KR101093685B1

KR101093685B1 - 신규한 팔미토일트리펩타이드와 이를 함유하는 주름개선 화장품 조성물

Info

Publication number: KR101093685B1
Application number: KR1020080090704A
Authority: KR
Inventors: 정 근 황; 진 교 정; 영 훈 안; 순 민 배; 준 섭 신; 혁 광 정
Original assignee: (주)모아캠; (주)마임
Priority date: 2008-09-16
Filing date: 2008-09-16
Publication date: 2011-12-15
Also published as: KR20100031862A; WO2010032891A1

Abstract

본 발명은 하기 구조식 I의 신규한 팔미토일트리펩타이드 화합물 및 이를 함유하는 주름개선 화장품 조성물에 대한 것이다.

[구조식 I]

본 발명에 따른 화장품 조성물은 상기 화합물을 함유함으로써 탁월한 주름개선 및 피부탄력성 향상에 따른 피부노화억제 효과를 가진다. 상기 화합물은 또한 손상된 피부 조직의 콜라겐 생성을 촉진함으로써 피부 재생에 있어서도 탁월한 효과를 제공한다.

팔미토일트리펩타이드, Nsc-아미노산, 피부노화, 콜라겐, 주름개선

Description

신규한 팔미토일트리펩타이드와 이를 함유하는 주름개선 화장품 조성물{Novel palmitoyltripeptide and anti-wrinkle cosmetic composition containing it}

본 발명은 신규한 펩타이드 유도체 화합물, 및 상기 화합물을 함유하는 피부노화억제의 화장품 조성물에 대한 것이다.

피부는 인체를 외부의 각종 위협에서 보호하는 기능을 하며 항상 다양한 외부자극을 접하기 때문에 노화현상이 일어나기 쉽다. 피부조직이 노화되면 섬유질과 기질의 생성능력이 저하되고, 이에 따라 기질의 양이 감소하면 피부의 두께가 얇아지고 피부의 탄력을 저하시켜 주름이 형성된다. 지금까지 다양한 화합물들이 잔주름, 주름, 노화, 또는 광손상된 피부와 관련된 다른 증상을 포함하여 피부 외관 및 생리 기능을 개선하는데 유용하다고 알려져 있다. 예를 들면, 비타민 C 및 레티노이드 등의 피부개선 효과는 잘 알려져 왔으며, 이들을 함유한 화장품 조성물들이 전 세계 시장에서 판매되어 각광을 받고 있다. 그러나 종래기술에 따른 피부개선용 조성물들은 피부개선 효과에 못지않은 부작용, 즉 보관시의 안정성 문제 및 피부자극을 야기하는 문제들이 보고되고 있다.

피부자극의 부작용이 비교적 덜하면서도 피부개선 효과를 갖는 화합물로는 펩타이드를 들 수 있다. 펩타이드는 모든 단백질의 주요 구성성분으로서, 피부에 대한 부작용이 없이 피부 재생을 활성화시킬 수 있는 장점을 가진다. 최근에 발표된 연구에 의하면, 펩타이드 또는 펩타이드 유도체를 함유한 화장품은 종래 주름개선제로서 일반적으로 사용되고 있는 레티놀에 비해서 피부개선효과가 매우 빠르며, 다량 사용한다 하더라도 부작용이 없어서, 눈가와 같은 민감한 부위에도 안심하고 사용될 수 있다고 한다.

현재 주름개선용 화장품에 사용되는 펩타이드 유도체들은 여러 가지가 알려져 있다. 이러한 펩타이드 유도체의 예로는 Palm-Gly-His-Lys와 같은 트리펩타이드 유도체와 Palm-Gly-Gln-Pro-Arg 같은 테트라펩타이드 유도체, 펜타펩타이드, 및 헥사펩타이드 등이 알려져 있으며, 이들을 주성분으로 함유하는 화장용 조성물로 이루어진 화장품이 일부 시판되고 있다. 상기 펩타이드 유도체 성분들은 피부 연조직 내의 콜라겐 활성화 기능을 수행함으로써 궁극적으로 피부 주름을 제거하고, 피부 재생을 수행하는 역할을 한다.

현재 피부개선을 위한 화장품 조성물에 대한 연구의 주류는 콜라겐을 활성화시키는 신규한 화합물을 찾는데 집중되고 있다. 콜라겐을 구성하는 주요 아미노산은 글리신, 프롤린, 히드록시프롤린이며, 다른 단백질에는 존재하지 않는 히드록시프롤린의 함량이 높다는 것이 특징이다. 이에 따라, 상기 세 가지 아미노산들로 이루어진 Gly-Pro-Hyp가 콜라겐을 대표하는 펩타이드로 알려져 있다.

여러 논문들(Acta Neurobiol. Exp. 1994, 54:33-38, Acta Neurobiol. Exp. 1992, 52:223-232)에 따르면, 콜라겐을 대표하는 상기 펩타이드 (Gly-Pro-Hyp)를 피부에 도포할 경우 주름개선에 많은 도움을 주는 것으로 확인되어 있다. 현재 Gly-Pro-Hyp는 일본 및 미국의 다양한 제품에서 콜라겐 활성화 및 피부주름개선을 위한 성분으로서 이용되고 있다. 그러나 Gly-Pro-Hyp는 순수한 친수성분으로만 되어 있어 피부장벽(세라마이드 층)을 통과하는데 어려움이 있다.

