CN118108793A - 一种透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物及其制备方法和应用，属于生物化妆品领域。该抗衰老活性肽衍生物的结构为：
Description
技术领域
本发明属于生物化妆品技术领域，具体涉及一种透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
多肽是氨基酸连结成的化合物，由肽键相连，通常指的是由三个或三个以上氨基酸组成的化合物。多肽可包括活性多肽和人工合成多肽，活性多肽作为蛋白质水解产物，具有一定生理作用。而人工合成多肽则可以根据需要自由控制氨基酸的连接顺序，这为构建多肽库提供了可能，使其成为活性筛选的重要来源。生物活性多肽是常见的化妆品成分，包括上述两种来源的多肽，具有多种作用：抗氧化、保湿、抗皱、美白和消炎等，可改善皮肤质地、延缓衰老、提高皮肤免疫力等，被广泛应用于高端功能性化妆品中。
虽然该类生物活性多肽在化妆品中的有很多优势，但由于生物活性多肽的分子通常较大，难以有效穿透皮肤屏障到达深层组织，极大的限制了生物活性的发挥；同时，大部分多肽在化妆品中的稳定性较差，容易受到光、温度、pH值等因素的影响而失去活性，降低了其有效性。
现有技术中为了改善多肽的透皮吸收性能，常用的方法有：将生物活性多肽与渗透促进剂(如DMSO、辛醇等)合用，通过渗透促进剂改变皮肤角质层的结构，促进多肽的渗透；或者，利用纳米技术，将生物活性多肽负载于如纳米粒子、纳米胶体等载体系统上，以提高多肽的溶解度和渗透性。上述方法虽然能够在一定程度上改善生物活性多肽的渗透性，但操作相对复杂，且在一定程度上也会影响到生物活性多肽的稳定性，限制了其在化妆品中的功效的发挥。
鉴于此，特提出本申请。
发明内容
为了解决上述技术问题，本申请提供一种透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物及其制备方法和应用，该抗衰老活性肽衍生物通过用海藻酸修饰抗衰老活性肽(PEP-129)，能够增加该抗衰老活性肽的溶解度，有助于与皮肤细胞表面的糖受体结合，减少其被酶降解的程度，促进透皮吸收和稳定性，从而能够充分发挥PEP-129的抗氧化和光保护活性；同时，还能进一步增强皮肤的弹性和紧致度，使得抗衰老效果更为显著。
本发明通过以下技术方案实现：
第一方面，本申请提供一种透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物，该抗衰老活性肽衍生物的结构如式I所示：
式I中：n≥1；
抗衰老活性肽为PEP-129，氨基酸序列为：
Leu-Asp-Glu-Glu-Asn-Gly-Glu-Leu。
第二方面，本申请提供一种透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物的制备方法，包括以下步骤：
以2-氯三甲苯树脂和氨基酸为原料，采用固相Fmoc化学合成法，获得结构如化合物A所示的N-端裸露的肽合成树脂，化合物A中的氨基酸序列为Leu-Asp-Glu-Glu-Asn-Gly-Glu-Leu；
将海藻酸钠溶液在酸性条件下与EDC-HCl和NHS混合，搅拌10-30min后，加入N-端裸露的肽合成树脂进行偶联反应，得到如化合物B所示的海藻酸修饰的肽合成树脂；
将海藻酸修饰的肽合成树脂于氮气氛围下加入至切割液中，于0-4℃下搅拌1-3h，进行树脂脱除反应，经反应后处理后得到式I化合物。
进一步地，在偶联反应步骤中，肽合成树脂与海藻酸钠的摩尔比为1：1.1-1.3。
进一步地，在偶联反应步骤中，海藻酸钠与EDC和NHS的摩尔比为1:0.7-0.8:0.7-0.8。
进一步地，在偶联反应步骤中，酸性条件为反应体系的pH为3-4，偶联反应的反应温度为25-35℃，反应时间为12-36h。
进一步地，切割液为含有三氟乙酸或三氟乙醇的混合溶剂体系。
进一步地，切割液为浓度为三氟乙酸与二氯甲烷的混合溶液，三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1-5:95-99。
进一步地，切割液为浓度为三氟乙醇与乙酸和二氯甲烷的混合溶液，三氟乙醇与乙酸和二氯甲烷的体积比为2:1-3:5-7。
第三方面，本申请还提供一种根据权利要求1的透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物在抗衰老化妆品中的应用。
