DD299212A7 - Verfahren zur reinigung von serumalbumin - Google Patents

Abstract

Die doppelte Trocknung von Serumalbuminen bewirkt einen Reinigungseffekt, der es ermoeglicht, Albumin, welches nach dem sehr effektiven Hitzeverfahren gewonnen worden ist, in der Zellzucht und anderen biologisch sensiblen Systemen einzusetzen. Zur ersten Trocknung kann das Verfahren der Spruehtrocknung oder der lyophilen Trocknung eingesetzt werden, fuer die zweite Trocknung ist die Lyophilisation noetig. Zwischen beiden Trocknungsprozessen ist eine Tiefenfiltration zwischengeschaltet.{Rinderserumalbumin; Humanserumalbumin; Reinheit; Spruehtrocknung; Lyophilisation; Zellzucht; Proteindenaturierung; Tiefenfiltration; Toxizitaet; Lipoprotein; Proteinaggregat; Hitzefraktionierung}

Description

Charakteristik dor bekannten technischen Lösungen

Albumine verschiedener Spezies besitzen eine große Bedeutung als Biochemikalie, z. B. als Bestandteil von Nährmedien, Zellzuchtmedien sowie als Stabilisatoren für Diagnostika in Biologio, Medizin und Pharmazie.

Die Herstellung von Serumalbumin für biologisch-medizinische Zwecke, erfolgt im wesentlichen nach 3 Verfahren:

- Ionenaustausch-und Gel-Chromatographie-Verfahren („Methods of Pharma Protein, Fractionation" Ed. by J.M.Curling, Academic Press, London 1980; „Separation of Plasma Proteins" Ed. by J. M. Curling, Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala 1983)

- Kältefroktionierung mit Ethanol nuui Cohn (E. J. Cohn et al. J. Amer. Chem. Soc.68,459-475 [1946])

- Thermofraktionierungsverfahren, bei denen die anderen Plasmaproteine denaturiert und ausgefällt werden (W. Schneider et al. Vox Sang.31,141-151 11976]).

Das so gewonnene Albumin wird als Lösung oder in getrockneter Form verwandt.

Das mittels Ionenaustausch und Gel-Chromatographie abgetrennte Albumin besitzt zwar eine Reinheit von 99%, die Durchführung dieses Trßnnverfahrens ist im industriellen Maßstab aber aufwendig und die Prozeßführung problematisch.

Die Fraktionierungsverfahren nach Cohn liefern Produkte mit einer 96-98%igen Reinheit. Der apparative und brandschutztechnische Aufwand ist bei diesem Verfahren hoch.

Mit geringem Aufwand ist Albumin nach einem Thermofraktionierungsverfahren nach Schneider herstellbar. Albumin wird dabei in hoher Ausbeute und Reinheit erhalten.

Der Einsatz des so gewonnenen Albumins ist aber wegen noch vorhandener Begleitproteine in der Zellzucht oder bei anderen biologisch sensiblen Systemen nur begrenzt möglich,

Besonders nach dem Hitzeverfahren hergestellte Albumine enthalten denaturierte Lipoproteine und Proteinaggregate, die nur schwer entfernbar sind und toxische Wirkung auf biologische Systeme haben. Sie wirken störend in zweifacher Hinsicht:

1. Es werden keine klaren, sondern opaleszente, schwer filtrierbare Albuminlösungen erhalten.

2. Diese Beimengen wirken cytotoxisch.

Da das Albumin bei dem Prozeß in über 99%iger Reinheit erhalten wird sind die Begleitproteine nur in geringer Konzentration vorhanden. Immunglobuline sind in dem Produkt nicht nachweisbar. Durch den in der DE-OS 3325223 sowie von U.-B. Hansson, Acta chem. Scand. 22,483 (1968) beschriebenen Denaturierungsprozeß für Immunglobuline durch Gefrieren und Auftauen ist eine Qualitätsverbesserung unseres Produktes nicht erreichbar. Das Albumin und seine Begleitproteine werden durch den Prozeß des Gefrierene und Auftauens nicht verändert.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Reinigung von Serumalbumin, das nach dem Thermofraktionierungsverfahren gewonnen wurde. Das gereinigte Albumin soll ohne Einschränkungen für die Anwendung in der Zellzucht odor für den Einsatz biologisch sensibler Systeme geeignet sein.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, die Lipoproteine und Proteinaggregate auf technologisch einfachem Weg aus dem Albumin zu entfernen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die denaturierten Nebenprodukte durch doppelte Trocknung des Albumins mit einer zwischengeschalteten Tiefenfiltration beseitigt werden. Dazu wird die gewonnene Albuminlösung diafiltriert, anschließend lyophil- oder sprühgetrocknet, wieder gelöst, tiefenfiltriert und nochmals lyophil getrocknet.

