KR102035275B1 - 피부투과와 효능이 개선된 화장품 소재용 신규 펩타이드 유도체 개발 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부 주름개선 활성을 나타내는 지방산-펩타이드와 효율적인 합성 방법을 제공한다. 본 발명의 펩타이드는 피부 세포 내에서 MMP-1 발현을 억제, 콜라겐 생성을 촉진하여 피부 주름개선 활성을 나타내며 피부세포의 증식을 촉진하는 것으로 확인되었다, 그리고 주름개선임상 시험에서 대조군에 비해 우수한 개선효과를 확인하였으며 또한 본 발명의 펩타이드는 안정성 및 피부자극에서 우수하다.또한 지방산-펩타이드는 일반 펩타이드와 비교하여 높은 피부투과도를 보인다. 본 발명은 지방산-펩타이드를 포함하는 피부 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

Description

피부투과와 효능이 개선된 화장품 소재용 신규 펩타이드 유도체 개발{DEVELOPMENT OF NEW PEPTIDE DERIVATIVE FOR COSMETIC MATERIAL WITH ENHANCED SKIN PERMEABILITY}

본 발명은 피부투과와 효능이 개선된 화장품 소재용 신규 펩타이드 유도체 개발에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피부 투과도가 향상되고 주름 개선효과가 향상된 펩타이드 유도체 및 이를 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체에서 가장 큰 조직으로 햇빛이나 물리, 화학적 자극으로부터 신체 내부를 보호해 주는 기능을 하며 이는 인간의 생명유지를 위해 절대적으로 필요하며 끊임없이 재생되어 항상성을 유지시킨다. 피부는 바깥쪽으로부터 표피, 진피, 피하지방 순서대로 구성되어 있으며 가장 얇은 조직인 표피는 피부의 보습과 보호를 담당하는 중요한 기능을 담당하고 있으며 수분 손실, 손상과 세균 침입 등을 방지하는 역할을 맡고 있다. 피부는 신체를 전부 감싸고 있는 조직으로 다양한 기능을 가지고 있다. 신체 내부와 외부 사이에서 장벽 기능을 가지고 있으므로 랑게르한스섬에 의한 면역 체계를 갖추고 있고 표피에 의한 수분 조절기능을 가지고 있음. 또한, 적절한 햇빛으로 비타민 D를 합성하고 지질의 저장고와 땀샘으로의 배설 기능도 수행한다. 건강한 피부에서의 정상적인 분화과정에 의해 생성된 각질층은 피부의 보습을 유지하고 외부환경의 자극으로부터 보호하는 기능을 가지고 있다. 이러한 기능을 피부 장벽 기능이라 하며 표피의 가장 중요한 역할이라고 할 수 있다.

화장료의 가장 큰 관심 분야 중 하나는 노화와 관련된 주름, 색소침착, 탄력감소, 피부건조화, 탈모, 모발의 윤기 부족 등이다. 피부는 노화를 통해 다양한 변화를 맞게 된다. 먼저 피부의 구성 성분인 표피, 진피 및 피하조직의 두께가 얇아지고 피부에 탄력을 주는 세포외 기질(Extracellular matrix; ECM) 성분이 변화하게 되는데 그 중 세포외 기질의 70~80%를 차지하는 콜라겐은 나이가 들면서 그 생성이 급격하게 저하되어 주름 생성과 밀접한 관계를 가지게 되고, 피부결합조직을 이루고 있는 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 프로티오글리칸(proteoglycans), 글루코스아미노글리칸(glucosaminoglycan), 라미닌(laminin), 파이브로넥틴(fibronectin) 등은 산화되어 그 기능을 잃어버림으로써 피부가 탄력을 잃고 주름이 과도하게 형성되면서 노인성 피부로 변화되어 간다.

세포외 기질의 결합조직섬유에는 아교섬유(교원섬유, collagen fiber), 세망섬유(reticular fiber), 탄력섬유(탄성섬유, elastic fiber)가 있으며, 이 중 피부결합조직의 70% 정도를 차지하고 있는 콜라겐은 피부의 섬유아세포(fibroblast)에서 대부분 형성된다. 나이가 들면서 피부결합조직 내의 콜라겐 함량이 줄어드는데 이는 콜라겐 합성의 저하와 분해의 촉진에 의한 것이다. 따라서 콜라겐 생합성의 저하와 콜라겐 분해 촉진은 피부주름 형성의 가장 큰 원인이라 할 수 있다.

콜라겐 생합성 과정은 전사 수준(Transcription level)과 해독 후 수준(Post-translation level)에 관여하는 많은 인자(Factor)들에 의해 조절을 받아 변화를 일으키며, 콜라겐 분해는 자외선 등에 의해 콜라겐을 분해하는 콜라게나아제(Collagenase)와 같은 기질금속단백질 분해효소들(Matrix metalloproteases; MMP)의 발현의 촉진으로 콜라겐 분해가 촉진되어 콜라겐 함량이 줄어든다. 아울러 외부 환경에 의해 콜라겐의 변형이 가속화되면서 피부는 주름이 많아지고 깊어지게 된다. 결과적으로 피부노화 현상은 세포의 비균질화, 엘라스틴의 소실, 콜라겐의 파괴, 콜라겐 합성의 감소 및 지연 등에 의해 나타난다. 따라서 피부노화 현상은 피부 표피에서도 일어나지만 이보다는 진피에서 일어나는 현상이라고 볼 수 있다.

