒するのに十分な量である。血塊は、一旦形態が柔らかいペースト状液体からラバー状ゲルに変換すると、安定であると考えられる。この変化は、以下の実施例に記載されるような、レオロジー測定を用いて定量され得る。好ましくは、トロンビンは、約10〜2,000 National Institute of Health（NIH）単位／mlの濃度で、そしてより好ましくは約300〜1,000NIH単位／mlで止血組成物中に存在する。トロンビン活性、すなわちフィブリノーゲンからフィブリンを形成するその効率は、市販されているフィブロメーターを用いること、そして公知のトロンビン活性を有する調製物に対して試験調製物を使用して、フィブリン塊形成の速度を比較することによって決定され得る。しかし、この試験において十分に機能しないとしても、まだ血小板を活性化し得る場合、トロンビンはなお、本発明の止血組成物における使用に適切である。これは、血小板活性化が、フィブリノーゲン切断のために外来的に供給されるトロンビンに依存しない血液凝固のカスケードの正常な機能を介して、活発に出血している適用部位において安定な血塊の形成を触媒するからである。トロンビンは、種々の天然の供給源に由来し得る。特に、ウシトロンビンは、凍結乾燥された形態で市販されている（Parke-Davis，Morris Plains，N.J．;Ge nTrac，Inc.，a subsldiary of Jones Medical Industries，Inc.，Middleton， WI）。トロンビンはまた、Chabbatら、Thrombosis Research，76(6):525-533（1 994）によって記載されるような、プロトロンビン複合体の供給源から精製され得る。さらに、トロンビンはまた、組換え供給源に由来し得る。例えば、Jorgen senらは、γ-カルボキシル化組換えプロトロンビンについての発現系を記載した（J．Biol．Chem．262:6729-6734(1987)）。短縮化形態、および変異形態のプロトロンビンもまた、本発明において調製され、そして利用され得る。Le Bonniecらは、プレ-トロンビン-２ cDNA（プレ-トロンビン-２は、プロトロンビンから全579残基のうち残基1〜155を除外したものである）のクローニング、ならびに単一アミノ酸置換変異体のクローニングおよび発現（J．Biol．Chem．266:13796-13803(1991)）を記載する。変異型または短縮型のプロトロンビンを記載する他の参考文献は：Yeら、J．Biol．Chem．269:1 7965-17970(1994)；Rezaieら、Biochemistry 35:1918-1924(1996)；米国特許第5 ,476,777号(1995)；およびWuら、PNAS 88:6775-6779(1991)である。組換え産物がプロトロンビンである場合、トロンビンへの変換は、第Va因子、第Xa因子、および合成リン脂質の血液凝固の複合体を使用して、または特定のヘビ毒プロテアーゼを用いて、達成され得る。好ましくはないが、適用部位においてトロンビンへの変換のための手段がまだ存在していない場合、このような手段と一緒に本発明の止血組成物におけるトロンビン前駆体（例えば、プロトロンビン）を使用することが可能である。さらに、ヘビ毒プロテアーゼ（これもまた、フィブリノーゲンからフィブリン塊を形成し得る）のようなトロンビン様化合物もまた、本発明によって意図される（例えば、Damusら、J．Lab．Clin．Med．79:906-923（1972）を参照のこと）。従って、本明細書中で使用される用語「トロンビン」は、トロンビン前駆体およびトロンビン様化合物を含み、そしてフィブリノーゲンおよび／または血小板を活性化することからフィブリン塊の形成を触媒し得る、天然または合成の供給源由来の任意のタンパク質またはアミノ酸ポリマーをいう。コラーゲン本発明の止血組成物中のコラーゲンの存在は、これらの組成物の機械的および生理学的特性の両方を増強することに役立つ。例えば、コラーゲンは、組成物の粘度（これは、流出を示すことなく部位への適用をより容易にさせる）を増加させるのに役立つ。これは、適用部位でトロンビン濃度を制御するように作用する。さらに、コラーゲンは、血塊を強化することに貢献することによって血塊の形成において構造上の役割を果たす。コラーゲンはまた、止血をさらに促進し得る血小板のアクチベーターとして役立つ。コラーゲンは、医療用および外科用使用のための生体材料の成分として、長い間認識されてきた。例えば、Keefeら、Clinical Materials 9:155-162(1992)を参照のこと。コラーゲンは、非フィブリルまたはフィブリル形態で存在し得る。非フィブリルコラーゲンは、約300nm長および直径約1.5nmである三重ヘリックスからなる（Piez，Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,第３巻、第２版、John Wiley 699-727(1985)）。対照的に、フィブリルコラーゲンは、フィブリルサイズの広範なアレイで存在し得る。最小のフィブリルは、５〜約30の三重らせん分子が会合する場合に生じる。このような会合したフィブリルは、約３〜約30nmの間の直径を有し、そして約400〜500nm長である。これらを、一般的に、「ミクロフィブリル」という（Gelmanら、J.Biol.Chem.254:17741-17745(19 79)）。より大きなフィブリル（直径30〜1000nmおよび約1000〜5000nm長の範囲）もまた、調製され得る（Caoaldiら、Biopolymers 21:2291-2313(1982)）。コラーゲンフィブリルサイズは、示差走査熱量測定（DSC）を用いて融点を測定することにより、容易に決定され得る。一般的には、非フィブリルコラーゲンは、39〜40℃で融解するのに対し、ミクロフィブリルコラーゲンは、42℃〜46℃ で融解する。例えば、Wallaceら、Biopolymers 25:1875-1893(1986)を参照のこと。コラーゲンフィブリルは、水性媒体において容易に可溶性ではなく、そしてかわりに、水性媒体に添加される場合に粒子懸濁物を形成する。しかし、本明細書中で使用されるような、用語「コラーゲン溶液」は、フィブリルコラーゲンのような懸濁物を除くことを意図しない。