DE1963816A1 - Mucoprotein,seine Herstellung und Verwendung - Google Patents

Description

DR. EULE DR. BERG DiPL.-ING. STAPF

PATENTANWÄLTE 1 9 &3 9 1

8 MÜNCHEN 2. HiLBLESTRASSE 2O -

Dr. Eul« Dr. Btrg Dipl.-Ing. Stapf, 8 MOndwn 2, HilblwlroB« 20 ·

Ihr Z*ich«n Uns« Zt'iAmt Datum

19. Dez. 1961

Anwaltsakte 19 059 Be/A

Nlsaui Pharmaceutical Co., Ltd« iDokio (Japan)

ig und ?ssweaⁱ

Die»« ürfindung öturv^f ^;i ©ix*, ^" einte neuartigen ^u.cfcp3?i,-'b^X,-;3_? da ε als Meäil:aKe., ist und weiteriru eir. YarfahrtK sur Karst@lXuz},g Muooproteins au^ dem Terdauuntf^-'^^-kt 'mn. rimgom

*ί ti Ä-:-:

BAD ORIGINAL

man den Verdauungstrakt eines Säugers mit Wasser extra-' hiert, ein Fällungsmittel dem Extrakt zugibt, den Niederschlag sammelt, ihn dann mit Protease "behandelt und Verunreinigungen niederen Molekulargewichts daraus entfernt.

Es ist bekannt, daß Hormone, die die Sekretion von Magensäften inhibieren, aus dem Verdauungstrakt von Säugern abgesondert werden. Ein solches Hormon, als "Gastron" bekannt, ist in den Magensäften enthalten· Ein weiteres Hormon, als "Enterogastron" bekannt, ist im Dünndarm enthalten. Die tatsächliche chemische Struktur dieser Hormone ist Jedoch unbekannt·

Als Ergebnis von Untersuchungen au:£ diesem Gebiet wurde . nunmehr aus dem Verdauungstrakt von Säugern ©in neuartige ε Mucoprotein extrahiert, das sowohl durch eine schleimsekretorische Wirkung als auch durch eine gegen Ulcus ge=» richtete Wirkung gekennzeichnet %at*

Demgemäß ist ein Q-egenstand die^t:;¹ "Srfind'jing, ein sur Herstellung eines neuartigen Muooproteiss mit schleim*

tr©f'3ii3tand dieser Srfisiui?.^ "bestellt ia gIs

fit

BAD ORIGINAL

Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein wirtschaftliches und wirksames Verfahren zur Herstellung eines Mucoproteins zur Verfügung zu stellen.

Diese Ziele werden durch ein Verfahren erreicht, bei dem man den Verdauungstrakt eines Säugere mit Wasser extrahiert, ein Fällungsmittel dem Extrakt zugibt, um einen Niederschlag zu bilden, den Niederschlag mit Protease behandelt und dann Verunreinigungen mit niederem Molekulargewicht daraus entfernt.

Das Mueoprotein dieser Erfindung kann aus vielen Säugern, einschließlich Schweinen, Schafen, Ziegen und Walen, extrahiert werden. Es wird vorgezogen, in diesem Verfahren Wale zu verwenden, weil sie als industrielle Rohmaterialien relativ verfügbar sind. Der Gehalt an Mucoprotein ändert sich im gesamten Verdauungstrakt. In der Schleimabsonderungsschicht des Magens und besonders in der Schleimabsonderungsschicht der Mucosa in dem Bereich der Pylorusdrüse und in den Eingeweiden, besonders im oberen Teil des Dünndarms, ist der Gehalt an Mucoprotein hoch. Demgemäß ist es vor-• teilhaft, das Mucoprotein aus diesen Bereichen zu extrahieren»

Der Teil des Verdauungstrakts, der zur Behandlung vorgesehen ißt, wird mittels einem Fleischwolf zerkleinert und .mit kochendem Wasser, einer wäßrigen Lösung von verdünntem

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Alkohol, wie einer 30 fiigen Äthanollösung, einer 50 #igen Methanollösung oder einer 0,1 N Salzsäure-50 #igen Äthanollösung extrahiert, oder der zerkleinerte Verdauungstrakt wird mit einer wäßrigen Lösung von verdünnter Säure, wie einer 0,1 N SaIζsäurelösung, einer 5 #igen Essigsäurelösung oder einer 1 $igen Schwefelsäurelösung behandelt.