进一步地，上述抗衰老化妆品为霜、乳液、精华液和面膜中的任一种。
与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
1.本发明提供的这种抗衰老活性肽衍生物，以特殊氨基酸序列的PEP-129为抗衰老活性肽。该活性肽为发明人团队通过构建对Nrf2激动剂高通量筛选模型筛选得到，其能够有效的促进了人脐带间充质干细胞的增殖，并可以使衰老的人脐带间充质干细胞恢复增殖活力；同时，该活性肽还具有较好的抑制成纤维细胞和人永生化角质形成细胞遭受紫外线的损伤的作用，对于光损伤细胞具有优异的光修复性能。由此提示，该PEP-129可以作为抗衰老活性多肽应用于化妆品领域。
2.为了进一步提高活性肽PEP-129的透皮吸收率和稳定性，以使其生物活性充分发挥。本申请创造性地用海藻酸钠修饰活性肽PEP-129，得到多肽衍生物。由于在PEP-129分子中引入了海藻酸，海藻酸中β-D-葡萄糖醛酸和α-L-葡萄糖醛酸交替排列聚合形成的空间网状结构，一方面能够将PEP-129包裹在内，减少其被酶降解的程度，提高其稳定性；另一方面，能够提高该多肽衍生物与皮肤细胞表面的糖受体结合，促进PEP-129的透皮吸收率。此外，该抗衰老活性肽衍生物在抵达真皮层后降解获得的海藻酸还能进一步增强皮肤的弹性和紧致度，使得该多肽衍生物的抗衰老效果更为显著。
3.在合成该多肽衍生物的过程中，采用固相Fmoc化学合成法，获得肽合成树脂，并通过在特定条件下将海藻酸钠与该肽合成树脂进行偶联，得到海藻酸修饰的肽合成树脂；随后通过树脂脱除反应，得到该多肽衍生物。相比于采用固相Fmoc化学合成法获得纯化后的PEP-129后，再以其为原料起点进行合成，这种方法在获得PEP-129的合成过程中，直接对还未脱除树脂的多肽中间体(即肽合成树脂)进行化学修饰，反应步骤简单，且条件温和，有效避免了PEP-129在修饰过程中降解、失活。
附图说明
图1为本发明提供的多肽衍生物对辐射损伤HaCaT细胞活力的影响结果；
图2为本发明提供的多肽衍生物对辐射损伤HSF细胞活力的影响结果；
图3为本发明提供的多肽衍生物对皮肤中超氧化物歧化酶含量的影响；
图4为本发明提供的多肽及多肽衍生物的透皮吸收率检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本申请优选实施例中的抗衰老活性肽为PEP-129，其通过Nrf2激动剂高通量筛选方法筛选得到，该筛选方法为：
(1)使用NCBI的Homo sapiens kelch like ECH associated protein 1(KEAP1)，transcript variant 2，mRNA序列(NM_012289.4)设计引物，并以合成序列为模版，进行PCR扩增。
(2)以限制性内切酶NdeI、XhoI切割目的片段及载体PET-15b(5708bp)，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)，并使大肠杆菌生长至密度约为0.6时，添加终浓度为1mM的异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷来诱导Keap1 Kelch结构域的表达。收集大肠杆菌，洗涤后，超声破碎，收集上清液，采用Ni柱和Mono Q柱进行纯化，得到Keap1结构域蛋白。
(3)使用96孔板进行高通量筛选，每个孔的最终体积为200μL，其中包含50μL 10nMFITC-Nrf2肽和50μL 100nM Keap1结构域蛋白。分为三个组：添加50μL HEPES缓冲液作为阴性对照组(Amax)；添加50μL不同浓度的多肽待测样品作为测试组(Aobs)；使用50μL HEPES缓冲液替换Keap1蛋白，并添加50μL HEPES缓冲液作为空白组(Amin)。
将96孔板以300g离心5分钟，以除去气泡并确保充分混匀。在室温下振荡孵育30分钟，测量前再次离心。使用FP荧光共振法，以485nm为激发波长测定535nm下的荧光强度值。
采用下式计算样品对Keap1结构域蛋白抑制率：
抑制率＝((Amax-Aobs)/(Amax-Amin))×100％
并利用下式进行线性拟合，计算IC50：
y＝Amin+(Amax+Amin)/(1+10^(x-logIC50))
采用小分子抑制剂THIQ(CAS No.:312637-48-2，分子式为：C33H41ClN6O2)为阳性对照组，对上述高通量筛选模型进行验证，其IC50为2.15μM，证明了阳性对照组THIQ的抑制剂浓度与抑制效果具有剂量依赖性，模型可以用于后续的筛选。