本明細書中で使用される用語「フィブリルコラーゲン」とは、ミクロフィブリルまたは大きなフィブリルのいずれかのフィブリル形態中のコラーゲンをいうことを意味する。さらに、大部分がミクロフィブリルからなる（80％を超える）コラーゲン懸濁物は、本明細書中で、「ミクロフィブリル」コラーゲン懸濁物といわれる。コラーゲン溶液の粘度は、コラーゲンファイバーサイズによって影響される。例えば、非フィブリルコラーゲンの溶液は、フィブリルコラーゲンの懸濁物より粘性である（Wallaceら、J.Biomed.Mater.Res．21:861-880(1987)）。さらに、より小さいフィブリルのコラーゲン（すなわち、ミクロフィブリルコラーゲン）の懸濁物は、より大きなフィブリルコラーゲンの懸濁物よりも粘性である。文献中に記載されるように、なぜミクロフィブリルコラーゲン懸濁物が、より大きなフィブリルを含むコラーゲンの懸濁物よりも粘性であるかという２つの理由が存在する。第１に、フィブリルコラーゲン懸濁物の粘度は、フィブリルの密度数に比例する。ミクロフィブリルはより小さいので、同じ割合の全固体で、ミクロフィブリルコラーゲン懸濁物の密度数は、より大きなフィブリルを有するコラーゲンの懸濁物のものより大きい。第２に、ロッド様（rod-like）懸濁物の粘度は、長さ対幅の比に依存し、その結果、より大きな長さ対幅の比を有するロッドは、より粘性である傾向にある。 Doiら、J.Chem.Soc.Faraday II，74:560-570および918-932(1978)。ミクロフィブリルは、より大きなフィブリルよりも伸張されることが公知である。例えば、ミクロフィブリルは、約20〜130の長さ対幅の比を有するのに対して、中間サイズのフィブリルは、約６〜75の長さ対幅の比を有することが報告されている。例えば、Wallaceら、Biopolymers 25:1875-1893,(1986)の表IIを参照のこと。したがって、ミクロフィブリルコラーゲン懸濁物は、より大きなフィブリルからなるコラーゲン懸濁物より粘性である。非フィブリルコラーゲンの溶液もまた粘性であっても、フィブリルコラーゲンはなお、その血小板活性を増強する役割のために好ましい。Balleisenらによって記載されるように、コラーゲンは、血小板凝集を促進するために、少なくともマルチマー形態（フィブリルまたは沈殿のいずれか）でなければならない（Hemo stasis 5:155-164(1976)）。非フィブリルメチル化コラーゲンは、血漿タンパク質の存在下で沈殿し、その後、血小板凝集の効果的なエンハンサーとして役立つこともまた、文献集に記載される。従って、ミクロフィブリルコラーゲンが本発明の実施において好ましいが、メチル化コラーゲンもまた、内因性血漿タンパク質との相互作用が沈殿を生じる部位に投与される場合、コラーゲンの適切な形態である。血小板凝集は、市販の凝集メーターを使用して測定され得る。血小板の凝集は光透過を増加させ、これは最大透過の二分の一に達するのに必要な時間として、記録されそして表され得る。ミクロフィブリルコラーゲンは、公知の方法を使用して容易に調製され、そして本発明の止血組成物を形成するのに直接使用され得る。あるいは、フィブリルコラーゲンが使用され、その結果、組成物のさらなる処理および保存の際に、フィブリルは破壊される。一般的には、当該分野で公知であり、フィブリル形成を破壊し、そしてフィブリル形態をミクロフィブリル形態に変換するようにも作用し得る、多くの型の化合物が存在する。例えば、塩の存在は、コラーゲンフィブ 70％容量を超えるフィブリル（Collagen Corporation，Palo Alto，California ））（これは、130mM塩化ナトリウム中で3.5％重量のフィブリルコラーゲンでとともに20mg/mlの濃度で存在する場合、さらなる塩（20〜40mM塩化カルシウム）の添加は、５〜８℃にて３〜５時間の保存の際に、コラーゲンフィブリルを破壊するように機能し得る。このことは、コラーゲンのミクロフィブリル形態への変換を生じる。あるいは、200〜500mM塩化ナトリウム単独は、ミクロフィブリルコラーゲンを形成するために使用され得る。実施例、および特に表IIIを参照のこと。フィブリルをミクロフィブリルコラーゲンに変換する目的に含まれ得る他の分解試薬としては、グリセロール、スクロース、および関連するポリオール（例えば、マルトース、スクロース、ソルビトール、およびマンニトール）が挙げられるが、これらに限定されない。 PEG（これは、非フィブリルコラーゲンからミクロフィブリルコラーゲンを形成するように作用する）のような化合物を約３〜８％の濃度で含むことによって、開始物質として非フィブリルコラーゲンを使用することもまた可能である。非フィブリルコラーゲンからミクロフィブリルコラーゲンを形成し得る他の化合物もまた、当該分野で周知である。本明細書を通じて、特に以下の実施例において議論されるように、水性媒体中のコラーゲンフィブリルの濃度およびサイズは、pH、温度、媒体中の他の化合物の存在および濃度などのような保存条件によって影響される。このような条件は、所望のコラーゲンフィブリル特徴を最適化するために、コラーゲン化学の周知の原理と組み合わせて、本明細書の教示を使用して、容易に制御および適応され得る。例えば、ミクロフィブリルコラーゲンと非ミクロフィブリルフィブリルコラーゲンとの混合物は、室温にてコラーゲンフィブリル形成を引き起こすことが公知の化合物の存在下で、ミクロフィブリルコラーゲンの保存から生じる。しかし、条件が適切に制御される限りは、このような凝集は、コラーゲンが半分未満のミクロフィブリル（これは所望ではない）である点に進行することは必要ではなく、そしてより大きなフィブリルはあまり粘性ではない傾向があるので、より流動可能な組成物を作成することさえ所望され得る。カルシウムイオンカルシウムイオンの供給源は、血塊形成を促成するのに必要である。上記のように、カルシウムイオンはまた、フィブリルの分解を促進し得、これはフィブリルコラーゲンからミクロフィブリルを形成するために使用され得る。カルシウムイオンは、通常、塩化カルシウムの形態で、止血組成物に添加される。あるいは、十分なレベルのカルシウムは、適用部位にすでに存在し得、この場合、カルシウムイオンの添加は必要ではない。