이처럼 피부개선 효과를 같는 다양한 펩타이드들, 그리고 상기 펩타이드의 유도체들을 함유한 화장품 조성물들이 보고되고 있지만, 부작용이 적으면서도 주름개선, 보습, 노화 억제, 및 피부 재생과 같은 다양한 요구를 모두 충족시키는 화장용 조성물은 아직 보고된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 극복하고자 하는 것으로, 친수성 펩타이드인 Gly-Pro-Hyp의 피부장벽에 대한 침투의 어려움을 극복하기 위하여, 상기 Gly-Pro-Hyp에 소수성의 팔미토일 기를 도입하여 친수-친유 구조를 가지는 신규한 팔미토일트리펩타이드 유도체를 제공하는데 그 목적이 있다. 이에 더하여, 상기 신규한 팔미토일트리펩타이드 유도체의 제조방법 및 이를 함유하는 화장품 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 하기 구조식 I 또는 팔미토일-글리시닐-프롤리닐-히드록시프롤린 (Palmitoyl-Glycinyl-Prolinyl-Hydroxyproline; Palm-Gly-Pro-Hyp)으로 표시되는 신규한 팔미토일트리펩타이드 화합물을 제공한다.

[구조식 I]

본 발명의 다른 양태에 따르면, 2-(4-니트로페닐)술포닐에톡시카르보닐-아미노산 (Nsc-아미노산)을 반응물로 사용하여, 레진을 기점으로 아미노산을 연속적으 로 결합시킴으로써 글리시닐-프롤리닐-히드록시프롤리닐-레진 (Gly-Pro-Hyp-resin)을 합성하는 단계, 상기 글리시닐-프롤리닐-히드록시프롤리닐-레진에 팔미토일 기를 도입하여 팔미토일-글리시닐-프롤리닐-히드록시프롤린-레진 (Palm-Gly-Pro-Hyp-resin)을 합성하는 단계, 및 상기 팔미토일-글리시닐-프롤리닐-히드록시프롤리닐-레진으로부터 레진 및 곁사슬보호기를 제거하는 단계를 포함하는 팔미토일트리펩타이드 화합물 (Palm-Gly-Pro-Hyp)을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 팔미토일트리펩타이드 화합물을 함유하는 주름개선 및 노화억제를 위한 화장품 조성물을 제공한다.

다른 방법으로, 상기 화장품 조성물은 유연 화장수(스킨), 영양로션, 또는 영양크림일 수 있다.

또 다른 방법으로, 상기 화장품 조성물 중의 상기 팔미토일트리펩타이드 화합물의 함량은 0.0001 내지 0.1 중량%일 수 있다.

본 발명에 따른 신규한 팔미토일트리펩타이드 화합물을 함유하는 화장품 조성물은 피부노화, 주름개선, 피부탄력 및 피부침투 효과가 탁월할 뿐만 아니라 장기 보존 안정성, 피부 안전성, 및 사용 편리성이 우수한 주름개선 효과를 제공한다.

본 발명은 신규한 펩타이드 유도체인 Palm-Gly-Pro-Hyp 및 이를 함유하는 주름개선용 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명의 신규한 펩타이드의 제조방법은 2-(4-니트로페닐)술포닐에톡시카르보닐 [2-(4-nitrophenyl)sulfonylethoxycarbonyl]-아미노산 (이하 Nsc-아미노산이라 한다)을 이용하여 팔미토일트리펩타이드를 제조하는 것으로서, 구체적인 제조방법은 1) 레진에 아미노산 혼합물을 세 번 반복하여 결합반응시키는 단계, 2) 팔미토일기를 도입하는 단계, 3) 레진 및 곁사슬보호기를 제거하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 합성방법에 이용되는 Nsc-아미노산은 종래의 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc)-아미노산보다 안정하여 상온에서 취급이 수월한 장점이 있다. 또한 Nsc-아미노산은 펩타이드 합성 시 일반적으로 사용되는 용매인 DMF 내에서 분해되는 속도가 상기 Fmoc에 비해 상당히 느리고, 훨씬 완화된 조건에서 Nsc기를 제거할 수 있는 장점이 있다. 이에 따라, Nsc-아미노산을 이용하는 합성방법은 아미노산 혼합물을 용매에 미리 녹여 두고 합성 반응기를 이용하여 펩타이드를 합성하는 통상적인 펩타이드 제조방식에 매우 유리하게 적용될 수 있으며, 또한 반응 전에 아미노산의 손상으로 일어날 수 있는 여러 가지 부반응도 줄일 수 있다. 이에 더하여, Nsc-아미노산은 Fmoc-아미노산보다 저렴하므로 상기 Fmoc를 시용하는 종래의 제조방법에 비해 보다 경제적이다.