Der Extrakt wird von den Feststoffen abgetrennt und ein Fällungsmittel zugegeben. Zu geeigneten Fällungsmitteln ge-• hören Benzoesäure, Ammoniumsulfat, Natriumchlorid, Pikrinsäure, Tanninsäure, Phosphormolybdänsäure, Tritshloressigsäure, Sulfosalizylsäure oder dergleichen. Um die Dispergierfähigkeit des Fällungsmittels im Extrakt zu erhöhen, ist es vorteilhaft, das Fällungsmittel durch Lösen oder Suspendieren in einem geeigneten Lösungsmittel zuzugeben. Wenn beispielsweise das Fällungsmittel Benzoesäure ist, kann sie in Aceton gelöBt werden. >

Der Niederschlag wird nach herkömmlichen Verfahren, wie durch Saugfiltrieren, Zentrifugalabtrennung oder dergleichen gesammelt und mit Wasser und, sofern notwendig! mit Alkohol, Aceton, Benzol oder einem geeigneten organischen Lösungsmittel gewaschen und getrocknet.

Das Rohprodukt mit dem in dieser Stufe des Verfahrens gebildeten liucoprotein hat eine Bioaktivität von ungefähr 20 mg/kg. Dieses Rohprodukt wird dann zur Bildung einer

O0 9 8 30/-1788 -5- ;,

iti38 ii

hoch aktiven Substanz raffinierte Die wäßrige "Lösung des Eonprodukts wird auf eine geeignete Konzentration, Beispielsweise eine 10 $ige wäßrige lösung und der pH-Wert auf ungefähr 7 eingestellt. "Der durch Zugäbe von Säure gebildete Ni ed er sehlag wird entfernt und die lösung erheut auf pH 4 eingestellt«, Bei· Niederschlag wird gesammelt und entfernt. Durch diese Behandlung wird das in dein Produkt enthaltene unreine Protein ausgefällt und entfernt«, Diese Nachbehandlung ist jedoch nicht immer notwendig* und in vielen Fällen kann die wäßrige lösung des voraüsbezeiehheteh Rohprodukts, wie sie vorliegt, in der nächsten Stufe verwendet werden. Eine Protease, wie Pepsin, Papaih, Trypsin öder eine vom Bacillus subtilis gebildete Protease, wie Prönäse und Nagase usw. wird dann der wäßrigen lösung des Rohprodukts zugegeben, um den Abbau des in dem Rohprodukt enthaltenen Proteins zu bewirken. Die lösung wird dann zur Inaktivierung des Enzyms erhitzt, und die in der lösung enthaltenen Verunreinigungen mit geringem Molekulargewicht und anorganische Salze werden entfernt.

ITm die Verunreinigungen geringen Molekulargewichts uäid die anorganischen Salze zu entfernen, kann aus einer großen Zahl von Verfahren irgendeines ausgewählt werdend Beispielsweise besteht ein solches Verfahren darin_$ die Verunreinigungen, wie Aminosäuren und Peptid® usw_0? mit einem niederen Alkylalkohol zu extrahieren und zn entfernen«, Nach einem

weiterea Verfahren weyden Verunreinigungen niederen Molelcu-000030/1701

' largewichts und anorganische Salze durch Dialyse entf ernt j .wozu man eine Mlfoäüreklässlge Membrane öder ein lönehäus=. ■baüschernarz verwendet» Jedoch besteht der iaeia/teil der Verwendung dieser Verfanren darin, daß das Volumes IiI IMf Behandlung vörgesenenen lösungj die das Mucdprotein entkälf, groß ist und daß ein ledeüt ender Arbeitsaufwand lich ist* um das Mucöprötein durön fenzenträtiöS. und pMlisierüng zu eriiaiteiäi