必要なカルシウムイオンの量は、投与の際に、血塊形成を促進するのに有効な量である。さらに、止血組成物がフィブリルコラーゲンから処方される場合、このことは、適用前にコラーゲンフィブリルの分解を必要とし、存在するカルシウムイオンの量もまた、フィブリルコラーゲンをミクロフィブリルコラーゲンに変換するのに必要である量である。特定の相対濃度で、塩化ナトリウムの存在が、カルシウムイオンを介するフィブリル分解に影響し得ることに注意することは重要である。例えば、40mM塩化カルシウムおよび30mM塩化ナトリウムで、ミクロフィブリル形成は阻害される。このことは、カルシウムイオンおよび塩化物イオンと逆の荷電に起因し得、イオン −イオン荷電複合体を導き得、次いで、コラーゲンに比べていずれかのイオンの活性がより低いことに起因し得る。塩化カルシウムが単独で存在する場合、または塩化カルシウムおよび塩化ナトリウムが高濃度（例えば、100mM塩化カルシウムおよび30〜130mM塩化ナトリウムまたは40mM塩化カルシウムおよび150mM塩化ナトリウム）で存在する場合、フィブリル分解は阻害されない。本発明の止血組成物中に含まれるカルシウムイオンの決定において、フィブリノーゲン供給源中または適用部位での他の成分の存在を考慮することも必要である。例えば、止血組成物が、２つの成分の第二成分として血漿を含む二成分（tw o-component）組成物（より完全には以下に記載されるように）としての使用のために処方される場合、血漿がカルシウムイオンをすでに含む供給源に由来するか、カルシウムが枯渇された供給源に由来するかどうかが、はじめに決定されるべきである。特に、クエン酸化された血漿は、血漿の便利な供給源であり、そしてクエン酸は、血塊形成における関与のためのカルシウムの利用可能性を防止する有効なカルシウムキレート剤である。この場合、所望の全有効（非キレート化）カルシウム濃度が決定されるべきであり、そして適切な量のカルシウムが、この全有効濃度を達成するために添加される。トロンビン安定化剤本発明の好ましい実施態様において、トロンビンは、水性媒体中での保存の間安定である（すなわち、活性なままである）。特に、トロンビンは、好ましくは 18〜22℃にて少なくとも30日間、そしてより好ましくは18〜22℃にて少なくとも 60日間安定である。低温での薬学的組成物の安定性が、高温でのそれらの安定性を評価することによって、推定され得ることは周知である。例えば、Segelら、E nzyme Kinetics，John Wiley & Sons，New York，932-941頁（1975）を参照のこと。特定の場合のトロンビン含有組成物において、18〜22℃での安定性は、２〜８℃で予測された安定性の約10分の１〜12分の１であることが決定されている。例えば、欧州特許出願第478,827 A1号を参照のこと。従って、本発明の止血組成物（18〜22℃にて少なくとも１ヶ月間安定であることが実証されている）は、２〜８℃にて少なくとも10ヶ月間安定であることが予測され、そして好ましくは、２〜８℃にて少なくとも６ヶ月安定である。ミクロフィブリルコラーゲンと非ミクロフィブリルフィブリルコラーゲンとの混合物の水性懸濁物を含む組成物は、２〜８℃にて少なくとも12ヶ月間安定であることが決定されている。トロンビンは、ほぼトロンビン−トロンビン相互作用によってもたらされる自己触媒性を示すことが公知である。従って、トロンビンが機能性を維持することを保証するために、水性媒体は、好ましくは、低いpHに維持され、この場合、トロンビン活性は阻害される。例えば、本発明トロンビン含有成分は、好ましくは、約6.6未満、およびより好ましくは約5.7未満のpHで維持され、そしてpHが、送達の際または適用部位で増加し得る様式で処方される。トロンビンを安定にすることを助けるために水性媒体に添加され得る他の物質は、以下の通りである：表II トロンビン安定化剤トロンビンベースの止血組成物中の親水性ポリマー（例えば、ポリアルキルオキシド、好ましくはポリエチレングリコール（PEG））の封入体は、トロンビン −トロンビン相互作用（これは、自己触媒性を防止する）を阻害することによってトロンビンを安定化させるために役立つ。PEGは、混和物中の止血処方物に添加され得るか、またはトロンビンとともに予め混合され得る。しかし、過剰なPE Gの添加は、フィブリルコラーゲンの形成に好都合であり、そして回避されるべきである。添加されるPEGの量は、安定性およびファイバーサイズを至適化するように濃度を調整することによって、容易に決定される。一般的には、PEGは、２％未満で存在し、そして好ましくは１％未満、およびより好ましくは約0.2〜0 .3％未満である。さらなる安定化剤としては、EPO 478,827A1；EPO 302,754B1；およびGB 2,041 ,942Aに記載されるような、糖（例えば、ソルビトール、マンニトール、グルコース、スクロース）およびアミノ酸（例えば、グリシン）が挙げられる。トロンビンを安定化するなお他の手段は、米国特許第5,219,328号；同第5,318,524号；および同第5,407,671号に記載される。生物学的に活性な薬剤止血における役割に加えて、本発明の組成物は、被検体の適用部位または身体で、種々の所望の生理学的、化学的、生物学的および／または治療的効果を有する広範な種々の成分のための有効な送達ビヒクルとして役立ち得る。例えば、抗生物質は、感染を予防するために、適用部位に供給され得る。このような抗生物質は、投薬量および取り込みの手段と同様に周知である。さらに、アプロチニン、C1-エステラーゼインヒビター、およびε-アミノ-ｎ-カプロン酸のような抗線維素溶解剤は、血塊保存性を増強するために含まれ得る。適用部位で創傷治癒を促進するための止血組成物中に１つ以上の増殖因子（例えば、血小板由来増殖因子、インスリン結合増殖因子、線維芽増殖因子、形質転換因子、血小板因子、およびヘパリン結合増殖因子）を含むこともまた可能である。例えば、Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing:Biological and Clinical Implications，Alan R．Liss，Inc.，New York，New York，303- 329頁（1988）を参照のこと。組織封止剤組成物のような生物学的に活性な薬剤の取り込みは、すでに広範に記載されている。