본 발명을 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다. (1)Nsc-아미노산을 이용한 펩타이드 합성방법을 사용하여 신규한 팔미토일트리펩타이드인 Palm-Gly-Pro-Hyp를 합성한다. (2)상기 팔미토일트리펩타이드를 수용액화하여 건조중량으로써 0.0001 ~ 0.1%, 바람직하게는 약 0.01%의 양으로 화장료 조성물에 첨가하고 그 효과를 측정한다. 아래에 기술하는 실시예는 본 발명의 내용을 구체적으로 설명하기 위한 것이 며, 다만 본 발명의 내용이 여기에 한정되지는 않는다.

<실시예>

이하의 예들은 본 발명의 범위 내에서 실시 형태를 더 자세히 기술하고 설명하기 위한 것이다. 이는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이지 제한하기 위한 것이 아니며, 본 발명의 개념 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형들이 가능할 것이다. 본 명세서와 실시예에서 사용한 약어는 다음과 같다.

Nsc: 2-(4-니트로페닐)술포닐에톡시카르보닐

Fmoc: 9-플루오레닐메톡시카르보닐

Gly: 글리신

Pro: 프롤린

Hyp: 히드록시프롤린

Palm: 팔미토일

DIPEA: 디이소프로필에틸아민

DMF: N,N-디메틸포름아미드

MC: 염화메틸렌

HOBT: 1-히드록시벤조트리아졸

HBTU: 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트

TFA: 트리플루오로아세트산

TIS: 트리이소프로필실란

tBu: 3차-부틸

<실시예 1> Palm-Gly-Pro-Hyp의 합성

본 발명에 따른 신규한 펩타이드 유도체인 Palm-Gly-Pro-Hyp은 고체상 펩타이드 합성법에 의해 합성되었으며, 합성된 펩타이드 유도체는 HPLC와 Maldi-Tof mass를 이용하여 분석하였다.

(a) Hyp의 도입: 2-클로로트리틸클로라이드 레진(2-Chlorotrityl chloride resin:CTL resin, Bead TechTM, 1% DVB crosslinked, 100~200 mesh; 1.3 mmol/g) 7.7g(10mmol)을 반응용기에 넣고 MC 110ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 DMF 110ml를 넣어 3분간 교반 후 다시 용매를 제거하였다. 이어서 Nsc-Hyp(tBu)-OH 5.33g(1.2eq)과 DMF 50mL, DIPEA 7mL(4eq)를 첨가하여 1시간 반응시킨 후, 세척하고 메탄올과 DIPEA(2:1)를 MC에 녹여 10분간 반응시킨 후 과량의 MC/DMF(1:1)로 세척하였다. 20% 피페리딘이 포함된 DMF 용액 50mL로 Nsc기를 탈보호 처리 후 3회 DMF로 세척하여 Hyp-resin을 얻었다. 이때 레진 g당 결합된 아미노산의 용량은 0.64 mmol이었다.

(b) Pro의 도입: Hyp-resin에 Nsc-Pro-OH 7.5g(2eq)와 HOBt 2.7g(2eq), HBTU 7.6g(2eq)를 각각 DMF 에 녹여 첨가한 다음 DIPEA 7mL(4eq)를 추가하여 반응시켰다. 반응의 완결은 Kaiser test로 확인하였으며 아미노산 축합 후 Nsc기의 탈보호는 20% 피페리딘이 포함된 DMF 용액 50mL로 20분씩 2회 반응하고 세척하여 Pro-Hyp-resin을 얻었다.

(c) Gly의 도입: 상기 Pro-Hyp-resin에 Nsc-Gly-OH 6.6g(2eq)와 HOBt 2.7g( 2eq), HBTU 7.6g(2eq)를 각각 DMF 에 녹여 첨가한 다음 DIPEA 7mL( 4eq)를 추가하여 반응시켰다. 반응의 완결은 Kaiser test로 확인하였으며 아미노산 축합 후 Nsc기의 탈보호는 20% 피페리딘이 포함된 DMF 용액50mL로 20분씩 2회 반응하고 세척하여 Gly-Pro-Hyp-resin을 얻었다.

(d) Palmitoyl 기의 도입: 상기 Gly-Pro-Hyp-resin에 DMF 60mL를 가한 후 Palmitoyl chloride 6.4mL(2eq)와 DIPEA 5.2mL(3eq)를 가하여 반응시켰다. 반응의 완결은 Kaiser test로 확인한 후 반응 완료 시 DMF 및 MC를 이용하여 충분히 세척 후 건조하였다.

(e) 탈루: 상기 Palm-Gly-Pro-Hyp-resin에 TFA:TIS:H₂O (95:2.5:2.5) 70mL를 넣고 탈루하여 diethyl ether 200mL에 분산한 후 여과하여 건조하여 순도 74.4% 및 수율 82%로 미정제 Palm-Gly-Pro-Hyp을 얻었다. HPLC 결과는 다음과 같다: R_t 31.2(0~100% 0.1% TFA in ACN for 40min, XTerra^TMRP₁₈, 5㎛, 4.6× 250mm)

f) 정제: 상기 미정제 Palm-Gly-Pro-Hyp을 ID 5cm preparative LC를 통해 정제 및 동결 건조하여 신규한 펩타이드 유도체 (Palm-Gly-Pro-Hyp)의 분말 2.69g을 얻었다. 그 순도는 99.1%이었으며, 분자량 측정기를 이용하여 분자량 524.40(이론값: 523.71)임을 알 수 있었다.