이러한 피부노화에 대한 문제점을 해결하기 위한 다양한 화장료 조성물이 연구되고 있고, 피부의 주름개선 효과는 일부에서 가시적인 성과를 보이고 있다. 예컨대, 피부주름 및 기미, 색소침착 개선을 위해 널리 사용되고 있는 레티노이드류, 그 중에서도 레티놀(retinol)에 대한 피부주름 제거 임상 결과들이 다양하게 보고되고 있고, 레티놀을 함유한 화장료는 일광에 의해 형성된 피부주름살이나 피부처짐, 탄력감소 등을 효과적으로 개선하였다.

최근 들어 인간의 수명이 길어지고 삶의 수준이 향상됨에 따라, 건강하고 아름다워지고자 하는 사람들의 관심이 매우 증대 되고 있으며 이는 피부노화와 관련된 기능성화장품 및 기능성식품, 미용분야의 시장이 최근에 급격히 증가하는 것으로 잘 알 수 있다.

피부노화는 외인성 노화(태양광선 등 외부자극에 의해 일어나는 노화)와 내인성 노화(나이의 증가에 따른 자연적 노화)로 나뉘어 왔으며 노화된 피부는 주름살이 증가하며, 탄력성이 떨어짐. 그러나 이러한 피부노화 증상의 발생 원인의 이해와 예방, 치료기술은 아직 개발되지 못하고 있는 상황이다.

결과적으로 피부노화 현상은 세포의 비균질화, 엘라스틴의 소실, 콜라겐의 파괴, 콜라겐 합성의 감소 및 지연 등에 의해 나타나며 따라서 피부노화 현상은 피부 표피에서도 일어나지만 이보다는 진피에서 일어나는 현상이라고 볼 수 있다.

이러한 피부노화에 대한 문제점을 해결하기 위한 다양한 화장료 조성물이 연구되고 있고, 그 중 펩타이드는 아미노산의 중합을 통해 생성되는 생체 분자이며 인체에 무해하고 특히 생체 내에서 다양한 생리활동을 조절하는 물질로 알려져 있다. 특히 펩타이드는 아미노산의 거대 조합체인 단백질에 비해 열과 pH 등에 대단히 안정하고 쉽게 활성을 잃지 않는 다는 점에서 의약, 약학 등에 널리 활용되고 있는 약물이며 화장품에서도 피부 주름개선, 주름 개선 등의 용도로 활용되고 있다. 그런데 펩타이드를 이용한 다양한 주름 개선제를 개발하기 위한 다양한 시도가 있었지만, 그 효과는 그리 크지 않았으며, 효과를 보다 극대화하기 위한 비타민 C-펩타이드 복합체, 하이드로 퀴논-펩타이드 복합체 등도 제조에 있어 어려움이 있으며, 고가이기 때문에 이용이 제한적이어서 시장에서의 적용은 그리 많지 않았다. 특히 펩타이드는 물에 용해도가 좋은 물질이며 기름에는 잘 용해되지 않기 때문에 피부 층을 통과하여 피부 내에 침투하여 생리활성 기능을 나타내기 어려운 물성을 가지고 있다.

피부는 각질층, 표피층, 진피 층 등의 다양한 층으로 겹겹이 쌓여진 겹층 구조로 형성되어 있으며 각 층들은 각각의 특성이 있어 인체를 자외선, 미생물 등의 외부의 위협으로부터 보호하고 인체의 수분이 외부로 방출되는 것을 억제하는 기능을 보인다.

하지만 이러한 피부의 구조는 피부 외부의 유용한 성분의 피부 내 침투를 막게 되어 물질의 효능의 발현을 억제하게 하는 역할을 한다. 이러한 피부 침투의 어려움에 대한 해법으로 다양한 방법들이 제안되고 개발되고 있다. 이러한 방법 중 하나는 소수성 특성을 가지고 있는 각질층을 피부 내 침투가 어려운 수용성 물질을 지용성 물질과 화학적인 결합을 통해 물질의 수용성 특징을 감소시켜 투과도를 향상시키는 방법이 있다. 이러한 방법은 피부투과도를 높이려는 물질의 특성에 따라 제조 방법이 결정된다.

펩타이드 합성을 원활히 하기 위해서는 보호기(Protecting group)가 필요한데 현재까지 다양한 특성을 가진 보호기가 개발되어 활용되고 있다. 대표적으로 많이 활용되고 있는 보호기는 Fmoc/trt-아미노산 유도체가 개발되어 몇몇 펩티드 합성에 사용되어서는 우수한 효과가 있는 것으로 보고되고 있다 그러나, Fmoc/trt-아미노산 유도체가 고체상 펩티드 합성에 우수한 효과를 나타냄에도 불구하고, 일부 Fmoc이 가지는 소수성(hydrophobicity)에 따른 낮은 용해도에 의해 난구조 펩티드 합성에서 낮은 축합 수율을 나타내었다. 이에 반하여, 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐(Nsc)은 니트로기와 설포닐기의 구조적 특성에 기인하여 아미노산의 용해도 증가와 펩티드 사슬 사이의 소수성 상호 작용(hydrophobic interaction)을 억제하는 역할을 한다. 또한 자동화 시스템 하에서 Fmoc에 비해 Nsc의 안정성이 탁월하여 긴 사슬의 펩티드 합성반응에 매우 유리한 이점을 가지고 있다.