例えば、PCT WO 96/17633を参照のこと。実際に、組織封止剤のような取り込まれ得る任意の活性薬剤もまた、本発明の止血組成物に含まれ得る。処方物本発明の止血組成物は、緩衝剤、粘性剤、浸透圧増強剤、ならびに生体適合性、注入性および有効性を保証するために所望され、かつ/または必要である他の物質を任意に含み得る水性媒体での投与のために処方される。特定の適用に依存して、この組成物は、様々な異なる形状で処方され得る。例えば、適切な水性媒体でのトロンビンおよびミクロフィブリルコラーゲンを含む一成分組成物は、他の凝固因子およびフィブリノーゲンのフィブリンへの変換について必要である条件と一緒に、フィブリノーゲン供給源を既に有する適用部位で止血をもたらすために利用され得る。他の場合では、例えば、適用部位が、出血が活発な部位ではない場合、同じ一成分組成物中または別々の成分としてのいずれかで、フィブリノーゲンの供給源（および処置部位において欠損であり得る任意の他の凝固因子）を補充することが必要とされ得る。しかし、トロンビンおよびフィブリノーゲンが同じ一成分組成物に含まれる場合、不活化状態でトロンビンを維持することが必要とされ、その結果、適用時に活性化される。二成分組成物において、一方の成分がトロンビンおよびミクロフィブリルコラーゲンを必然的に含み、そして第２の成分がフィブリノーゲン供給源を含む。簡便性の欠落については好ましくはないが、カルシウムイオンが様々な止血機能（第XIII因子の活性および機能、血小板機能（例えば凝固）を含む）および最終的には血液中の活性凝固因子のさらなる産生のために必要とされることから、別の第３の成分にカルシウムを供給することもまた所望され得る。従って、カルシウムの非存在は、トロンビン安定性の維持を補助し得る。いずれの場合においても、コラーゲンは、フィブリノーゲン成分から別々に供給されるのに好ましく、その結果として適用の間では、適切な混合がトロンビンとフィブリノーゲンとの間で達成され得る。フィブリノーゲン供給源は合成的または天然であり得る。便宜上、血漿はフィブリノーゲン供給源として使用され得る。好ましくは、血漿はヒトであり、そしてより好ましくは自己血漿であり、これはプールされた血漿で時々見出される感染性因子および他の所望されない成分の移入を避ける有効な方法である。自己血漿は、一般にはクエン酸塩化（0.32〜0.38％（w/v））血液から採取され、これは好ましくは、使用前の2〜3時間以内に取り出され得る。高血小板血漿は、公知の技術（例えば、90×Gで10分間または1000×Gで３分間の遠心分離による）を使用して血液から分離される。以下に与えられるのは、様々なA：Bの容量：容量比（例えば、0.4：1.0、1.0 ：1.0、1.0：0.4、および1.0：2.0、好ましくは1：1）における使用について共に組み合わされ得る様々な代替的な多成分の実施態様である。二成分組成物（１）：成分Ａ：I型フィブリルコラーゲン（20mg/ml）塩化カルシウム（40mM）トロンビン（少なくとも500NIH単位/ml）塩化ナトリウム（150mM） PEG（0.2%（w/v）、1000MW）マンニトール（15mM） pH4.7〜6.6 成分Ｂ：0.32〜0.38％のクエン酸ナトリウム中の高血小板血漿二成分組成物（２）：成分Ａ：I型フィブリルコラーゲン（20mg/ml）塩化カルシウム（20mM）トロンビン（少なくとも500NIH単位/ml）塩化ナトリウム（300mM） PEG（0.2%（w/v）、1000MW）マンニトール（15mM） pH4.7〜6.6 成分Ｂ：20mM 塩化ナトリウム 10mM リン酸化ナトリウム、pH7.5 15mM マンニトールにおけるヒトフィブリノーゲン5mg/ml 二成分組成物（３）：成分Ａ：I型フィブリルコラーゲン（20mg/ml）塩化カルシウム（20mM）トロンビン（少なくとも500NIH単位/ml）塩化ナトリウム（300mM） PEG（0.2%（w/v）、1000MW）マンニトール（15mM） pH4.7〜6.6 成分Ｂ：2〜4×10⁸/mlでの、心臓によりフィブリノーゲンが枯渇した血漿、または血清、および血液血小板二成分組成物（４）：成分Ａ：I型フィブリルコラーゲン（20mg/ml）塩化カルシウム（20mM）トロンビン（少なくとも500NIH単位/ml）塩化ナトリウム（300mM） PEG（0.2%（w/v）、1000MW）マンニトール（15mM） pH4.7〜6.6 成分Ｂ：等張性生理食塩水および血小板について適切な安定化賦形剤中の２〜４×10⁸/mlでの血液血小板別の実施態様において、以下の三成分組成物は、A:B:Cの約0.4〜2.0：0.4〜2. 0：0.4〜2.0、好ましくは1:1:1の容量比で混合される、それぞれ3つの成分で使用され得る。三成分化合物：成分Ａ：I型フィブリルコラーゲン（30mg/ml）塩化カルシウム（40mM） PEG（0.2%（w/v）、1000MW）成分Ｂ：トロンビン（少なくとも1000NIH単位/ml）塩化ナトリウム（370mM）マンニトール（15mM） pH4.7〜6.6 成分Ｃ：0.32〜0.38％クエン酸ナトリウム中の高血小板血漿より好ましい三成分組成物において、PEGは、以下のように、トロンビンの安定化を促進させるために、トロンビンを含む成分Ｂに含まれる：三成分化合物（２）：成分Ａ：I型フィブリルコラーゲン（30mg/ml）塩化カルシウム（40mM）成分Ｂ：トロンビン（少なくとも1000NIH単位/ml）塩化ナトリウム（370mM） PEG（0.2%（w/v）、1000MW）マンニトール（15mM） pH4.7〜6.6 成分Ｃ：0.32〜0.38％クエン酸ナトリウム中の高血小板血漿血塊形成の試験本発明の止血組成物は、フィブリノーゲンと相互作用し、適用部位においてゼリー状の血塊を形成する。この血塊は、血流に対し物理的な障壁として作用する。従って、これらの組成物の有効性は、これらが形成し得る血塊の強度に比例する。さらに、組成物中のトロンビンは、部位に存在するいくらかの血液を凝塊し、これは組成物の有効性に止血を促進することを追加する。止血組成物の血塊の有効性は、投与における即効的な血塊形成の観察により容易に決定され得る。しかし、最適化のための様々な異なる処方物の血塊形成の効率を比較するために、このような比較が、血塊形成の間でなされる血流測定に基づいてなされ得る。