<실시예 2> Palm-Gly-Pro-Hyp의 수용액 제조

상기 실시예 1에서 합성된 펩타이드 유도체를 화장품 제형에 첨가하기 위하여 아래의 방법으로 1000 ppm의 농도로 수용액화 하였다.

상기 Palm-Gly-Pro-Hyp 0.1g을 부틸렌 글리콜 12g에 상온에서 혼합하여 녹인 후, solubilizant LRI 1g, 에탄올 5g, Phenonip 0.4g을 넣고 정제수 81.4g을 가해 잘 교반하고, 트리에탄올아민을 사용하여 pH를 5.3으로 맞추었다.

<실시예 3> 유연 화장수(스킨)의 제형

표 1은 팔미토일트리펩타이드를 함유한 유연 화장수(스킨)의 제형예를 기술한 것이다.

번 호	원 료	단위 (중량%)
1	팔미토일트리펩타이드 (1,000ppm)	10.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌글리콜	2.0
4	폴리옥시에칠렌(60) 경화피마자유	0.5
5	에탄올	6.0
6	향료, 방부제, 색소	적량
7	정제수	잔량
	합 계	100.0

<실시예 4> 영양로션의 제형

표 2는 팔미토일트리펩타이드를 함유한 영양로션의 제형예를 기술한 것이다.

번호	원 료	단위 (중량%)
1	팔미토일트리펩타이드 (1,000ppm)	10.0
2	스쿠알란	4.0
3	유동파라핀	3.0
4	카프릴릭/카프릭 글리세라이드	4.0
5	스테아린산	1.0
6	세틸알코올	1.0
7	글리세릴모노스테아레이트	0.5
8	폴리솔베이트 60	1.5
9	솔비탄세스퀴올레이트	0.5
10	글리세릴스테아레이트/피이지-100 스테아레이트	1.0
11	글리세린	3.0
12	부틸렌글리콜	2.0
13	카보머	0.1
14	트리에탄올아민	0.1
15	방부제, 색소, 향료	적량
16	정제수	잔량
	합 계	100.0

<실시예 5> 영양크림의 제형

표 3은 팔미토일트리펩타이드를 함유한 영양크림의 제형예를 기술한 것이다.

번호	원 료	단위 (중량%)
1	팔미토일트리펩타이드 (1,000ppm)	10.0
2	스쿠알란	5.0
3	유동파라핀	3.5
4	카프릴릭/카프릭 글리세라이드	4.5
5	스테아린산	1.5
6	세틸알코올	2.0
7	밀납	1.0
8	바셀린	2.0
9	글리세릴모노스테아레이트	1.0
10	폴리솔베이트 60	1.5
11	솔비탄세스퀴올레이트	0.5
12	글리세릴스테아레이트/피이지-100 스테아레이트	1.5
13	글리세린	5.0
14	부틸렌글리콜	5.0
15	카보머	0.2
16	트리에탄올아민	0.2
17	방부제, 색소, 향료	적량
18	정제수	잔량
	합 계	100.0

일반적인 세포배양은 배양 플라스크의 바닥에 세포가 붙어 자라는 monolayer 배양과 세포 배양액 안에 세포가 현탁되어 자라는 분산(suspended) 배양이 있다. 이 중에서 피부와 연관된 효과 시험용으로 자주 사용하는 배양법은 monolayer 배양법이다. 상기 momolayer 배양법은 피부 시험과 연관된 fibroblast나 keratinocyte, 혹은 endocrine cell 등이 부착되어 자라는 형태의 세포들을 다루기 때문이다. 상기 monolayer 배양법을 이용한 효능 평가 시험은 시험의 결과를 비교적 빨리 알 수 있고, 필요한 샘플의 양이 적기 때문에 다량의 샘플 스크리닝에 비교적 용이하게 사용될 수 있다. 또한, 시험 비용에 대한 부담도 비교적 작은 편이다. Monolayer 배양법의 단점으로 들 수 있는 것은 배지에 용해 가능한 수용성 물질만을 시험 대상으로 할 수 있다는 점, 실제 피부 조직에서의 시험 결과와의 차이가 비교적 크다는 점, 그리고 세포에 직접 적용되므로 독성에 대한 완충물이 없다는 점이다.

따라서 최근에는 상기 monolayer 배양법의 단점을 보완하고, 보다 실제 피부에 근접하는 결과를 얻기 위하여 특정한 목적 세포의 단층적인 배양보다는 실제 피부를 구성하고 있는 몇 가지 연관된 세포를 같이 배양하는 3D 인공 배양법이 많이 개발되어 활용되고 있다. 상기 인공적인 3D 세포 배양은 세포간의 상호작용 (세포간 신호전달, 물질전달)을 연구하는데도 많이 응용이 되고 있다. 상기 인공적인 3D 세포 배양의 예로는 인공진피인 D.E(Dermal Equivalent) 배양계에 keratinocyte를 추가로 심어서 배양하는 방법을 들 수 있다.

