DE1617741C - Verfahren zur Herstellung eines Glyco peptides aus Magenschleimhaut oder Zwölf fmgerdarm von Schweinen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines Glyco peptides aus Magenschleimhaut oder Zwölf fmgerdarm von SchweinenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung eines Glycopeptides aus Magenschleimhaut oder Zwölffingerdarm von Schweinen.
Herstellung eines Glycopeptides aus Magenschleimhaut oder Zwölffingerdarm von Schweinen.
Die Existenz von Makromolekülen von zusammengesetzter Natur, die zwischen Proteinen und Polysacchariden
liegen, in tierischen Organen ist allgemein
bekannt. Diese Substanzen sind als Glycoproteide
bezeichnet worden.
bekannt. Diese Substanzen sind als Glycoproteide
bezeichnet worden.
Die Struktur dieser Makromoleküle kann in grober
dingungen das Material schnell zerstört wird. Aus den gleichen Gründen ist bei hohen pH-Werten (über 9)
eine besonders sorgfältige Kontrolle der angewandten Temperatur und der Zeitdauer des Erhitzens erforder-5
lieh. Am Ende der Hydrolyse kann es zweckmäßig sein, die Ausfällung aller organischen Substanzen mit
saurem Charakter wie den schwefelhaltigen Mucopolysacchariden zu bewirken. Wenn demnach die Hydrolyse
bei alkalischem pH-Wert durchgeführt worden ist, Annäherung als die Kombination von einem oder io kann die Mischung wieder durch Zugabe einer
mehreren Molekülen eines Polysaccharides mit einem schwachen Säure (z. B. Essigsäure) auf einen sauren
oder mehreren Molekülen eines Proteins vermutet pH-Wert gebracht werden, wodurch die Ausfällung
werden. Diese Kombination ist auf Grund von kova- dieser Substanzen bewirkt wird. Das Filtrat wird dann
lenten Bindungen gegeben, und aus diesem Grunde ist von den Proteinabfallen durch Behandlung mit einem
die gesamte Struktur nicht ein Addukt oder ein Korn- 15 Enzym (z. B. Papain) bei einem geeigneten pH-Wert
plex, sondern vielmehr ein einziges Molekül. Bei befreit. Es kann auch zweckmäßig sein, vor der
einigen Arten von Glycoproteiden kann der Proteid- enzymatischen Behandlung eine vorhergehende Ausanteil
vorherrschen, während in anderen Arten der fällung des größten Teiles der Proteinabfälle durch
Polysaccharidteil die Oberhand hat. Der letztere Typus Zugabe eines geeigneten Reagenzes, wie Trichloressigwird'
deshalb in der Regel als Glycopeptid bezeichnet. 20 säure zu bewirken. Durch Verdünnung des Filtrates,
Zu dieser Klasse gehören einige Substanzen, die eine das nach diesen Behandlungsschritten erhalten wird,
sehr große biologische Bedeutung haben, wie bei- mit organischen Lösungsmitteln (Alkohol oder Aceton)
spielsweise diejenigen, die die Blutgruppen charakteri- wird das. rohe Glycopeptid in Form eines weißen bis
sieren. bräunlichen Pulvers erhalten. In den Beispielen wird
Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren 35 über einige chemische Analysen dieses Produktes bezur
Herstellung eines Glycopeptides aus Magen- richtet, welches sich besonders durch die Abwesenheit
Schleimhaut oder Zwölffingerdarm von Schweinen, das von Uronsäuren und die Anwesenheit von nur einer
gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet ist, daß Spur Schwefel auszeichnet.