Rosenblattら（J．Appl．Polym．Sci．50:953-963(1993)）に記載されるように、力学的な弾性計数であるＧ’および力学的な粘性計数であるＧ''が、それぞれゲルの弾性および全体の強度の関数として決定される。（Fe rry、Viseoelastic Properties of Polymers，第３版、John Wiley，New York,1 〜31頁および41〜44頁（1980）；およびJanmeyら、Blood，80(4):928-936(1992) もまた参照のこと）。使用および投与本発明の組成物は、止血剤、組織封止剤および組織接着剤が通常使用される場合においての、多くの異なる適用において有用である。本発明は、例えば、実質性器官出血（例えば、肝臓、脾臓および腎臓の実質性器官出血）中に拡散毛細管出血を停止するのに特に適切である。さらに、これらの組成物は、火傷組織の治癒の間の挫滅組織切除に関連する出血の処置において有用である。本発明の1つの局面において、この組成物は、海綿質表面からの拡散出血（これは高度に血管性であり、従って過剰な手術後の出血の傾向がある）の制御に有用である。このような出血は、様々な異なる外科的手順（例えば、整形外科、神経外科、形成および再建外科、脊髄外科および口腔-上顎-顔面外科の分野において）の間に問題を生じ得る。従って、本発明の組成物の外科手術後の適用は、外科手術後の失血を軽減するために使用され得る。本発明の組成物はまた、遺伝的または取得された凝血欠損または抗凝固治療により悪化された手術中の出血の制御において有用である。例えば、患者が、手術後の抗凝固性治療を受け、そしてさらなる手術をその後に必要とする場合、本発明の組成物は、抗凝固剤により生じる出血の増加の中和に有用である。一成分組成物は、処置部位に直接投与され得る。多成分組成物は、好ましくは予め混合される（すなわち、これら全ての成分が、適用部位で互いに始めて接触する様式で投与されることとは対象的に、投与直前または投与中のいずれかに混合される）。投与の間の前混合は、成分が、デバイス実施直前であるが送達デバイスの内部にまだ含まれる間に、送達の間に共に混合されるか、またはそれらが適用部位に接触する前ではあるがそれらがデバイス実施後に共に混合され得るかのいずれかであることを一般に意味する。後者のタイプのデバイスにおいて、２つ以上の区画の内容物が、適用の間に、別々の区画から体液の一方向の流れに吹き付けられ得る。多成分組成物の投与について適切であるデバイスは、前混合時間および有効性を調節するために改変され得、そして米国特許第5,116,315号；同第4,874,368号および同第4,359,049号に記載される。組成物の各成分、そして特に、流動可能である（すなわち、小型ゲージの開口部（例えば、200〜1000ミクロンの隙間）を介して投与され得る）コラーゲン含有成分が所望される。吹き付けによる適用を容易にするために、約1ml/秒の流速で300ミクロンの隙間を通じて流動可能である組成物が好ましい。引き続くゲル化は、組成物を適用後に残留させる。投薬量は、組成物が投与されるべき特定の使用、ならびに所望される止血の度合いに必然的に依存し、そして当業医により容易に決定され得る。実施例実施例1 コラーゲンファイバーのサイズ評価本実験を、コラーゲンファイバーの分解における異なる塩濃度の効果を決定するために実施した。McPhersonら、Collagen Rel．Res．5:119-135(1985)による記載のように、コラーゲンをウシ皮質部からペプシン溶解を使用して精製した。コラーゲン溶解後、フィブリルコラーゲンを、20mMリン酸ナトリウム、pH7.2を含む緩衝液中で可溶性（非フィブリル性）コラーゲンを再懸濁することにより再構成した。このようにして形成された繊維を遠心分離により収集し、そして水中で20mgタンパク質/mlで再懸濁した。いくつかの異なる試料を、以下の表３に示されるように調製し、そして各試料の融解温度を、調製後最初に決定し、そして３日間の室温での保存の後、示差走査熱分析（DSC）を使用した。各試料は、生理学的生理食塩水中に1〜3mgのタンパク質を含んだ。15〜30μlの全量を蒸発皿上で封閉し、そしてDSC20 cell(High tstown，NJ)を用いてMettler TA3000熱量計で10℃/分で加熱した。同じ重量の生理学的生理食塩水を含む参照試料の蒸発皿を各試料と共に加熱した。表III 示差走査熱分析（DSC）フィブリルサイズを、Wallaceら、Biopolymers，25:1875-1893(1986)に従って、融解温度の結果に基づいて推定した。一般には、ミクロフィブリルコラーゲンについての融解温度は、フィブリルコラーゲンよりもより低い。49〜50℃の融解温度は、中間サイズのファイバーの存在を示すのに対し、44℃の融解温度がミクロフイブリルコラーゲンの存在を示す。DSCの結果に従って、試料２（これは40m M塩化カルシウムおよび２mM塩化ナトリウムのみが含まれる）は、ゼロ時において中間サイズのフィブリルを示したが、３日目までにはミクロフィブリル形態に変換した。比較において、試料３（これは塩化カルシウムと塩化ナトリウムの両方が含まれる）は、ファイバーサイズの変化を示さず、このことは塩化ナトリウム存在下でのカルシウムイオン媒介性ファイバー分解の反作用を示し得る。試料４（100mMの塩化カルシウム濃度における）は、決定される融解温度に先だってファイバー分解を受けたと思われる。試料５は、試料２のように、中間サイズのフィブリルからミクロフィブリルへの転換を示した。試料４および５では、高レベルの両方の塩が、試料３とは対照的にフィブリル分解を促進すると思われた。実施例２電子顕微鏡法研究電子顕微鏡法は、塩化カルシウム存在下および非存在下におけるコラーゲンフィブリルの状態を確認するために行った。詳細には、フィブリルコラーゲンの懸濁物（20mgタンパク質/ml）を、実施例１に記載のように調製した。この懸濁物に対して、25mMの塩化カルシウムまたは等量の水を添加した。これらの２つの試験懸濁物を室温で３週間インキュベートしてコラーゲンフィブリルを破壊した。電子顕微鏡を使用して観察されたように、塩化カルシウムを伴わないサンプルはゆるい網目状フィブリル（帯状及び非帯状の両方）を示し、これは直径100〜2 50nmであった。