상기 3D 실험에 따르면, 인공 진피를 일정기간 배양한 후 콜라겐 시트 (collagen sheet) 상에 keratinocyte를 분주함으로써 배양계를 만든다. 상기 분주 된 keratinocyte는 collagen sheet층 상에 각질화(keratinized) 된 barrier를 만들고, 그 중 일부는 collagen sheet 층으로 이주한다. 이 경우, 상기 각질화 된 barrier 덕분에 완제품을 그대로 사용하거나 고농도의 첨가물을 사용하는 효능 시험에서 독성에 대한 댐핑 능력이 높다. 따라서 상기 3D 실험에 따른 배양계는 단백질 합성 능력 시험이나 세포증식 능력, 세포 대사능력, 및 기타 면역 물질의 분석 등에 효과적으로 사용될 수 있다. 배양에 필요한 미디어 (media)는 fibroblast를 위한 DMEM media 및 keratinocyte를 위한 keratinocyte SFM 등의 배지를 이용한다.

상기 3D 배양계의 제조 및 평가방법은 다음과 같다;

1. 인공진피인 D.E(Dermal Equivalent) 배양계: 콜라겐 메트릭스와 fibroblast를 이용하여 인공진피액을 만들어 Transwell에 넣어 인공 진피를 만든다.

2. 약 1 주 정도 배양시킨 상기 배양계 상에 keratinocyte를 배양시켜 각질층을 형성하게 한다.

3. 상기 각질층이 충분히 형성된 인공피부 상에 본 발명에 따라 제조된 원료또는 화장품 조성물을 적용한 다음 각종 실험목적에 맞게 (대사활성, 콜라겐생합성, 및 항염증 등) 자극을 가하거나 시료를 처리한 후 결과를 측정한다.

<실시예 6> Palm-Gly-Pro-Hyp의 섬유아세포 증식효과

본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 섬유아세포 증식효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 1에 따른 방법으로 제조한 Palm-Gly-Pro-Hyp (시료 A)에 대하여 MTT assay를 실시하였다. 비교실험으로서, 팔미토일기가 도입되지 아니한 펩타이드인 Gly-Pro-Hyp (시료B)를 사용하였다.

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 측정을 위하여 인공피부에 MTT 를 처치하고 MTT가 상기 인공피부내 세포에 충분히 스며들게 한 뒤, 상기 인공피부에 DMSO를 2ml 씩 투여해 가며 MTT 추출 후 ELISA reader를 이용하여 560 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

표 4는 본 발명에 따른 펩타이드 화합물 (Palm-Gly-Pro-Hyp)에 대한 MTT assay 결과를 표시한 것이다.

농도(%)	0.0008	0.0004	0.0002	0.0001
Palm-Gly-Pro-Hyp(O.D.)	0.799	0.741	0.732	0.721
Gly-Pro-Hyp(O.D.)	0.691	0.642	0.612	0.601
Palm-Gly-Pro-Hyp(%)	148.79	137.99	136.31	134.26
Gly-Pro-Hyp(%)	128.68	119.55	113.97	111.92

도 1은 본 발명에 따른 펩타이드 화합물 (Palm-Gly-Pro-Hyp)에 대한 MTT assay 결과를 도시한 것이다.

표 4 및 도 1을 참조하면, 상기 실시예 1에 따른 방법으로 제조한 펩타이드 유도체 (Palm-Gly-Pro-Hyp)는 컨트롤 화합물인 Gly-Pro-Hyp에 비해 우수한 섬유아세포 증식 효과를 나타냄을 알 수 있다.

<실시예 7> Palm-Gly-Pro-Hyp의 콜라겐합성 개선효과

본 발명에 따른 펩타이드 유도체의 콜라겐합성 개선효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 1에 따른 방법으로 제조한 Palm-Gly-Pro-Hyp에 대하여 Pro-collagen Type I C-peptide(PIP) 정량 키트를 사용하여 콜라겐합성 개선효과 측정을 실시하였다.

콜라겐은 ECM (Extra Cellular Matrix; 세포외기질)을 이루고 있는 가장 큰 구조물이라고 할 수 있다. 콜라겐의 생합성과 분해 억제는 ECM의 건강에 매우 밀접한 관계가 있다고 할 수 있다. 다양한 유형의 콜라겐들 (Types I, II, III, IV, 및 V)은 프로콜라겐 (procollagens)이라고 불리는 전구체 분자들로부터 합성된다.

이러한 procollagens들은 아미노산 체인의 양쪽 말단인 C 터미널 및 N 터미널 각각의 말단에, pro-peptides라고 불리는 추가적인 펩타이드 시퀀스를 추가로 함유하고 있다. 상기 pro-peptides는 pro-collagen 분자들이 3차 헬릭스 구조로 잘 감기도록 하여 endoplasmic reticulum 안으로 잘 형성되게끔 해준다. 상기 pro-peptide들은 콜라겐이 분비 될 때 잘라져 나오며, 그 후 3차 헬릭스 구조의 콜라겐은 ECM 내에 존재하게 된다. 따라서 pro-peptides의 양의 정량화는 우리가 목적으로 하는 콜라겐의 양을 정량화하는데 있어서 믿을 수 있는 하나의 기준이 될 수 있다.