man die tierischen Organe in Wasser bei 50 bis 1000C Die anschließenden Reinigungsbehandlungen beab-
während 10 bis 45 Minuten bei pH 1,2 bis 4,5 oder 8,5 30 sichtigen insbesondere, von dem Rohprodukt, welches
bis 9,5 hydrolysiert, die sauren Mucopolysaccharide nach dem obenerwähnten Schema erhalten wurde,
durch Säurezugabe abtrennt, das Filtrat mit Aceton
oder Alkohol versetzt, den Niederschlag nach Wiederauflösung in Wasser durch Papain oder Trypsin enzymatisch abbaut und anschließend die Glycopeptide 35
mit Alkohol oder Aceton ausfällt.
oder Alkohol versetzt, den Niederschlag nach Wiederauflösung in Wasser durch Papain oder Trypsin enzymatisch abbaut und anschließend die Glycopeptide 35
mit Alkohol oder Aceton ausfällt.
Das gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellte Glycopeptid hat sich als nützlich bei der pharmazeutischen
Anwendung zur Heilung von Entzündungskrankheiten im allgemeinen und von Geschwüren im 40 mischten Typus, und in diesem Falle wird die Reinibesonderen
erwiesen. gung dadurch erzielt, daß von dem stark sauren
Im wesentlichen besteht das Verfahren gemäß der Charakter der Verunreinigungsmaterialien Gebrauch
Erfindung aus einer milden hydrolytischen Behandlung gemacht wird. In den Beispielen sind beide Reinigungsund
einer anschließenden Entfernung des Haupt- verfahren erläutert. Die Ausbeuten der Reinigungsanteiles von Protein- und Mucopolysaccharidischen 45 operation, unabhängig von dem' angewandten VerAbfällen
durch Fällung und anschließende Proteolyse fahren, schwanken zwischen 65 und 75 Gewichtsmittels Enzymen. Es ist in diesem Zusammenhang prozent, und das so erhaltene Produkt liegt in Form
interessant, daß gemäß Vorveröffentlichungen in der eines farblosen, geruchlosen und amorphen Pulvers
Literatur betreffend andere Arten von Verbindungen vor. Die Phosphor- und Schwefelgehalte des gereinigdie
enzymatische Proteolyse vollständig die Protein- 5° ten Produktes sind praktisch vernachlässigbar. Außerketten,
die als Verunreinigungen vorhanden sind, zer- dem sind nicht vorhanden Uronsäuren, während auf
stört, jedoch den peptidischen Anteil nicht ändert, der der anderen Seite Flexosamine im Bereich von 40 bis
das Extraktionsprodukt charakterisiert. 50%, Aminosäuren im Bereich von 13 bis 18%,
Die hydrolytische Behandlung wird mit einem Organ Hexosen im Bereich von 27 bis 31 % und Derivate von
durchgeführt, das vorher zerkleinert und in Wasser 55 Neuraminsäure im Bereich von 4 bis 6% anwesend
angeschlämmt wurde. Sie kann bei einem pH-Wert sind.
innerhalb eines großen Bereiches durchgeführt werden. Das Produkt scheint auf Grund der analytischen
Es werden erhöhte Temperaturen von zwischen etwa Untersuchungen einheitlich zu sein (Elektrophorese,
50 und IOO"C für einen Zeitraum von etwa K) bis Papiercroinatography usw.), und es wird durch
Minuten angewandt. Aus Gründen einer bequemen 60 Kupfersulfate alkalischem Medium (Biuret Reagenz)
Durchführung des Verfahrens und einer einfachen in quantitativer Ausbeute gefällt.
Kontrolle wird eine Hitzcbehandliing durch F.rwürmen Die erwähnten analytischen Daten gestatten, das
Kontrolle wird eine Hitzcbehandliing durch F.rwürmen Die erwähnten analytischen Daten gestatten, das
auf den Siedepunkt, d. h. auf Temperaturen von etwa Produkt zu den Glycopeptiden zu klassifizieren, wäh-I
(X)''C bevorzugt. Der pH-Wert kann auf Werte einge- rend auf der anderen Seite die Anwesenheit von
stellt werden, die im Bereich von etwa 1,2 bis 4,5 oder 65 Hexosamiiien, die nicht von Uronsäuren begleitet sind,
8,5 bis '),5 liegen, und /.war durch geeignete Zugabe und die Abwesenheit von schwefelhaltigen Gruppen
von Säuren oder Alkalien. Insbesondere Werte über aller Art ein charakteristisches Merkmal für den polyp!l
IO sollen vermieden werden, da unler diesen He- saechandisehiii Teil dieser Substanz darstellen.