Bei der Filtration werden unlösliche Bestandteile, z. B. Lipoproteine und Proteinaggregate, zurückgehalten und somit abgetrennt.

Der Trocknungsprozeß nach der Diafiltration führt zu einer völligen Denaturierung der noch vorhandenen instabilen Bestandteile, die dann durch Tiefenfiltration leicht abtrennbar sind. Das Albumin als wirksame Komponente bleibt bei diesem Prozeß unangetastet.

Das so gewonnene monomere Albumin ist hochrein, von heller Farbe und ergibt in Wasser gelöst eine klare Lösung.

Die erfindungsgemäß gewonnenen Albumine sind hervorragend als Biochemikalie- besonders für die Zellzucht und andere sensible biologische Systeme-einsetzbar.

Durch die gute Qualität ist es möglich, für viele Anwendungszwecke das sehr teure und in unzureichender Menge zur Verfügung stehende fetale Kälberserum als Medienzusatz abzulösen. Große Bedeutung hat das erfindungsgemäß hergestelltes Rinderserumalbumin als Medienbestandteil für den Embryotransfer.

Ausführungsbeispiel 1

11 Rinderserum mit einem Eiweißgehalt von 6% wird mit 5ml einer Lösung von Natriumoctanoat (2 Mol/l) und 93ml Ethanolversetzt. Mit Salzsäure (1 Mol/l) wird der pH-Wert auf 6,5 eingestellt. Dieses Gemisch wird unter Rühren für 30 Minuten auf 68"Cerhitzt und danach auf 12⁰C abgekühlt. Mittels Salzsäure (1 Mol/l) wird der pH-Wert auf 4,9 eingestellt und 60g eines

Filterhilfsmittels eingetragen. Nach gründlichem Rühren dieser Suspension für 20Minuten wird über eine Klärschicht filtriert, wobei die denaturierten Proteine

gemeinsam mit dem Filterhilfsmittel abgetrennt werden.

Der gebildete Filterkuchen wird mit 400ml Wasser ausgewaschen. Das gebildete Filtrat mit einem Eiweißgehalt von etwa 2,5%

wird diafiltriert und auf einen Eiweißgehalt von 10% gebracht.

Diese Lösung wird lyophil getrocknet. Das durch Lyophilisation gewonnene Pulver- etwa 20g -wird in 300ml Wasser gelöst, wobei eine leicht getrübte Lösung

erhalten wird. Diese Lösung wird über ein Asbesttiefenfilter von 30cm Durchmesser filtriert und danach erneut lyophilgetrocknet.

Ergebnisse von Biotesten in Embryonenkulturen unter Zusatz des nach Ausführungsbeispiel 1 präparierten Rinderserumalbumins im Vergleich zum Einsatz des sehr teuren fetalen Kälberserums als Idealmediumzusatz: Folgende Parameter der Embryonenkultur wurden untersucht:

	Fetales Kälber serum	Nach !.Lyo philisation	Nach 2. Lyo philisation
1. Furchungsindex	3,52	0	2,44
2. Intaktheit	100	0	100
3. Weiterentwicklung	100	0	100
4. Blastozysten gesamt	100	0	100
5. Blastozysten geschlüpft	75	0	34

Ausführungsbeispiel 2 Wie Ausführungsbeispiel 1, nur wird hier die erste lyophile Trocknung durch eine Sprühtrocknung ersetzt. Ansonsten erfolgt die Weiterverarbeitung wie unter 1 angegeben. Ausführungsbeispiel 3

11 Humanplasma wird wie im Ausführungsbeispiol 1 und 2 angegeben zum lyophil getrockneten Humanalbumin aufgearbeitet.

Claims (1)

1. Verfahren zur Reinigung von Serumalbumin, das nach dem Thermofraktionierungsverfahren gewonnen wurde, von denaturierten Lipoproteinen und Proteinaggregaten, gekennzeichnet dadurch, daß eine wäßrige Lösung des Albumins einer 2fachen Trocknung durch Lyophilisation oder durch Lyophilisation und Sprühtrocknung mit einer zwischengeschalteten Tiefenfiltration unterworfen wird.

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Dio Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Serumalbumin, das insbesondere nach dem Thermofraktionierungsverfahren aus Serum, Plasma oder Blut von Menschen und Tieren hergestellt worden ist.