피부노화 및 주름을 효과적으로 방지 또는 개선하기 위해서는, 효능이 정확하게 검증된 원료를 이용한 신규 주름 개선 조성물 개발이 필요하며 효능의 검증은 분자생물학적 메카니즘으로 규명되고 인체 대상 임상시험으로 검증하는 것이 중요하다.

본 발명자들은 지방산이 결합된 펩타이드 라이브러리에서 우수한 주름 개선효과를 나타내는 펩타이드 유도체를 찾기 위하여 노력한 결과, 지방산이 결합된 일부 펩타이드가 피부투과도가 개선되고 주름개선에 효과를 나타낸다는 사실을 발견하였고, 그로부터 안정성 및 피부 투과율이 우수한 펩타이드의 제조 방법을 발명하고 이를 선별함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 1종의 펩타이드와 탄소수 10 내지 20의 포화 또는 불포화 지방산이 아마이드 결합된 지방산-펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 탄소수 10 내지 20의 포화 또는 불포화 지방산은 미리스트산(Myristic acid), 스테아릭산(Stearic acid), 리놀레익산(Linoleic acid), 팔미트산(Palmitic acid) , 올레익산(Oleic acid) 및 라우르산(Lauric acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 지방산-펩타이드 복합체는 서열번호 4로 표현되는 펩타이드와 미리스트산(Myristic acid) 또는 팔미트산(Palmitic acid)이 아마이드 결합된 복합체인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 지방산-펩타이드 복합체는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 이용하여 제조된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 탄소수 1 내지 20의 직쇄 또는 가지형의 탄화수소이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 지방산-펩타이드 복합체는 MMP-1 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 지방산-펩타이드 복합체는 피부 세포 내 콜라겐 생합성을 활성화하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 지방산-펩타이드 복합체는 프란츠 확산 세포(Franz diffusion cell)를 이용한 피부 투과도(실험 24시간 경과 기준)가 0.01mg/㎖ 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 1종의 펩타이드와 탄소수 10 내지 20의 포화 또는 불포화 지방산이 아마이드 결합된 지방산-펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미하며, 지방산-펩타이드는 펩타이드의 N-말단에 지방산을 결합시킨 형태를 말한다.

본 발명자들은 지방산이 결합된 펩타이드 라이브러리에서 주름개선효과를 나타내는 펩타이드를 찾기 위하여 노력한 결과, 지방산이 결합된 일부 펩타이드가 MMP-1 단백질의 발현을 억제하거나 콜라겐 생성을 촉진, 피부세포의 증식을 촉진하여 피부 주름개선에 효과를 나타낸다는 사실을 발견하였다.

본 발명자들은 N-말단에 다양한 지방산을 포함하는 다양한 펩타이드 라이브러리를 제조하고 후보 펩타이드들을 준비한 후, 후보 펩타이드들 중에서 피부투과도와 주름개선 활성이 우수한 지방산-펩타이드 복합체를 스크리닝함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 N-말단에 지방산을 결합하여 변형을 유도할 수 있다. 이러한 변형을 통해 본 발명의 펩타이드는 생체 내 투여시 안정성이 증가되어 높은 반감기를 가질 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 펩타이드의 C-말단에 아미노기(-NH2)결합하여 변형을 유도할 수 있다.

본 발명에서 상기 지방산-펩타이드 복합체는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 보호기로 이용하여 제조될 수 있다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 탄소수 1 내지 20의 직쇄 또는 가지형의 탄화수소이다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물을 보호기로 사용하여 지방산-펩타이드 복합체를 이용하는 경우 Fomc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl group)를 보호기로 이용한 경우에 비해 복합체의 수율이 현저히 높았을 뿐만 아니라, 다양한 종류의 지방산-펩타이드 복합체의 제조가 가능함을 확인하였다.

바람직하게는, 상기 화학식 1의 화합물은 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐일 수 있다.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어“안정성”은 인비보(in vivo) 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다.

본 발명에서 상기 지방산은 탄소수 10 내지 20의 포화 또는 불포화 지방산이라면 제한 없이 포함이 될 수 있으나, 바람직하게는 탄소수 10 내지 20의 포화 또는 불포화 지방산은 미리스트산(Myristic acid), 스테아릭산(Stearic acid), 리놀레익산(Linoleic acid), 팔미트산(Palmitic acid) , 올레익산(Oleic acid) 및 라우르산(Lauric acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 1 내지 5로 표시되는 펩타이드는 상기 지방산과 아마이드 결합을 통해 복합체를 형성하면 피부 주름 개선효과가 현저히 상승하는 것으로 확인이 되었다.