比較すると、塩化カルシウムを伴うサンプルはミクロフィブリルを示し、これはほとんど帯状ではなく、そして直径３〜約30nmの間であった。実施例３フィブリン塊の強度の評価この実験は、フィブリン塊を形成する、異なる止血組成物の能力を決定するために行った。サンプルを実施例１に記載のように調製し、そして調製後すぐに使用したサンプル３を除いて、３日目のインキュベーション後に用いた。サンプル１を除いて、全てのサンプルはまた、500NIH単位/mlトロンビンを含有した。血塊形成を、止血組成物を0.32％（w/v）のクエン酸ナトリウムを含有する等容量のウサギ血漿と混合することにより開始した（サンプル１を等容量の水と混合して、コラーゲン単独の血塊のゲル構造に対する寄与を決定した）。未完成のゲル化を阻害するために、サンプル組成物と混合する前に血漿のpHを5.0まで酸性化した。混合後、サンプル＋血漿混合物をサンプル細胞に負荷し、そしてpHを7.2に調整した。サンプル細胞を25℃で維持し、そして２時間後に測定を行った。レオロジー測定を、Rheometric fluid spectrophometer，Model 8400（Piscataway,NJ ）で行った。平行平面幾何学において力学的モードで、測定を行った。ゲル化を、１ラジアン/秒振動速度および１％ひずみでモニターした（この条件によるゲル構造の変形は期待されない）。ゲルの全ての崩壊に対する感受性の指標として、50％ひずみにおいてさらなる試験を行った。表IV 流体測定サンプル１（これはトロンピンまたはフィブリノーゲンを含有しない）は、G' 値（適度の粘性特性をのみを有する物質の指標である）を示した。さらに、50％ひずみでのG'の減少により示されるように、ゲルは完全に崩壊した。対照的に、全ての他のサンプルは１％ひずみにおいてより高いG'を示し、50％ひずみにおいて減少を示さなかった。これらの結果はまた、相対的に低いG''（これはほとんど粘性特性を有さない弾性体の指標である）を示した。サンプル３および４は、サンプル３が血漿との混合直前に調製され、そしてサンプル４は使用前に３日間保存した、という点においてのみ異なった。この差異により、ゲル弾性および強度におけるフィブリルサイズの影響（サンプル３は中間サイズのフィブリルを有し、サンプル４は実施例１に記載されるミクロフィブリルを有する）が示されることが期待された。期待されたように、サンプル４において、ミクロフィブリルの存在は改善された弾性および強度を有する血塊の形成を生じた。サンプル5においては、高レベルの両方の塩は、フィブリルを分解してミクロフィブリルを形成し得るようである。これは、上記のような、約30mMでの塩化カルシウムおよび塩化ナトリウムの明らかな「キャンセリング（canceling）」効果とは対照的である。塩濃度とG'との間の直接的関係もまた観察され、このことは、実施例１で与えられる結果を考慮した場合、ミクロフィブリルコラーゲンの存在がより弾性の血塊を生じることを示す。このような血塊は、血流または他の力によるずれ（適用部位から取り除かれることが生じる）に対して、より良好に抵抗し得ることが期待される。実施例４トロンビン安定性に対するPEGの効果 PEGの任意の包含は、本発明の止血組成物におけるトロンビンの安定性を増強する。種々のサイズのPEG間、および変化した濃度での差異を評価するために、1 8〜22℃でのインキュベーション後の異なる時点でトロンビン活性を評価した。 mM塩化カルシウム（フィブリルをミクロフィブリルに変換する）および500NIH単位/mlトロンビン（GenTrac,Inc.,Middleton,WI）を、6.4のpHで含んだ。トロンビン活性を、BBL Fibrosystemフィブロメータおよび適切なフィブリノーゲンコントロール（例えば、Coagulation Control Level 1（Sigma Chemical Co.,Sain t Louis,MO））を使用して決定した。フィブリノーゲンコントロールの200mlアリコートを２分間、37℃で、反応カップ内で予めインキュベートし、そして反応を、試験されるサンプル（20mM HEPES、pH7.4、40mM CaCl₂を用いて約５NIH単位 /mlに希釈したもの）を、100μl添加することにより開始した。フィブロメータは、第１の線維形成に対する時間を記録し、これを用いて、検量線に対する比較からトロンビン濃度を決定した。トロンビン活性を初期トロンビン活性の割合として表す。濃度および分子量の関数としての室温で12日後のトロンビン活性は、表Ｖにおいて以下で提示される。表Ｖトロンビン安定性に対するPEGの効果＊1000および8000分子量のPEGは、Sigma Chemical Company,St.Louis,MOから入手した。3350分子量のPEGはUnion Carbide Chemical Company,South Charleston ,WVから入手した。これらの結果により示されるように、トロンビン活性は、最も低いレベルのPE Gで、そしてより低い分子量（1000および3350）のPEGを用いたときで、最も高かった。引き続いての実験において、0.02％アジ化ナトリウムを含む0.2％PEG-100 0を含むサンプルのアリコートを種々のpH（4.0から6.4の間）に調整した。pH4.0 でのサンプルは全てのトロンビン活性を失った。他のサンプルは45日間まで、その活性の70％より多くを保持した。後者の実験は、より低い濃度のPEG-1000（0.1％）、PEGなし、PEG-400（0.2％）、PEG-3350（0.2％）およびアEG-8000（0.2％）（全て0.02％アジ化ナトリウムを含む）の効果を研究した。これらのサンプルの各々は、30日間まで、トロンビン活性の少なくとも50％を保持した。実施例５血小板凝集および止血に対するミクロフィブリルコラーゲンの効果血小板凝集を、Model DP-247 E dual Sample Aggregation Meter(Sienco,Inc. ,Morrison,Company)を用いて行った。所有者の説明書に記載されるように低血小板血漿（platelet poor plasma）および高血小板血漿(platelet rich plasma) （PRP）を用いて、目盛を調整した。PRPの360μlのアリコートを、キュベット中で攪拌しながら37℃で５分間加熱した。