시험에 사용된 pro-collagen Type I C-peptide(PIP) 정량 키트는 TAKARA사의 제품을 사용하였으며, 인공피부 배양액중의 pro-peptides의 함량의 평가는 다음의 방법에 따라 수행되었다.

(a) 100 마이크로리터의 antibody-POD결합체를 micro-well에 넣는다. 그 직후 각각의 시험 목적에 알맞게 20 마이크로리터의 샘플 또는 스탠다드 물질을 넣어준다.

(b) 실 (seal)로 microplate를 덮은 뒤 3시간 동안 37℃에서 방치한다.

(c) 배양 후 각 well에 들어 있는 모든 액체를 버리고 plate washer를 사용하여 4회 세척해 준다.

(d) 기질 처리: 100 마이크로리터의 기질 용액을 각 웰(well)에 넣어주고 실온에서 15분간 방치한 후 100 마이크로리터의 반응 정지액을 각 웰에 넣어서 기질 반응을 정지시킨다.

(e) 450nm에서 흡광도를 측정한다.

표 5는 본 발명에 따른 펩타이드 유도체 화합물 (Palm-Gly-Pro-Hyp)의 콜라겐합성 개선효과의 측정결과이다.

농도(%)	0.0008	0.0004	0.0002	0.0001
Palm-Gly-Pro-Hyp(O.D.)	3.243	3.180	2.760	2.627
Gly-Pro-Hyp(O.D.)	2.600	2.410	2.300	2.260
Palm-Gly-Pro-Hyp(%)	161.34	158.21	137.31	130.70
Gly-Pro-Hyp(%)	129.35	119.90	114.43	112.44

도 2는 본 발명에 따른 펩타이드 유도체 화합물 (Palm-Gly-Pro-Hyp)의 콜라겐합성 개선효과의 측정결과를 도시한 것이다.

표 5 및 도 2를 참조하면, 상기 실시예 1에 따른 방법으로 제조한 펩타이드 유도체 화합물인 Palm-Gly-Pro-Hyp 는 컨트롤 화합물인 Gly-Pro-Hyp 에 비해 우수한 콜라겐합성 효과를 나타냄을 알 수 있다.

<실시예 8> 화장품 조성물의 안전성 시험 (인체 첩포 시험)

본 발명에 따른 펩타이드 유도체를 함유한 화장품 조성물의 피부 자극 정도를 알아보기 위하여, 상기 실시예 3 내지 5에 따라 제조된 화장품 조성물에 대한 피부 첩포시험을 실시하였다. 피험자는 20~50세의 시험 부위에 피부 질환이 없는 사람으로 선정하였으며 총 15명에게 실시하였다. 우선, 첩포 부위인 상박부를 70% 에탄올로 닦아내고 건조시킨 후, 핀챔버(fin chamber)를 사용하여 바셀린을 블랭크로, 상기 실시예 3의 유연 화장수, 상기 실시예 4의 영양 로션, 또는 상기 실시예 5의 영양 크림을 각각 0.02g 씩 가하였다. 각각의 상기 화장품 조성물을 인체 상박부에 24시간 첩포하고, 첩포 제거 후 1시간 이내에 피부반응을 검사하고, 다음날(48시간) 다시 검사하였다. 피부 반응 판정은 표6의 검사기준에 의해 판정되었고, 피부 자극 유발 가능성의 평가는 다음 계산식으로부터 계산된 평균반응률로 수치화되어 이루어졌다.

평균반응률(%) = [Σ(24시간 후 반응 피검자수 × 점수) + Σ(48시간 후 반응 피검자수 × 점수)] × 100 / (총검사횟수 × 최대점수 × 전체피검자수)

표 6은 인체 첩포시험의 검사 기준을 기술한 것이다.

피부반응	점수
-	0	반응없음
±	1	미약한 양성 반응 (홍반)
+	2	양성 반응 (홍반)
++	3	강한 양성 반응 (홍반, 부종)
+++	4	심한 양성 반응 (홍반, 부종, 수포)

평균반응률은 다음과 같이 계산하였다.

[(15명×0점+0명×1점+0명×2점+0명×3점+0명×4점)+(15명×0점+0명×1점+0명×2점+0명×3점+0명×4점)]×100/(2회×4점×15명)= 0%

표 7은 실시예 3 내지 5에 따른 화장품 조성물들에 대한 피부 첩포시험 결과를 나타낸 것이다.

시험물질	24시간 후 반응 있는 피검자수(명)					48시간 후 반응 있는 피검자수(명)					평균반응률 (%)
시험물질	0	1	2	3	4	0	1	2	3	4	평균반응률 (%)
실시예 3	15	0	0	0	0	15	0	0	0	0	0
실시예 4	15	0	0	0	0	15	0	0	0	0	0
실시예 5	15	0	0	0	0	15	0	0	0	0	0

표 7를 참조하면, 실시예 3 내지 5에 따른 조성물들은 모두 무자극 범위에 속하여 인체에 안전한 물질임을 확인하였다.