상기 서열번호 1 내지 5로 표시되는 펩타이드 각각은 탄소수 10 내지 20의 지방산 중에서 특정 종류의 지방산과 결합하여 복합체를 형성했을 때 특히 더 향상된 주름개선 효과를 나타내는 것으로 확인이 되었다.

구체적으로, 상기 서열번호 1의 펩타이드는 미리스트산 또는 스테아릭산과 결합했을 때, 상기 서열번호 2의 펩타이드는 올레익산, 리놀레익산 또는 팔미트산과 결합했을 때, 상기 서열번호 3의 펩타이드는 라우르산, 올레익산 또는 스테아릭산과 결합했을 때, 상기 서열번호 4의 펩타이드는 스테아릭산, 미리스트산 또는 팔미트산과 결합했을 때, 및 상기 서열번호 5의 펩타이드는 라우르산 또는 미리스트산과 결합했을 때 주름개선 효과의 상승작용이 특히 더 현저한 것으로 확인되었다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 지방산-펩타이드 복합체는 사람 유래의 세포에 독성을 나타내지 않아 피부 주름개선용 화장료 조성물로서 활용도가 매우 높다. 본 발명에 따르면, 100 ng/ml-1000 μg/ml의 농도로 HaCat 세포 및 HDF 세포에 지방산-펩타이드를 처리한 결과, 현저한 세포 독성은 측정되지 않았으며 육안으로 세포의 형태를 확인하였을 때도 큰 변화는 관찰되지 않았다(도 6).

본 발명에 따르면, 지방산-펩타이드 복합체는 50℃ 온도에서도 우수한 열안정성을 나타내며, 일광조건에서도 안정함을 확인하였다(도 4 및 5). 따라서, 본 발명의 지방산-펩타이드 복합체는 화장품과 같은 장기간 저장이 요구되는 제품에 유리하게 적용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 지방산-펩타이드 복합체는 MMP-1 발현 저해능을 갖는다. 본 발명에 따르면, 피부 진피 세포(Fibroblast)에 UV 광선을 조사하여 MMP-1 발현을 촉진 시킨 후 본 발명의 지방산-펩타이드 복합체를 처리하고 배양시킨 후 MMP-1 발현 저해능을 비교한 결과, 지방산-펩타이드 복합체를 처리한 경우 대조군에 비해 MMP-1 발현이 억제되는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 상기 지방산-펩타이드 복합체를 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물의 주름 개선효과를 임상적으로 평가해 본 결과 본 발명의 조성물이 처방된 크림은 무처방 크림을 비교했을 때 눈가 주름 개선 효능이 현저히 우수함을 확인할 수 있었다(표 5 및 도 7).

또한, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물의 경우, 다양한 제형을 이용하여 피부 주름개선에 매우 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 지방산-펩타이드 복합체는 지방산과 결합하지 않은 펩타이드에 비해 낮은 HLB(hydrophlic Lipophilic balance)를 나타내기 때문에 피부 침투율이 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 조성물을 국소적으로 피부에 도포하는 경우 높은 피부 침투율로 인해 피부 주름개선 효과가 극대화 될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 상기 지방산-펩타이드 복합체는 프란츠 확산 세포(Franz diffusion cell)를 이용한 피부 투과도(실험 24시간 경과 기준)가 0.01mg/㎖ 이상일 수 있으며, 바람직하게는 0.05mg/ml 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 지방산-펩타이드 복합체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 젤 타입, 스킨 타입, 크림 타입, 연고 타입 등의 화장료 조성물에 적용될 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 상기의 조성물은 그것의 타입에 따라 적절한 통상의 연화제, 유화제, 증점제 또는 당업계에 공지되어 있는 기타 물질들을 첨가하여, 공지의 방법에 의해 적절하게 제조될 수 있다.

상기 젤 타입 조성물은 트리메틸올프로판, 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리세린 등의 연화제, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 이소세틱알콜 등의 용매, 정제주 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 스킨 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 부틸렌 글라이콜, 글리세린, 알란토인, 메틸 파라벤, 이디티에이-2-소디움, 잔탄검, 디메티콘, 폴리 에틸렌 글라이콜-60 하이드로제네이트 카스톨 오일, 폴리 소르베이트 60 및 정제수 등을 첨가하여 제조 할 수 있다.

상기 크림 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 레시틴, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 소프파티질세린, 소프파티딜이노시톨 등의 리피드, 이들의 유도체, 글리세릴 스테아레이트, 소르비탄 팔미테이트, 소리비탄 스테아레이트 등의 유화제, 아보카도 오일, 살구 오일, 바바수 오일, 유리지치 오일, 동백 오일 등의 천연 지방 또는 오일, 프로필렌글리콜 등의 용매 및 정제수 등을 첨가하여 제조 할 수 있다.

상기 연고 타입 조성물은 연화제, 유화제 및 마이크로크리스탈린납, 파라핀, 세레신, 밀납, 경납, 바세린 등의 왁스를 첨가하여 제조할 수 있다.

또한 본 발명은 활성 성분으로서 상기 지방산-펩타이드 복합체와 하나 이상의 화장료적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제제로 제공될 수 있다.