Verunreinigungen von salzartigem Charakter zu entfernen und ein Material zu erzeugen, welches eine konstante
analytische Zusammensetzung aufweist. -
Die Reinigung kann im wesentlichen nach zwei Methoden durchgeführt werden:
Entweder mittels Dialyse (die Verunreinigungen sind leicht dialysierbar) oder durch Überleitung über ein
Ionen-Austauscherharz des sauren Typus oder des ge-
i 617 741
Pharmakologische Versuche an Laboratoriumstieren
haben ergeben, daß dieses Glycopeptid in einer Dosis von 12,5, 25 oder 50 mg/kg inhibierend wirkt auf das
lokale ödem durch Carragenin und Serotonin, die Diffusion von Blue Evans in den intradermalen
Schwielen durch Serotonin, Dextran und Bradykinin sowie das Wachstum von Baumwoll-Kügelchen-Granulomen
bei der Ratte. Bei einer Dosis von 100 mg/ kg vermindert das untersuchte Produkt den Prozentsatz
an Ratten, die befallen sind, und die Schwere am Pylorus-ligation-Geschwür gemäß S hay und an
»Fast«-Geschwür. Darüber hinaus kann es die Wiederherstellung der Funktionsfähigkeit von entzündeten
Gliedern (Arthritis durch AgNO3) beschleunigen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne daß sie in irgendeiner Weise beschränkend
wirken.
10,2 kg tiefgefrorener, fettfreier Zwölffingerdarm vom Schwein wurden in einer Fleischhackmaschine
zerkleinert, die mit einer durchlöcherten Platte mit Löchern von 1,1 mm Durchmesser versehen war. Das
Material wurde in 10 Litern Wasser suspendiert und unter Rühren. 15 Minuten lang gekocht. Während
dieser Behandlung wurde der pH-Wert der Lösung auf 9,2 gehalten, in dem wiederholt 3 n-Natriumhydroxidlösung
zugegeben wurde. Am Ende dieser Periode wurde der pH-Wert durch Zugabe von 80°/0iger Essigsäure
(etwa 600 ml) auf 4,7 eingestellt. Die Mischung wurde auf 300C abkühlen gelassen und nach Zugabe
von 10 Litern Aceton und 1 kg Filterhilfe filtriert, indem durch ein Tuch durchlaufen gelassen wurde. Auf
diese Weise wurden 22 Liter des Filtrates erhalten. Diese wurden weiter verdünnt mit 55 Litern Aceton.
Auf diese Weise wurde ein Produkt ausgefällt, welches durch Dekantieren gesammelt wurde, mit Aceton gewaschen,
unter Vakuum getrocknet und gemahlen wurde. Das Gewicht des so erhaltenen trockenen
Pulvers betrug etwa 3 kg.
Dieses Pulver wurde in 9 Litern Wasser dispergiert. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 2 η-Salzsäure auf
5,7 eingestellt. Dann wurden 20 g Natriumchlorid und 20 g Papain zugegeben. Anschließend wurde die
Mischung unter Rühren 24 Stunden lang auf 60° C erhitzt.
Nach Beendigung der Papainbehandlung wurden 50 g Filterhilfe zugegeben, und das Gemisch wurde
filtriert, indem es durch ein Tuch durchlaufen gelassen wurde. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck
(50 mm Hg) auf ein Volumen von 3 Litern eingeengt. Anschließend wurde mit 2,7 Litern Aceton behandelt.