(4)结果：
高通量筛选结果如表1所示：
表1.高通量筛选结果
| 物质 | 序列 | IC50(nM) |
| Peptide-129 | Leu-Asp-Glu-Glu-Asn-Gly-Glu-Leu | 31±5.2 |
| 人参皂苷Rg1 | - | 2150±430 |
由表1可见，通过高通量筛选的样品多肽中，Peptide-129对Keap1有很好的抑制效果，其IC50仅为31nM，显著高于阳性小分子人参皂苷Rg1(简称Rg1)对照组(IC50为2450nM)。由此提示，Peptide-129可以作为Nrf2激动剂，可用于促进人脐带间充质干细胞的增殖，抑制衰老。
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
本实施例提供一种透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物，其合成路线为：
合成方法如下：
(1)制备肽合成树脂：以2-氯三甲苯树脂和各种游离氨基酸为原料，采用固相Fmoc化学合成法，获得N-端裸露的肽合成树脂(化合物A)，化合物A中的氨基酸序列为Leu-Asp-Glu-Glu-Asn-Gly-Glu-Leu。
(2)海藻酸钠偶联：
将海藻酸钠(50g，50KDa)溶于去离子水(1.5L)，缓慢加入稀盐酸溶液(0.1M)调整pH≈3.4，随后加入少量去离子水稀释至2.0wt％，溶液变为澄清透明，随后依次加入EDC-HCl水溶液(1.0M，93mmol EDC)、NHS水溶液(93mmol)以及N端裸露的肽合成树脂(50g)，其中海藻酸/EDC-HCl/NHS摩尔比为1/0.75/0.75，30℃反应过夜后，进行沉降；将沉淀过滤、并用丙酮将沉淀洗涤两次，随后冻干得到海藻酸修饰的肽合成树脂。
(3)树脂脱除：
于500ml单口瓶中加入切割液(三氟乙酸/二氯甲烷＝2/98)300mL,冰浴下冷却至0℃，随后在氮气保护氛围下于反应液中缓慢加入上步所得透明质酸修饰的肽合成树脂(40g)，0℃反应条件下搅拌2小时。将所得反应液过滤，滤饼丙酮洗涤3次后，滤液减压蒸馏除去大部分溶剂，随后加入去离子水300ml，冷却至0℃后缓慢加入冰丙酮100ml，有白色固体析出，随后离心分层，倾析出大部分溶剂后，采用冷却的冰水/丙酮洗涤三次后冷冻干燥得到白色固体，即为抗衰老活性肽衍生物(记为AA-PEP-129)，纯度为98.5％。
实施例2
本实施例提供一种透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物，其合成方法与实施例1基本一致，不同之处在于：
(2)海藻酸钠偶联：
将海藻酸钠(50g、50KDa)溶于去离子水(1.5L)，缓慢加入稀盐酸溶液(0.1M)调整pH≈3，随后加入少量去离子水稀释至2.0wt％，溶液变为澄清透明，随后依次加入EDC-HCl水溶液(1.0M，93mmol EDC)、NHS水溶液(93mmol)以及实施例1合成的肽合成树脂(50g)，其中海藻酸/EDC-HCl/NHS摩尔比为1/0.7/0.7，25℃反应过夜后，进行沉降；将沉淀过滤、并用丙酮将沉淀洗涤两次，随后冻干得到海藻酸修饰的肽合成树脂。
实施例3
本实施例提供一种透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物，其合成方法与实施例1基本一致，不同之处在于：
(2)海藻酸钠偶联：
将海藻酸钠(50g、50KDa)溶于去离子水(1.5L)，缓慢加入稀盐酸溶液(0.1M)调整pH≈4，随后加入少量去离子水稀释至2.0wt％，溶液变为澄清透明，随后依次加入EDC-HCl水溶液(1.0M，93mmol EDC)、NHS水溶液(93mmol)以及实施例1合成的肽合成树脂(50g)，其中海藻酸/EDC-HCl/NHS摩尔比为1/0.8/0.8，35℃反应过夜后，进行沉降；将沉淀过滤、并用丙酮将沉淀洗涤两次，随后冻干得到海藻酸修饰的肽合成树脂。
实施例4
本实施例提供一种透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物，其合成方法与实施例1基本一致，不同之处在于：
(3)树脂脱除：