따라서, 상기 제제에는 화장료적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 또는 이들의 조합이 필요에 따라 포함될 수 있다. 이들 제제는 생물체 내로 활성 성분의 투여를 용이하게 한다.

본 발명의 지방산-펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 피부 투과도가 매우 우수하며, MMP-1 발현을 억제, 피부세포 내 콜라겐 생성을 촉진, 피부세포의 증식을 촉진시켜 피부 주름개선에 우수한 효과를 나타낸다.

도 1은 합성된 지방산-펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다(도 1a: Palmitoyl-RKDVY 복합체, 도 1b: Palmitoyl-GPQGPQ 복합체, 도 1c: Myristoyl-GPQGPQ 복합체, 도 1d: Lauryl-FVAPDP 복합체, 도 1e:Myristoyl-AFPG).
도 2는 합성된 지방산-펩타이드 복합체 5종의 세포 내 MMP-1 발현 저해 실험의 결과에 대한 그래프이다.
도 3은 합성된 지방산-펩타이드 복합체 4종의 세포 내 콜라겐 생성 촉진 실험의 결과에 대한 그래프이다.
도 4는 지방산-펩타이드 복합체의 광 안정성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 지방산-펩타이드 복합체의 열 안정성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 피부세포 2종(HDF, HACAT)에 지방산-펩타이드 복합체를 처리한 후, 피부 세포 독성을 확인하기 위한 MTT assay 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 지방산-펩타이드 복합체와 펩타이드의 피부투과도 비교 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 임상시험을 통해 지방산-펩타이드와 지방산의 주름개선 임상 효능을 비교한 그래프이다(좌: 대조군, 우:실험군, A: 실험군, B: 대조군).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1

지방산- 펩타이드 라이브러리의 합성

지방산-펩타이드 라이브러리를 합성하기 위해 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐를 보호기로 이용한 19개의 nsc-아미노산(nsc-Ala, nsc-Arg(pbf), nsc-Asp(OtBu), nsc-Asn(trt), nsc-Gly, nsc-Glu(OtBu), nsc-Gln(trt), nsc-His(trt), nsc-Ser(tBu), nsc-Thr(tBu), nsc-Tyr(tBu), nsc-Trp(Boc), nsc-Leu, nsc-Ile, nsc-Val, nsc-Phe, nsc-Met, nsc-Lys(Boc), nsc-Pro)이 부착된 클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin: CTL resin, Novabiochem Cat No. 01-64-0021)과 Fomc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl group)를 보호기로 이용한 19개의 Fmoc-아미노산(Fmoc-Ala, Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Asn(trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Gln(trt), Fmoc-His(trt), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Leu, Fmoc-Ile, Fmoc-Val, Fmoc-Phe, Fmoc-Met, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Pro)이 부착된 클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin: CTL resin, Novabiochem Cat No. 01-64-0021), Lauryl chloride oleioyl chloride, linoleoyl chloride, Myristoyl chloride, Palmitoyl chloride, Stearic chloride 총 6종의 지방산 클로라이드를 96웰 테프론 반응기에 시리즈 별로 각 19 라인에 50 mg을 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 1ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름아마이드(DMF) 1ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 제조된 지방산-펩티딜 레진은 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P2O5하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조하였다. 제조된 레진에 탈루용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid: TFA) 81.5%, 증류수 5%, 티오아니졸(Thioanisole) 5%, 페놀 5%, EDT(1,2-Ethanedithiol) 2.5% 및 TIS(Triisopropylsilane) 1% 포함] 30mL을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 얼음 수조 안에서 1 시간 반응을 유지하였다. 레진을 여과하고, 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 이 후 지방산-펩타이드 복합체를 수득하였다.

합성 및 정제 결과 서로 다른 서열의 펩타이드와 지방산이 결합된 지방산-펩타이드 복합체 종을 얻었다(표 1).

* 서열번호 1: AFPG

* 서열번호 2: RKDVY

* 서열번호 3: EEMQRR

* 서열번호 4: GPQGPQ

* 서열번호 5: FVAPDP

합성된 지방산-펩타이드 복합체의 수율은 펩타이드의 서열에 따른 물성 차에 의해 수율에서도 큰 차이를 보였다(4% 이하의 수율은 별도로 표기하지 않았다). 특히 Fmoc, NSC 보호기와 지방산의 종류에 따라 합성 자체가 불가한 경우도 존재하였다. 하기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이 대체적으로 2-(4-니트로페닐)설포닐에톡시카르보닐(NSC)를 보호기로 이용하여 제조한 경우에 지방산-펩타이드 복합체의 수율이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

지방산과 펩타이드의 복합체 제조 시 수율은 펩타이드의 길이와 극성도, 지방산의 길이와 비극성도 사이의 상관관계는 크지 않았고 3차원 구조에 의한 입체적 방해(Steric hindrance) 등 의해 결정된 것으로 예측된다. 컬럼 분리 시 elution 시간도 역시 상이하나 25~35분대에서 피크를 확인할 수 있었다(도 1).