次いで、40μlのサンプルを添加することにより反応を開始した。試験した処方は以下の通りであった：サンプル３、実施例１、表IIIに上記、７週間インキュベーションおよびミクロフィブリル状態への転換（DSC融解温度により決定）後；および、サンプル３と同一の新たに作製したサンプル（これはフィブリルコラーゲン（生理食塩水で1mg/mLに希釈した）を含んだ）。血小板の凝集は光透過の増加を生じ、これはストリップチャートレコーダーで記録される。血小板凝集の効率を、最大透過の1/2（Ｔ 1/2）に達するのに必要とされる時間として表す。フィブリルコラーゲンを含むサンプルを使用した場合、Ｔ 1/2は、ミクロフィブリルを含むサンプルについての1.4分と比較して、2.1分であった。これら同じサンプルを、インビボにおいて止血効率について動物モデルで試験した。この研究もまた、フィブリルコラーゲンを含むサンプルと比較した場合に、止血を達成する時間がより早いことによって示されるように、ミクロフィブリルコラーゲンを含むサンプルの優位性を実証した。実施例６血小板活性化この実験は、フィブリノーゲン非存在下であるが、血小板存在下で血塊を形成する本発明の止血組成物の有効性を評価するために行った。新鮮なウサギ血液を３分間1380×ｇで遠心分離し、そして高血小板血漿を分離した。この血漿を同じ速度で45分間再度遠心分離して血小板をペレット化した。低血漿（plasma-poor ）上清を、53〜56℃の間まで３分間加熱してフィブリノーゲンを沈殿させた。遠心分離によりフィブリノーゲンを除去した後、血漿を血小板ペレットへと戻した。このフィブリノーゲン枯渇血漿、正常血漿のサンプル、およびこの２つの１：１混合物を、全て、フィブリン塊を形成する能力について試験した。血漿サンプル（またはコントロールとしての正常生理食塩水）を、20mg/mlコラーゲン、500U/mLウシトロンビン、および40mM CaCl₂を含む止血組成物と、１：１の比で混合し、そしてすぐに動物モデルでの出血している最中の組織部位に適用した。これらの部位についての止血時間（２分未満での出血の停止）を、以下の表VIに示す。表VI 止血時間これらの結果により実証されるように、フィブリノーゲンを枯渇した血漿と組み合わせたサンプルでさえ、正常フィブリノーゲンレベルを有する血漿を用いて達成された時間とほとんど等価である止血時間を示した。実施例７インビボウサギ止血インビボで止血を容易にする本発明の組成物の能力を試験するために、以下の二成分試験組成物を調製した：成分１）ペプシン可溶化ウシ真皮Ｉ型コラーゲンを、上記の実施例１に記載されるように、20mg/mlコラーゲン、40mM CaCl₂および500Ｕ/mlウシトロンビンの最終濃度に調製した；成分２）ウサギ高血小板血漿（クエン酸塩加全血を２分間1380×ｇで遠心分離することにより入手した）。この２つの成分を２コンパートメント噴霧装置中で適用中に混合した。このサンプル調製物を、凍結乾燥ヒトフィブリノーゲンを含有する従来の二成分フィブリン密封剤組成物（Hemacure,Kirkland,Quebec,Canada）（これは第１の成分として脱イオン水中で100mg/mlタンパク質、および第２の成分として40mM CaCl₂中500U /mlトロンビンに再構成される）と比較した。Instat^TMコラーゲンスポンジ（J ohnson&Johnson Medical,Arlington,Texas）を用いる結果もまた研究した。ウサギを標準手順を使用して麻酔し、そして腎臓および脾臓を正中開腹を行うことにより露出させた。腎臓および脾臓に切開（２mmの深さ×15mmの長さ）を行い、そして試験サンプルの適用前にガーゼを押し当てた。試験サンプルの投与後の止血までの時間を、外科領域から血液を吸収する予め秤量したコットン綿棒またはガーゼを用いて決定した全血液損失とともに、測定した。非処置ウサギ、ならびに抗血液凝固剤としてアスピリンまたはヘパリンのいずれかで前処置したウサギにおいて、研究を行った（ｎ＝５〜６）。結果を以下の表VIIに報告する。表VII インビボ止血成績^* ＊測定値は±s.e.m.で報告する。上の表VIIにおいて示されるように、試験サンプルは腎臓モデルにおいて、フィブリン密封剤またはコラーゲンスポンジのいずれよりも、より短い止血時間およびより少ない血液損失を示した。脾臓モデルにおいて、より大きな変動が動物間で観察され、その結果、処置間での比較は正確でないかもしれない。しかし、全ての例において、非処置動物と比較した場合、試験サンプル組成物の使用は有意な改善を示した。本発明の実施のための上記態様の、組織修復の分野の当業者に明らかな変更は、以下の請求の範囲の範囲内であることが意図される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、このような刊行物、特許または特許出願が詳細かつ個々に、本明細書中に参考として援用されることが示されるように、本明細書中に参考として援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ウォレス，ドナルドジー. アメリカ合衆国カリフォルニア 94025, メンロパーク，リングウッドアベニュー 290 (72)発明者デラストロ，フランクエイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 94002, ベルモント，デコーベンアベニュー 2517

Claims