于500ml单口瓶中加入切割液(三氟乙醇/乙酸/二氯甲烷＝2/2/6)300mL,冰浴下冷却至0℃，随后在氮气保护氛围下于反应液中缓慢加入上步所得透明质酸修饰的肽合成树脂(40g)，0℃反应条件下搅拌2小时。将所得反应液过滤，滤饼丙酮洗涤3次后，滤液减压蒸馏除去大部分溶剂，随后加入去离子水300ml，冷却至0℃后缓慢加入冰丙酮100ml，有白色固体析出，随后离心分层，倾析出大部分溶剂后，采用冷却的冰水/丙酮洗涤三次后冷冻干燥得到白色固体，即为抗衰老活性肽衍生物。
实施例5
本实施例提供一种透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物，其合成方法与实施例1基本一致，不同之处在于：
(3)树脂脱除：
于500ml单口瓶中加入切割液(三氟乙醇/乙酸/二氯甲烷＝2/2/6)300mL,冰浴下冷却至0℃，随后在氮气保护氛围下于反应液中缓慢加入上步所得透明质酸修饰的肽合成树脂(40g)，0℃反应条件下搅拌2小时。将所得反应液过滤，滤饼丙酮洗涤3次后，滤液减压蒸馏除去大部分溶剂，随后加入去离子水300ml，冷却至4℃后缓慢加入冰丙酮100ml，有白色固体析出，随后离心分层，倾析出大部分溶剂后，采用冷却的冰水/丙酮洗涤三次后冷冻干燥得到白色固体，即为抗衰老活性肽衍生物。
性能测试
一、对皮肤细胞光老化的保护作用
1.测试方法：
考察多肽对UVB老化的人永生化皮肤角质形成细胞(HaCaT)和人皮肤成纤维细胞(HSF)的保护作用，HaCaT使用含10％FBS的MEM培养，HSF使用含10％FBS的DMEM培养。将HSF/HaCaT以每孔5×103个细胞接种于96孔板上，置于CO2培养箱培养约24小时后达到80％汇合。此时弃去培养液，并使用PBS清洗2遍，以30mJ/cm2 UVB照射处理。
然后加入对应不含血清培养基配置成的一定浓度的样品溶液：空白组不含样品不经过UVB辐照，模型组不含样品经UVB辐照，实验组经UVB辐照且分别加入的人参皂苷Rg1(500ng/mL)、PEP-129(未修饰、500ng/mL)、实施例1提供的PEP-129多肽衍生物(AA-PEP-129，500ng/mL)。置于CO2培养箱处理24小时，然后弃去培养基，培养24h后，使用MTT法进行细胞活力测试。
2.测试结果：
根据图1和图2的结果可以看出，两种不同类型的人皮肤细胞在接受30mJ/cm2的UVB照射后，细胞活性都出现了明显的下降。其中阳性对照组Rg1在500μg/mL时，发挥抗光老化作用，抑制UVB照射对细胞的损伤。而未修饰的PEP-129多肽在500ng/mL时，对于两种皮肤细胞都表现出较好的保护作用，能使UVB辐照的HaCaT细胞恢复活力至97.25±7.51％(P≤0.05)，使UVB辐照辐照的HSF细胞恢复活力至98.25±6.34％(P≤0.05)。在本申请实施例1提供的海藻酸修饰的PEP-129多肽(AA-PEP-129)，被辐照的HaCaT细胞活力和被辐照的HSF细胞活力已能达到未辐照的对照组水平，效果提升显著。由此说明，采用海藻酸修饰后的PEP-129多肽，不但没有影响多肽的抗光老化活性，反而会使其活性有一定程度的提升。
二、抗衰老性能测试：
1.实验方法：
将ICR小鼠(SPF级别，重量25g左右，雌雄各半)适应性饲养1周。除对照组外，实验组和模型组每天背部皮下注射d-半乳糖(D-gal)，给药剂量为1000mg/kg，每天1次，连用8周。对照组则给予相同体积生理盐水。所有注射均采用无菌技术操作，每个注射点用龙胆紫标记。2周后，三组小鼠背部穴位分别注射人参皂苷Rg1(500ng/mL)、PEP-129(未修饰、500ng/mL)、实施例1提供的PEP-129多肽衍生物(AA-PEP-129，500ng/mL)至真皮层。
4周后处死小鼠，每组裸鼠涂抹区域取一块重0.5g的皮肤组织块。用预冷生理盐水冲洗皮肤组织块，然后去除皮下脂肪和其他结缔组织。用滤纸将皮肤组织块擦干并称重，加入比皮肤组织重9倍的预冷生理盐水，然后用组织匀浆机(冰浴条件下)将皮肤组织制成10％的组织匀浆，反复三次，直到细胞完全破坏。采用试剂盒检测细胞衰老相关生物指标，黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)。
3.实验结果：
SOD活性，根据图3的结果可以看出，注射有Rg1、PEP-129多肽以及海藻酸修饰的PEP-129多肽衍生物均可以显著改善衰老小鼠的抗氧化能力，提高超氧化物歧化酶的活性，与模型组之间的差异具有显著性意义，P<0.05。其中海藻酸修饰的PEP-129多肽衍生物组中，超氧化物歧化酶的活性达到了145.36±8.24U/mg protein，基本与对照组持平，由此说明海藻酸修饰的PEP-129多肽衍生物具有极佳的抗氧化效果(P≤0.001)。