실시예 2

지방산- 펩타이드의 피부주름 개선 효과 확인

지방산-펩타이드의 피부 주름 개선효과를 확인하기 위해 표 1에서 제조한 지방산-펩타이드 복합체를 하기와 같이 생체 외(In vitro) 콜라게나아제(collagenase) 활성 제해 실험을 진행하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

콜라게나아제(collagenase) 활성 저해 시험 방법은 콜라겐을 인산 완충액에 녹여 준비한다(100ppm). 이때 양성 대조군으로 아데노신을 같은 농도로 준비한다. 25mM 시트르산을 400㎕/tube 첨가하여 반응을 종료시킨다. 이후 에틸아세테이트를 1.5㎖/tube 첨가하고, 볼텍싱(vortexing)한 후 상등액을 취하여 황산나트륨 150mg/ep-tube에 옮기고, 볼텍싱 후 원심분리(10,000rpm, 3분)한다. 상등액 300㎕/ep-tube를 취하여 석영 96well 플레이트에 옮긴 후 320nm에서 흡광도를 측정한다.

측정 결과 지방산-펩타이드 복합체는 지방산이 결합되지 않은 펩타이드와 대조군인 아데노신에 비해 우수한 콜라게나제 억제능을 나타내었다.

표 2를 참고하면, 서열번호 1 내지 5의 펩타이드와 지방산이 결합된 복합체들 중에 일부 복합체에서만 지방산과 결합되지 않은 펩타이드보다 우수한 콜라게나제 저해능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

즉, 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 각각은 특정 지방산과 복합체를 형성했을 때에만 주름개선 효과에 현저한 향상을 나타내는 것으로 확인이 되었으며, 이들 이외의 다른 지방산과 복합체를 형성했을 때에는 각각의 펩타이드 단독 처리군과 비교해 콜라게나제 저해능이 오히려 저하되기도 하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3:

MMP -1 (Matrix Metalloproteinase - 1)활성 저해 실험

콜라게나제 억제능 실험을 통해 선별된 5종의 조합을 MMP-1활성 저해능 시험을 진행하였다.

사람 진피섬유아세포 Human dermal fibroblst(HDF) 세포는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's media, Sigma)에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, Sigma)을 첨가한 배지로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24-웰 플레이트에 2 X 10⁵ cells/well의 농도로 세포를 배양하고 세포의 부착을 확인한 뒤, 대조군에는 아무것도 처리하지 않고 용매만 넣었으며, 디쉬에는 선별된 5종의 실험군과 대조군으로 레티놀을 10ug/ml의 농도가 되도록 처리를 하였다. 각각의 디쉬에 시험물질을 가한 뒤 2일 동안 배양하였다. 2일 뒤, 배지를 채취하여 Matrix Metalloproteinase-1(MMP-1),Human,biotrak,ELISA kit (GE healthcare RPN2610)을 통해 MMP-1의 저해능을 측정하였다.

5종의 실험군을 농도별로 처리한 뒤 MMP-1 억제효과를 측정하였다. 멜라닌의 양이 대부분의 실험군에서 대조군인 레티놀에 비해 줄어드는 것을 확인하였다(도 2). 이러한 결과로부터 피부에 MMP-1생성을 유발하는 UV가 요인으로 적용되었을 때, 지방산-펩타이드 복합체의 경우 세포 내 침투가 용이하여 MMP-1생성을 저해하여 피부의 주름을 억제 할 수 있을 것으로 사료된다.

실시예 4

세포 내 collgen 생성능 시험

MMP-1 저해능 시험에서 선별된 3종의 지방산-펩타이드 복합체에 대해 세포 내 collagen 생성능 시험을 진행하였다. 시험에 사용할 사람 진피섬유아세포 Human dermal fibroblst(HDF) 세포는 Medium 106 (cascade biologics, M-106-500) 에 1X LSGS(Low Serum Growth Supplement, cascade biologics S-003-10)을 첨가한 배지로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24-웰 플레이트에 1X 10⁵ cells/well의 농도로 세포를 배양하고 세포의 부착을 확인한 뒤, 대조군에는 아무것도 처리하지 않고 용매만 넣었으며, 디쉬에는 3종의 실험군과 대조군으로 TGF를 10μg/ml의 농도가 되도록 처리를 하였다. 각각의 디쉬에 시험물질을 가한 뒤 2일 동안 배양하였다. 2일 뒤, 배지를 채취하여) Procollagen Type I C-peptide(이하 PIP) EIA kit (takara MK101)을 통해 Collagen 생성을 측정하였다.

3 종의 실험군을 농도별로 처리한 뒤 collagen 생성률을 측정하였다. 콜라겐의 양이 대부분의 실험군에서 대조군에 비해 증가하는 것을 확인하였다(도 3). 이러한 결과로부터 지방산-펩타이드 복합체가 collagen 생성을 크게 증가시켜 피부의 주름을 억제할 수 있을 것으로 사료된다.