<실시예 9> 화장품 조성물의 안정성 시험

본 발명에 따른 펩타이드 유도체를 함유한 화장품 조성물에 대한 안정성 정도를 알아보고자, 상기 실시예 3 내지 5에 따른 제형예들에 대한 안정성 시험을 실시하였다. 구체적으로, 상온(25℃), 냉장(4℃), 또는 고온(40℃)의 항온조에 각각 3달간 방치한 후 그 외관변화를 관찰하여, 제형의 분리정도에 따라 ‘0’(안정), ‘±’(약간불안정), ‘+’(불안정)로 표시하였다.

표 8은 실시예 3 내지 5에 따른 제형예들에 대한 안정성 시험 결과를 표시한 것이다.

시험물질	보관온도(℃)
시험물질	4 ℃	25 ℃	40 ℃
실시예 3	0	0	0
실시예 4	0	0	0
실시예 5	0	0	0

표 8을 참조하면, 실시예 3 내지 5의 화장품 조성물들은 상온, 냉장, 고온에서 모두 안정한 물질로서 존재함을 확인하였다.

<실시예 10> 화장품 조성물의 피부주름 개선 평가시험

본 발명에 따른 펩타이드 유도체를 함유한 조성물의 피부주름 개선정도를 알아보기 위하여, 실시예 4 및 5의 화장품 조성물들에 대하여 30세 이상의 건강한 여성 15명에 대하여 임상효능평가를 실시하였다.

제품사용에 따른 주름개선 효과를 Visiometer를 이용하여 분석하였다. 이를 위하여, 0 주, 4 주, 8 주 경과시 지정된 눈가 부위의 모사판을 제작하였다. 상기 모사판 제작은 항온 항습 (22±2℃, 40~60% 습도) 조건에서 제작하였다. 피험자들은 방문 후 지급된 세안제로 세안한 다음 30분간 항온 항습 (22±2℃, 40%~60% 습도) 조건에서 안정을 취하도록 하였다. 이어서, 실리콘 용액 B(기제) 및 C(촉매제)를 이용하여 모사판을 제작하였다.

준비된 모사판은 Visiometer (Skin-Visiometer SV 600, Courage & Khazaha, Germany)의 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 상기 모사판의 분석은 분광법의 의해 수행되며, 구체적으로 인공 광원에서 방출된 빛이 실리콘 재질을 투과하면서 생기는 빛의 세기를 Lambert & Beer's Law에 의해 분석하여 피부주름 개선정도를 측정한다. 상기 visiometer에 의한 측정 변수는 R2 로 표시되며, 이는 최대 거칠기 (Maximum Roughness) 를 나타낸다. 상기 변수의 값이 작아질수록 피부주름이 개선되어 주름의 깊이가 낮아짐을 의미하며 단위는 임의 단위(arbitary unit)이다.

표 9는 본 발명에 따른 화장품 조성물의 피부주름 개선 평가시험에서의 피부주름 개선율(%)을 표시한 것이다.

	개선율 (%)	p-value
4주 후	5.67	0.11248
8주 후	9.28	0.00097*

*; p<0.05

도 3은 화장품 조성물의 피부주름 개선 평가시험의 주차별 측정결과를 도시한 것이다.

표 9, 및 도 3을 참조하면, 사용 8 주 후의 평가에서 상기 화장품 조성물이 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)으로 피부주름 개선에 도움을 주는 것으로 확인되었다.

<실시예 11> 화장품 조성물의 피부탄력 개선 평가시험

본 발명에 따른 화장품 조성물에 대하여 피부탄력 개선정도를 알아보기 위하여, 상기 실시예 4 및 5의 화장품 조성물들에 대하여 30세 이상의 건강한 여성 15명에 대하여 임상효능평가를 실시하였다.

피부 탄력은 얼굴의 눈꼬리(eyelid) 부위의 탄력정도를 Cutometer MPA580 (Courage and Khazaka, Koln, Germany)를 사용하여 측정하였다. 피험자의 얼굴 전체를 물로 세안한 다음 항온항습실에서 30분간 대기하도록 하였다. 이때 항온항습 조건을 유지하였다. 상기 측정장치는 측정시간 동안 지속적인 음압을 가하여 프로브(probe) 속으로 피부가 빨려 들어가도록 한 후, 상기 음압이 제거되면 피부는 원래의 모습으로 돌아가는 원리를 이용하는 것이다.

구체적인 측정방법으로서, 상기 측정기기에 연결된 2 mm 직경의 프로브를 피험자의 제모 된 피부에 밀착시키고 비침습적인 방법으로 측정하였다. 상기 프로브의 입구를 통해서 피부표면에 음압이 가해지면 그 내부가 진공상태로 변하게 된다. 이때 피부표면은 상기 프로브의 입구로 당겨져 들어가게 된다. (최대 3.0 mm) 당겨져 들어간 피부의 길이는 피부를 통과할 수 있는 광학시스템에 의하여 측정된다. 이때 사용되는 빛은 적외선이며 피부를 통과하면서 감소되는 빛의 세기와 피부를 통과하지 않는 빛의 세기의 비율을 통하여 피부가 얼마만큼 프로브 속으로 당겨졌는지를 측정한다. 당겨진 피부에 근접한 피부는 프로브의 외부보호링에 의해 위치가 고정된다. 이때 근접한 피부에 가해지는 압력은 50g/cm² 또는 2×10³N/m²이었다. 측정 조건은 mode 1을 사용하였다. Mode 1 조건은 일정하게 유지되는 450 mbar의 음압, Suction Time 2초, Relaxation Time 2초로 이루어지며, 연속적으로 3번 측정한 뒤 산술평균을 구하여 측정결과를 얻었다.