Es wurde auf diese Weise ein Niederschlag erhalten, der durch Dekantieren gesammelt, mit Aceton gewaschen
und unter Vakuum getrocknet wurde.
Die Ausbeute an rohen Glycoproteinen betrug etwa 66 g. Dieses Produkt hatte die folgenden Eigenschaften:
P = 3,63%; S = 0,21%; N = 5,91%; Acetyl-Gruppen: 7,12%; Viskosität (in.1% Lösung)
bei 20°C = 1,2699 cP; pH (1% Lösung) = 6,9.
B e i s ρ i e 1 2
3,8 kg tiefgefrorene Magenschleimhaut vom Schwein wurden in einer Fleischhackmaschine zerkleinert, die
mit einer durchlöcherten Platte versehen war, welche Löcher von 1,1 nun Durchmesser aufwies. Das Material
wurde in 7,5 Litern Wasser suspendiert und 15 Minuten lang unter Rühren gekocht. Während dieser
Behandlung wurde der pH-Wert der Lösung durch wiederholte Zugabe von 2 n-Natriumhydroxidlösung
auf 8,6 gehalten. Am Ende dieser Periode wurden zunächst 250 ml 80%iger Essigsäure zugegeben und anschließend
eine solche Menge an Trichloressigsäure (etwa 160 g), als ausreicht, um den pH-Wert auf 1,8 zu
bringen. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt, und das klare Filtrat wurde
mit dem vierfachen Volumen an Aceton verdünnt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt,
mit Aceton gewaschen, unter Vakuum getrocknet und gemahlen. Auf diese Weise wurden 47 g eines
Pulvers erhalten, welches nach Einstellung des pH-Wertes auf 5,7 wie im Beispiel 1 beschrieben der Papain-Proteolyse
unterworfen wurde. Das nach diesem Verfahren erhaltene Rohprodukt wog 20 g. Dieses Pro->
dukt hatte die folgenden analytischen Werte: P = 4%; N = 6,2%.
1 kg tiefgefrorener, fettfreier Zwölffingerdarm vom Schwein wurde in einer Fleischhackmaschine zerkleinert,
welche mit einer durchlöcherten Platte ausgestattet war, die 1,1 mm Löcher aufwies. Das Material
wurde in 1 Liter Wasser suspendiert und, nachdem der
as pH-Wert durch Zugabe von 80%iger Essigsäure auf 4
eingestellt worden war, unter Rühren gekocht.
Die Mischung wurde 15 Minuten lang sieden gelassen. Dann wurde sie abkühlen gelassen und zentrifugiert.
Das Filtrat wurde mit 10 g Natriumacetat behandelt und dann mit dem vierfachen Volumen Aceton
verdünnt. Der Niederschlag wurde durch Dekantieren abgetrennt, mit Aceton gewaschen, im.Vakuum getrocknet
und gemahlen. Es wurden so 11 g eines Pulvers erhalten, welches der proteolytischen Papainbehandlung
wie im Beispiel 1 beschrieben unterworfen -wurde, nachdem der pH-Wert auf 5,7 eingestellt worden
war.
Das gemäß diesem Verfahren erhaltene Rohprodukt wog 5,2 g. Dieses Produkt hatte die folgenden analytisehen
Werte: P = 2,5%; N = 6,03%.
B e i s ρ i e 1 4 '
1 kg tiefgefrorener, fettfreier Zwölffingerdarm vom Schwein wurde in einer Fleischhackmaschine zerkleinert,
die eine Lochplatte mit 1,1 mm. Löchern enthielt. Das Material wurde in 1 Liter Wasser suspendiert
und, nachdem der pH-Wert durch Zugabe von Trichloressigsäure auf einen Wert von 1,7 eingestellt
worden war, auf 50° C erhitzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang auf dieser Temperatur unter Rühren
gehalten und dann abkühlen gelassen und anschließend zentrifugiert. Das Filtrat wurde mit 15 g Natriumacetat
behandelt, und dann mit dem vierfachen Volumen Aceton verdünnt. Der Niederschlag wurde
55· durch Dekantieren abgetrennt, mit Aceton gewaschen, getrocknet und unter Vakuum gemahlen. Es wurden
so 9 g eines Pulvers erhalten, welches, wie im Beispiel 1 beschrieben, der proteolytischen Papainbehandlung
unterworfen wurde, nachdem der pH-Wert auf 5,7 eingestellt worden war.