실시예 5

피부 주름 개선 조성물의 안정성 확인 실험

본 발명의 지방산-펩타이드 복합체의 열과 광안정성을 확인하기 위하여, 주름 개선 조성물이 10 mg/mL이 되도록 조성물을 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액에 용해하여 유리 바이알에 분주하여 넣은 후 50℃ 에서 7, 14, 21, 28, 35, 42 및 60일 보관하며 열에 의한 조성물 내 펩타이드 성분의 손실을 측정하고 동일한 방법으로 일광 조건에서 안정성 여부를 측정하였다.열에 의한 펩타이드 손실을 측정하고 일광 조건에서 안정성 여부를 측정한 결과, 60일까지 단지 10% 미만의 펩타이드 손실을 나타내어 열 및 보관기간에 있어 높은 안정성을 갖는다는 것을 확인하였다(도 4 및 5).

실시예 6

세포독성, 재생능 실험

본 발명의 지방산-펩타이드 복합체가 각질세포에 독성을 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, 세포 독성, 재생능 평가를 MTT assay를 이용하여 측정하였다. HACAT세포와 HDF세포를 24 well plate에 각 well당 4 X 10⁴ cells/24well의 세포수가 되도록 seeding 한 후 24h 동안 37℃, 5% CO2조건으로 항온 배양하였다. PBS로 2회 세척 후 배양 후 합성 지방산-펩타이드 복합체를 농도별(1mg ~ 1ug/mL)로 처리하여 24h 동안 항온 배양하였다. 배양 후 MTT 0.5% in DPBS를 배양배지와 1:9(v/v)로 혼합하여 첨가한 후 2h 동안 CO2 incubator에서 배양한 후 생성된 formazan을 DMSO에 녹여 ELISA를 이용하여 570 nm에서 측정하였다. 도 6에서 보는 바와 같이, 각질세포주의 일종인 HaCat 세포, 섬유아세포의 일종인 HDF 세포에 대하여, 저농도에서 고농도까지 투여한 조성물에 의한 세포수의 감소는 관찰되지 않았으며, 세포들의 증식에 도움을 주며 세포의 현미경적인 관찰에서도 별다른 변화가 관찰되지 않았다

이를 통해 본 발명의 지방산-펩타이드는 피부 관련 세포에 독성이 전혀 없으며 피부세포 증식을 촉진함을 알 수 있으며, 이로써 본 주름 개선 조성물을 피부에 처리하여도 큰 영향을 끼치지 않으리라는 것을 예측할 수 있다.

실시예 7

지방산- 펩타이드의 피부 투과도 향상 확인

지방산-펩타이드의 피부 투과도 향상을 확인하기 위해 인체의 표피 층(Epidermis)을 대상으로 하여 하기와 같이 프란츠 확산 세포(Franz diffusion cell)를 이용한 피부 투과도 비교 실험을 실시하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

[피부 투과도 실험 방법]

1. 프란츠 확산 세포(Franz diffusion cell)의 수용 챔버(receptor chamber)에 인산 완충용액을 6.5㎖ 채우고, 각질층이 위로 향하도록 도너 챔버(donor chamber)와 수용 챔버(receptor chamber) 사이에 인체 사체의 피부(cadaver)를 고정시킨다. 사용한 커대버(cadaver)로는 한스바이오메드(주)의 epidermis skin을 활용하였다.

2. 도너 챔버(Donor chamber)에는 실험군으로 지방산-펩타이드 복합체와 비교군으로 일반 펩타이드의 농도가 1mg/㎖인 수용액, 양성 대조군으로 카페인 1mg/㎖ 농도의 수용액을 준비하여 담지하였다.

3. 실험이 진행되는 동안 35±1℃로 온도를 유지하고 계속해서 자석교반 하였다.

4. 0.5, 1, 3, 5, 8, 12 및 24시간 후 수용 챔버(receptor chamber) 내 각각의 시료를 샘플링 포트(sampling port)에서 채취하였다.

5. 시간 별 샘플 내 펩타이드, 카페인의 함량은 HPLC 분석을 통해 확인하여 피부 투과량, 피부 투과도를 구하고, 비교군과 대조군을 비교하였다.

도 7을 참조하면, 프란츠 확산 세포(Franz diffusion cell)를 이용한 피부 투과도 비교실험을 실시한 결과 지방산과 결합되지 않은 일반 펩타이드는 큰 분자량으로 피부 침투가 거의 이루어지지 않으나 지방산-펩타이드 복합체는 시간에 비례하여 프란츠 확산 세포(Franz diffusion cell)의 수용 챔버(receptor chamber)와 도너 챔버(donor chamber) 사이의 커대버(cadaver)를 통과하여 수용 챔버(receptor chamber)에서 발견되었다. 본 실시예를 통해 지방산-펩타이드는 펩타이드의 피부 각질층 투과를 원활히하여 펩타이드의 피부 흡수를 현저히 촉진시키는 것을 확인하였다.

실시예 8

임상 주름개선 시험

본 발명에 따른 지방산-펩타이드 복합체를 포함하는 화장료 조성물의 주름개선 임상 효과를 확인하기 위해 공인 인증기관에 의뢰하여 조성물이 처방된 화장품 제형의 주름 개선 효과를 확인하였다.