【特許請求の範囲】１．水性媒体において、トロンビンおよびミクロフィブリルコラーゲンを含む、止血組成物。２．前記トロンビンがウシトロンビンである、請求項１に記載の組成物。３．前記トロンビンが組換えトロンビンである、請求項１に記載の組成物。４．前記トロンビンがトロンビン様化合物である、請求項１に記載の組成物。５．前記ミクロフィブリルコラーゲンが、約３nm〜30nmの平均直径を有する、請求項１に記載の組成物。６．前記ミクロフィブリルコラーゲンが、約42℃〜46℃の融点を有する、請求項５に記載の組成物。７．カルシウムイオンをさらに含む、請求項１に記載の組成物。８．前記カルシウムイオンが塩化カルシウムの形態で存在する、請求項７に記載の組成物。９．前記カルシウムイオンが、フィブリルコラーゲンをミクロフィブリルコラーゲンに分解するに有効な濃度で存在する、請求項７に記載の組成物。１０．前記トロンビンが、少なくとも６ヶ月間２〜８℃で貯蔵された後、80％以上の活性を保持する、請求項１に記載の組成物。１１．PEGをさらに含む、請求項１に記載の組成物。１２．前記PEGが約1,000〜8,000の平均分子量を有する、請求項１に記載の組成物。１３．前記PEGが0.1％ w/vと２％ w/vとの間の濃度で存在する、請求項１１に記載の組成物。１４．前記PEGが0.1％ w/vと0.3％ w/vとの間の濃度で存在する、請求項１３に記載の組成物。１５．前記組成物のpHが4.5と6.6との間である、請求項１に記載の組成物。１６．前記組成物のpHが5.0と5.7との間である、請求項１に記載の組成物。１７．少なくとも１つの糖をさらに含む請求項１に記載の組成物であって、該糖が該トロンビンを安定化するに有効な量で存在する、請求項１に記載の組成物。１８．前記糖が、マンニトール、ソルビトール、グルコース、およびスクロースからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。１９．少なくとも１つの生物学的に活性な薬剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。２０．前記生物学的に活性な薬剤が、増殖因子、抗生物質、および治療剤からなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物。２１．フィブリノーゲンをさらに含む、請求項１に記載の組成物。２２．トロンビンを安定化させるための手段を使用しない等価な組成物の手段よりも、非常に大きくトロンビンを安定化させる少なくとも１つの手段をさらに含む、請求項１に記載の組成物。２３．前記手段が、pHを6.6よりも低下させる工程、糖を添加する工程、PEGを添加する工程、トロンビンインヒビターを添加する工程、カルシウムイオン濃度を減少させる工程、カルシウムキレート剤を添加する工程、およびタンパク質を添加する工程からなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。２４．前記組成物が、約200〜1000ミクロンの間隙の間を流動可能である、請求項１に記載の組成物。２５．請求項１に記載の組成物およびフィブリノーゲンの供給源を含む、キット。２６．前記フィブリノーゲンの供給源が水性媒体中のフィブリノーゲンである、請求項２５に記載のキット。２７．前記フィブリノーゲンの供給源が血漿である、請求項２５に記載のキット。２８．前記血漿がヒト血漿である、請求項２７に記載のキット。２９．前記血漿が自己血漿である、請求項２７に記載のキット。３０．請求項１に記載の組成物および血小板の懸濁物を含む、キット、３１．哺乳動物被験体の身体上または身体内の組織部位の止血を促進する方法であって、以下の工程：（ａ）水性媒体においてトロンビンおよびミクロフィブリルコラーゲンを含む止血組成物を提供する工程；（ｂ）フィブリノーゲンを含む水性媒体を提供する工程；（ｃ）該止血組成物と該フィブリノーゲンを含む水性媒体とを、該組織部位と接触させる直前に混合する工程；ならびに（ｄ）該混合物を該組織部位に接触させる工程、を包含する、方法。３２．前記フィブリノーゲンを含む水性媒体が血漿であり、そして前記フィブリノーゲンを含む水性媒体を提供する工程が、前記哺乳動物被験体から該血漿を単離する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。３３．前記哺乳動物被験体がヒトであり、そして前記血漿がヒト血漿である、請求項３２に記載の方法。３４．前記ヒト血漿が、ヒト被験体由来の血液サンプルから単離される、請求項３３に記載の方法。３５．前記混合工程が、前記止血組成物および前記フィブリノーゲンを含む水性媒体を前記組織部位に送達する間、装置で行われる、請求項３１に記載の方法。３６．前記混合工程が、前記止血組成物および前記フィブリノーゲンを含む水性媒体を前記装置から排出した後に、しかし、該止血組成物および該フィブリノーゲンを含む水性媒体を該組織部位に接触させる前に行われる、請求項３５に記載の方法。３７．哺乳動物被験体の身体上または身体内の組織部位の止血を促進する方法であって、以下の工程：（ａ）水性媒体においてトロンビンおよびミクロフィブリルコラーゲンを含む止血組成物を提供する工程；（ｂ）血小板を含む水性媒体を提供する工程；（ｃ）該止血組成物と該血小板を含む水性媒体とを、該組織部位と接触させる直前に混合する工程；ならびに（ｄ）該混合物を該組織部位に接触させる工程、を包含する、方法。３８．止血剤としての使用のための組成物を作製する方法であって、以下の工程：（ａ）トロンビン、フィブリルコラーゲン、およびファイバー分解剤を、水性媒体において互いに混合させる工程であって、該ファイバー分解剤は、フィブリルコラーゲンをミクロフィブリルコラーゲンに分解するに有効な濃度で存在する、工程；および（ｂ）工程（ａ）において形成される混合物を、安定なファイバーサイズを有するミクロフィブリルコラーゲンを形成するに十分な時間で、かつ十分な温度で、インキュベートする工程、を包含する、方法。３９．前記ファイバー分解剤がカルシウムイオンである、請求項３８に記載の方法。４０．前記カルシウムイオンが10mMと200mMとの間の濃度で存在する、請求項３９に記載の方法。４１．前記ミクロフィブリルコラーゲンのファイバーサイズが３nmと30nmとの間の直径である、請求項３９に記載の方法。４２．前記方法が、前記水性媒体にフィブリノーゲンを添加する工程をさらに包含する、請求項３８に記載の方法。４３．水性媒体においてトロンビンおよびコラーゲンを含む止血組成物であって、該コラーゲンが、ミクロフィブリルコラーゲンと非ミクロフィブリルフィブリルコラーゲンとの混合物である、止血組成物。４４．前記ミクロフィブリルコラーゲンと非ミクロフィブリルフィブリルコラーゲンとの比が少なくとも１：１（w/w）である、請求項４３に記載の組成物。４５．前記ミクロフィブリルコラーゲンが、約３nm〜30nmのフィブリル直径、および約400nm〜500nmのフィブリル長を有し、そして前記非ミクロフィブリルフィブリルコラーゲンが、約30nm〜1000nmのフィブリル直径および約1000nm〜5000nm フィブリル長を有する、請求項４３に記載の組成物。