도 4는 화장품 조성물의 피부탄력 개선 평가시험의 스트레인-시간 곡선을 도시한 것이다.

사용된 측정변수는 전체 탄력 (Gross elasticity) R2 = Ua/Uf 이며, 이는 1.0에 가까울수록 더욱 탄성적인 곡선이 형성됨을 의미한다.

표 10은 피부탄력 개선율(%)을 표시한 것이다.

	개선율 (%)	p-value
4주 후	18.22	0.00019*
8주 후	23.51	0.00009*

*; p<0.05

도 5는 화장품 조성물의 피부탄력 개선 평가시험의 주차별 측정결과를 도시한 것이다.

표 10 및 도 5를 참조하면, 본 발명에 따른 화장품 조성물은 피험자들에 대한 적용 8주 후 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)으로 피부탄력 개선에 도움을 주는 것으로 확인되었다.

<실시예 12> 화장품 조성물의 피부 리프팅 개선 평가시험

본 발명에 따른 화장품 조성물의 피부 리프팅 개선 정도를 알아보기 위하여, 상기 실시예 4 및 5의 화장품 조성물들에 대하여 30세 이상의 건강한 여성 15명에 대한 임상효능평가를 실시하였다.

항온항습실에서 30분 경과 후의 시험제품의 피부 리프팅 효과를 측정하기 위하여 피험자의 얼굴부위에서 측정기기를 사용하여 영상을 얻는다. 상기 측정기기는 Moire 방법을 응용한 측정기기 및 조명세트와 고해상도 디지털 카메라(Olympus E-330, Japan)를 이용하여 실내 조명의 밝기와 동일한 조건에서 화상사진을 촬영하는 측정장치이다. 본 실험에서는, 표준화를 위하여 촬영 조건(측정 방향 및 위치)을 고정한 상태로 측정하였다. 특히, 피험자의 시험부위 중에서도 피부의 처짐 현상이 두드러지게 관찰될 수 있는 입가 부위를 시험부위로 선정하였다.

구체적인 해석방법으로서, 상기 측정기기를 통하여 촬영된 영상에서 입술이 끝나는 부위에서 수평선을 그리고, 입술이 끝나는 부위와 만나는 등고선의 수직교차선(접선)을 그린 후 이들이 이루는 각도(R)를 이미지 분석 프로그램(ImagePro, USA)을 이용하여 분석한다. Moire 이미지 판정 기준은 입꼬리선에 대해 등고선의 방향이 평행할수록 피부탄력이 좋고, 등고선이 아래로 늘어질수록 피부탄력이 나쁨을 나타낸다. 이 경우, 입가 피부 처짐이 심할수록 R 값이 커지는 특성을 갖는다.

도 6은 화장품 조성물의 피부 리프팅 개선 평가시험의 피부 리프팅 측정 사진이다.

표 11은 피부 리프팅 개선율(%)을 표시한 것이다.

	개선율 (%)	p-value
4주 후	4.50	0.00339*
8주 후	7.56	0.00083*

*; p<0.05

도 7은 화장품 조성물의 피부 리프팅 개선 평가시험의 주차별 측정결과를 도시한 것이다.

표 11 및 도 7을 참조하면, 본 발명에 따른 화장품 조성물은 8주 후에 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)으로 피부 리프팅 개선에 도움을 주는 것으로 확인되었다.

이에 더하여, 본 발명에 따른 화장품 조성물은 전문의에 의한 피부 안전성 평가 및 피험자들에 대한 설문평가에서 피부 이상반응과 관련된 증상이 보고되지 않았는바, 화장품으로서 사용될 경우 피부에 자극을 주지 않는 안전한 조성물인 것으로 확인되었다.

도 1은 본 발명에 따른 팔미토일트리펩타이드 화합물 (Palm-Gly-Pro-Hyp)에 대한 MTT 분석 (MTT assay) 결과를 도시한 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 팔미토일트리펩타이드 화합물 (Palm-Gly-Pro-Hyp)의 콜라겐합성 개선효과의 측정결과를 도시한 것이다.

Claims

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하기 구조식 I 또는 팔미토일-글리시닐-프롤리닐-히드록시프롤린 (Palmitoyl-Glycinyl-Prolinyl-Hydroxyproline; Palm-Gly-Pro-Hyp)으로 표시되는 신규한 팔미토일트리펩타이드 화합물을 0.0001 내지 0.1 중량% 함유하는 주름개선을 위한 화장품 조성물.

[구조식 I]
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