In vitro에서 피부 주름개선 효능이 높았던 1종의 지방산-펩타이드 복합체를 선정하여 하기 표 3에서 제시한 크림의 조성에 상기 선정된 지방산-펩타이드 복합체를 넣은 크림을 제조하였으며 만 30~50세의 성인 여성을 대상으로 수행하였다. 시험 제품은 안면 부위에 사용방법에 따라 사용하도록 하였으며, 눈가 주름 개선에 대한 효과를 평가하였다. 평가는 평가기관 내부 지침서(SOP)에 준하여 수행하였으며, 대한민국 식품의약품안전처 고시에 규정하지 않은 사항은 참고 문헌을 참조하여 수행하였다.

주름 측정은 PRIMOS(Phaseshift Rapid In-vivo Measurement Of Skin)를 이용하여 눈가 부위를 측정하였고, 시험 부위에 대한 정확한 재현성을 위해 기존 측정부위와 새로운 측정부위가 동일할 수 있도록 overlay 기능을 사용하여 측정하였다.

PRIMOS는 미세주름을 측정하기 위한 장비로 DMD(Digital Micromirror Device)에서 만들어진 미세한 줄무늬(fringe fraction)가 피부에 투영된다. 투영된 영상은 3차원 profile 정보로 나타나며 필터과정을 통해 PRIMOS프로그램(GFM, Germany) 으로 분석된다. PRIMOS 분석 변수로는 Ra와 R3z를 선정하였다.

Ra(Arithmetic roughness average)는 PRIMOS로 측정된 주름의 거칠기 단면 peak에 대한 산술 평균값으로 Ra값이 작아질수록 피부 주름의 깊이가 낮아져 주름이 개선됨을 의미하며, 단위는 ㎛이다.

R3z(Base roughness depth)는 R3z1부터 R3z5까지 5가지의 단일 거칠기 깊이에 대한 산술 평균으로 나타낸다. 단일 거칠기 깊이는 거칠기 단면의 단일 평가 거리(Ir)에서 세 번째로 높은 단면 peak과 세번째로 깊은 곡선 사이의 수직거리를 의미한다. R3z의 값이 작아질수록 피부의 주름 깊이가 낮아짐을 의미하며 주름 개선이 되었음을 의미한다.

두 군 간의 눈가 주름 변화 분석 결과 시험군은 대조군과 비교하여 Ra, R3z에서 제품 사용 8주 후 통계적으로 유의한 수준의 눈가 주름 개선 효과가 있음을 알 수 있었다(도 8).

이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> A and PEP INC. Hannam University Institute for Industry-Academia Cooperation <120> DEVELOPMENT OF NEW PEPTIDE DERIVATIVE FOR COSMETIC MATERIAL WITH ENHANCED SKIN PERMEABILITY <130> NP17-11167 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE-1 <400> 1 Ala Phe Pro Gly 1 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE-2 <400> 2 Arg Lys Asp Val Tyr 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE-3 <400> 3 Glu Glu Met Gln Arg Arg 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE-4 <400> 4 Gly Pro Gln Gly Pro Gln 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE-5 <400> 5 Phe Val Ala Pro Asp Pro 1 5

Claims (7)

1. 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 1종의 펩타이드와 탄소수 10 내지 20의 포화 또는 불포화 지방산이 아마이드 결합된 지방산-펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하고;
   상기 탄소수 10 내지 20의 포화 또는 불포화 지방산은 미리스트산(Myristic acid), 스테아릭산(Stearic acid), 리놀레익산(Linoleic acid), 팔미트산(Palmitic acid) , 올레익산(Oleic acid) 및 라우르산(Lauric acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고; 및
   상기 지방산-펩타이드 복합체는 서열번호 1로 표현되는 펩타이드와 미리스트산(Myristic acid) 또는 스테아릭산(Stearic acid)이 아마이드 결합된 복합체이거나,
   상기 지방산-펩타이드 복합체는 서열번호 2로 표현되는 펩타이드와 올레익산(Oleic acid), 리놀레익산(Linoleic acid) 또는 팔미트산(Palmitic acid)이 아마이드 결합된 복합체이거나,
   상기 지방산-펩타이드 복합체는 서열번호 3로 표현되는 펩타이드와 라우르산(Lauric acid), 올레익산(Oleic acid) 또는 스테아릭산(Stearic acid)이 아마이드 결합된 복합체이거나,
   상기 지방산-펩타이드 복합체는 서열번호 4로 표현되는 펩타이드와 스테아릭산(Stearic acid), 미리스트산(Myristic acid) 또는 팔미트산(Palmitic acid)이 아마이드 결합된 복합체이거나,
   상기 지방산-펩타이드 복합체는 서열번호 5로 표현되는 펩타이드와 라우르산(Lauric acid) 또는 미리스트산(Myristic acid) 이 아마이드 결합된 복합체인 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 지방산-펩타이드 복합체는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 보호기로 이용하여 제조된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   상기 화학식 1에서,
   R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 탄소수 1 내지 20의 직쇄 또는 가지형의 탄화수소기이다.
5. 제1항에 있어서,
   상기 지방산-펩타이드 복합체는 MMP-1 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 지방산-펩타이드 복합체는 피부 세포 내 콜라겐 생합성을 활성화하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   상기 지방산-펩타이드 복합체는 프란츠 확산 세포(Franz diffusion cell)를 이용한 피부 투과도(실험 24시간 경과 기준)가 0.01mg/㎖ 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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