Das gemäß diesem Verfahren erhaltene Rohprodukt wog 4,8 g.
Dieses Produkt hatte die' folgenden analytischen
Werte: P = 2,6%; N =6,1%.
B e i s ρ i e I 5
HX) g rohes Glycoprotein, wie es nach den in Beispielen
I bis 4 beschriebenen Verfahren erhalten wurde,
wurden in 1 Liter Wasser suspendiert. Die Suspension wurde durch Zentrifugieren von unlöslichen Teilen
befreit, und das Filtrat wurde mit 2 n-Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,8 eingestellt. Die so erhaltene
Lösung wurde der Dialyse mit entionisiertem Wasser bei 20uC durch eine Zellulosemembran von 0,03 mm
Stärke für einen Zeitraum von 48 Stunden ausgesetzt. Am Ende dieser Behandlung hatte die Lösung ein
Volumen von 2 Litern erreicht. Die Lösung wurde auf das ursprüngliche Volumen (1000 ml) unter vermindertem
Druck (50 mm Hg) konzentriert, mit 5 g Natriumchlorid behandelt und mit 1200 ml Aceton
oder 2500 ml Methanol verdünnt. Der entstandene Niederschlag wurde durch Dekantieren gesammelt,
mit dem für die Fällung verwendeten Lösungsmittel gewaschen, unter Vakuum getrocknet und gemahlen.
Die Ausbeute betrug 69 g.
Dieses Produkt hatte die folgenden analytischen Werte: P = kein; S = O,25°/O; N = 5,81%; CH3CO
= 9,75%; Viskosität (in 1% Lösung) bei 200C = 1,6409 cP; Na = 0,71 %; pH (1% Lösung) = 6,3;
Hexosamine = 39,2%; Uronsäuren — keine; Proteine = J6,3% (FOLIN); Hexosen = 29,5%; Neuraminsäure-Derivate
4,55%.
100 g des gemäß den in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Verfahren erhaltenen Glycoproteids wurden
in 1 Liter Wasser suspendiert. Die Suspension wurde durch Zentrifugieren von unlöslichen Anteilen
befreit, und das Filtrat wurde mit 150 ml eines stark sauren, — SO:!H-Gruppen enthaltenden Kationenaustauschers
auf Polystyrolbasis bei Zimmertemperatur V2 Stunde lang behandelt. Das Harz wurde dann mit
100 ml destilliertem Wasser gewaschen, und die Waschflüssigkeiten wurden mit der Hauptlösung vereinigt.
Dann wurden 5 g Natriumchlorid zugefügt, und die Lösung wurde durch Verdünnen mit 1320 ml Aceton
gefällt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Dekantieren gesammelt und 3mal mit Aceton gewaschen.
Der Niederschlag wurde dann in 750 ml Wasser wieder gelöst und der pH-Wert der Lösung durch Behandlung
mit 2 n-NaOH auf 6,2 eingestellt. Dann wurden 3 g Natriumacetat zugegeben, und die wäßrige ,Lösung
wurde mit dem 2,5fachen Volumen Aceton verdünnt. Dabei wurde ein Niederschlag gebildet, der durch
Dekantieren gesammelt, mit Aceton gewaschen, unter Vakuum getrocknet und gemahlen wurde. Die Ausbeute
betrug 67 g.