三、透皮吸收率检测：
1.检测方法：
采用Franz透皮吸收扩散池测定透皮吸收率，将市售的香猪皮肤固定在Franz透皮吸收扩散池的上下两室之间，角质层朝上。将PEP-129、以及海藻酸修饰的PEP-129多肽衍生物与化妆品基质混合，涂覆于医用胶布上，制得测试用样品，该测试用样品中多肽或多肽衍生物的载药量为200μg/cm2。测试采用RT800自动取样透皮扩散系统进行，接受池内盛放生理盐水，接受液与真皮层刚好接触，随后于3h、6h、9h和12h分别取100μL，采用HPLC-MS法检测接受液中多肽或多肽衍生物的浓度，计算透皮吸收量，并按照下式计算透皮吸收率：
透皮吸收率(％)＝(透皮吸收量/初始剂量)×100
2.检测结果：
结果如图4所示，相比于未修饰的PEP-129多肽(蓝色线条)，本申请提供的这种海藻酸修饰后的PEP-129多肽衍生物(红色线条)的透皮吸收率得到明显提升，于12h时透皮吸收率最大(11.23％)。由此说明，本申请提供的PEP-129多肽衍生物，通过将采用海藻酸进行修饰后，有助于促进PEP-129的透皮吸收，增强其抗衰老活性。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物，其特征在于，所述抗衰老活性肽衍生物的结构如式I所示：
式I中：n≥1；
所述抗衰老活性肽为PEP-129，氨基酸序列为：
Leu-Asp-Glu-Glu-Asn-Gly-Glu-Leu。
2.根据权利要求1所述的透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
以2-氯三甲苯树脂和氨基酸为原料，采用固相Fmoc化学合成法，获得结构如化合物A所示的N-端裸露的肽合成树脂，所述化合物A中的氨基酸序列为Leu-Asp-Glu-Glu-Asn-Gly-Glu-Leu；
将海藻酸钠溶液在酸性条件下与EDC-HCl和NHS混合，搅拌10-30min后，加入N-端裸露的所述肽合成树脂进行偶联反应，得到如化合物B所示的海藻酸修饰的肽合成树脂；
将所述海藻酸修饰的肽合成树脂于氮气氛围下加入至切割液中，于0-4℃下搅拌1-3h，进行树脂脱除反应，经反应后处理后得到所述式I化合物。
3.根据权利要求1所述的透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物的制备方法，其特征在于，在所述偶联反应步骤中，所述肽合成树脂与所述海藻酸钠的摩尔比为1：1.1-1.3。
4.根据权利要求1所述的透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物的制备方法，其特征在于，在所述偶联反应步骤中，所述海藻酸钠与EDC和NHS的摩尔比为1:0.7-0.8:0.7-0.8。
5.根据权利要求1所述的透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物的制备方法，其特征在于，在所述偶联反应步骤中，所述酸性条件为反应体系的pH为3-4，所述偶联反应的反应温度为25-35℃，反应时间为12-36h。
6.根据权利要求1所述的透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物的制备方法，其特征在于，所述切割液为含有三氟乙酸或三氟乙醇的混合溶剂体系。
7.根据权利要求6所述的透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物的制备方法，其特征在于，所述切割液为浓度为三氟乙酸与二氯甲烷的混合溶液，所述三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1-5:95-99。
8.根据权利要求6所述的透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物的制备方法，其特征在于，所述切割液为浓度为三氟乙醇与乙酸和二氯甲烷的混合溶液，所述三氟乙醇与乙酸和二氯甲烷的体积比为2:1-3:5-7。
9.一种根据权利要求1所述的透皮吸收型抗衰老活性肽衍生物在抗衰老化妆品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗衰老化妆品为霜、乳液、精华液和面膜中的任一种。
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