Bei Arbeiten in industriellem Maßstab kann die Behandlung mit dem Ionen-Austauscherharz in geeigneterer
Weise mittels eines Kolonnendurchlaufs durchgeführt werden. Das Verfahren selbst wird aber
dabei im wesentlichen nicht geändert. Das Produkt hatte die folgenden analytischen Werte: P = 0,08%;
S = 0,2%; N = 6,03%; CH3CO = 9,34%; Na = 0,43%; pH (1% Lösung) = 6,2; Hexosamine
= 39,5%; Uronsäuren = keine; Hexosen = 29,5%; Viskosität (in 1% Lösung) bei 200C = 1,9189 cP;
Proteine (FOLlN) = 14,0%; Neuraminsäure-Derivative = 5,33%.
B e i s ρ i e I 7
100 g des nach den in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Verfahren erhaltenen rohen Glycoproteids
wurden in 1 Liter Wasser suspendiert. Die Suspension wurde durch Zentrifugieren von unlöslichen Anteilen
befreit, und das Filtrat wurde mit 100 ml eines, stark sauren Kationenaustauschers (Säureform, aktiviert mit
10% HCl) behandelt. Nach 30 Minuten langer Dauer
ίο dieser Behandlung wurde das Harz durch Filtration
entfernt und mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Waschlaugen wurden mit dem Filtrat
vereinigt. Diese Lösung wurde wiederum mit 100 ml eines stark basischen Anionenaustauschers auf PoIystyrolbasis
mit — [NR-jR^-Gruppen, wobei R1 keine
Mgthylgruppe ist (basische Form, aktiviert mit 5% NaOH), für einen zusätzlichen Zeitraum von 30 Minuten
behandelt. Das Harz wurde durch Filtration entfernt und mit 150 ml destilliertem Wasser gewaschen.
Die Waschflüssigkeiten wurden mit dem Filtrat vereinigt, und der pH-Wert wurde durch Zugabe von
2 n-NaOH auf 6,2 gebracht. Dann wurden 5 g Natriumacetat zugefügt, und anschließend wurde mit dem
gleichen Volumen Aceton verdünnt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Dekantieren gesammelt,
mit Aceton gewaschen, im Vakuum getrocknet und gemahlen. Ausbeute: 70g.
Beim Arbeiten im technischen Maßstab ist es bequemer, die Behandlung mit dem erwähnten lonen-Austauscherharz
dadurch auszuführen, daß durch eine geeignete Kolonne durchlaufen gelassen wird, wobei
jedoch keine wesentliche Modifikation dieses Prozesses vorgenommen wird.
Das erhaltene Produkt hatte die folgenden analytisehen
Werte: P = 0,04%; S = 0,11%; Na = 0,27%; Acetylgruppen = 9,93%; N = 5,74%; Hexosamine
= 40%; Uronsäuren = keine; Proteine (FOLlN) = 14,5%, Hexosen = 31%; pH(l% Lösung) = 6,3;
Viskosität (in 1% Lösung) bei 20° C = 1,9004; Neuraminsäure-Derivative = 5,20%.
Claims (1)
1. Verfahren·zur Herstellung eines Glycopeptids
aus Magenschleimhaut oder· Zwölffingerdarm von Schweinen, dadurch gekennzeichnet,
daß man die tierischen Organe in Wasser bei 50 bis 100° C während 10 bis 45 Minuten bei pH 1,2 bis 4,5
oder 8,5 bis 9,5 hydrolysiert, die sauren Mucopolysaccharide durch Säurezugabe abtrennt, das Filtrat
mit Aceton oder Alkohol versetzt, den Niederschlag nach Wiederauflösung in Wasser durch
Papain oder Trypsin enzymatisch abbaut und anschließend die Glycopeptide mit Alkohol oder
Aceton ausfällt.
2: Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die nach Anspruch 1 erhältlichen
Glycopeptide nach Wiederauflösung in Wasser durch Dialyse oder Behandlung mit Ionenaustauschern
entsalzt.
Family
ID=
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