Es wurde nünmenr gefundenj daß die Verunreinigungen niederen Mölekülärgewicnts und die ahorgänisehen Salze entfernt und die Iiö'suhg in einer einzigen Stufe konzentriert werden, kann, wenn man den iiltrationsdruck unter Verwendung einer vernetzten Dexträn-Membrane erhöht, die ihrerseits so ausreichend vernetzt ist, daß die Diffusion aller gelierten Substanzen mit Molekulargewichten über 1.000 verhindert wird* Solche vernetzten Dextran-Membranen werden beispielsweise als UM-1 oder UM-2-Iyp von der American Corporation ' of USA hergestellt. Das vernetzte Deztran ist auf einer porösen" Trägerplatte, wie einem filterpapier usw., auf ge- ' -*-' bracht und darauf fixiert. Zur Verwendung als vernetzte "/" Dextran-Membrane wird eine solch© mit einer Stärke τοη un~ . gefähr Oj, 05 bis ungefähr O₅5 affii 'b<SY©rsmgt_g wenn man eine Platte verwendet₉ bei ö©r lilterpapisr als

i der

die Lösung unter Rühren "bei erhöhtem Druck filtriert· Der Druck sollte bei ungefähr 5,5 bis 8 kg/cm und vorzugsweise

bei ungefähr 7 kg/cm gehalten werden. Die Fließgeschwindigkeit wird wünschenswerterweise so eingestellt, daß eine Durchschnittsfließg^schwindigkeit von 100 bis 200 ml/St d. erreicht wird, wenn man eine Membrane mit einem Durchmesser von 76 mm verwendet·

In dieser Weise werden Verunreinigungen mit einem Molekulargewicht unter 1.000 und anorganische Salze, die mit dem Mucoprotein vorliegen, vollständig filtriert und entfernt, und gleichzeitig wird der größte Teil der Feuchtigkeit ausgeschieden, wodurch die nachfolgende Lyophilisierurig erleichtert wird.

Es ist wünschenswert, ein Fällungsmittel, das in dem Rohprodukt während der Ausfällungsstufe vorhanden sein kann, zu entfernen, weil das Vorhandensein eines solchen Fällungsmittels sogar in geringen Mengen geeignet ist, die Wirksamkeit der Protease zu verringern, die dem Produkt in dem nachfolgenden Verfahren zugeführt wird. Das Fällungsmittel kann durch jedes der zur Reinigung des Rohprodukts verwendeten Verfahren entfernt werden. Beispielsweise kann das Fällungsmittel durch Dialyse oder durch Druck-Gfelfiltrierung entfernt werden.

Die chemischen Eigenschaften des nach dem vorausgehenden

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Verfahren hergestellten Mucoproteins sind weitgehend in Einzelheiten unbekannte Seine Zusammensetzung scheint Je-.doch annähernd der nachfolgenden Aufstellung zu entsprechen:

Stickstoff do) 12 - 9 $

Protein (°/o) ' 55 - 35 ^

Hexose ($) 15 - 3 $

Aminozucker (io) 25- 5 io

Idpoid -

Ψ sof² . ; ₊ .

In der nachfolgenden Tabelle.sind die Ergebnisse eines Versuchs angegeben, der zur Kennzeichnung der Anti-Ulcuswirkung des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen '■ Mucoproteins durchgeführt wurde» Dabei wurde der Versuch nach dem Shay's-Verfahren wie folgt durchgeführt«

Eine Laparotomie wurde bei männlichen Ratten unter Äther-Anästhesie durchgeführt. Den Ratten mit einem Gewicht von 250 bis 350 g wurde nach 48 Std_e lutterentzug der Pars pylorica abgebunden und sofort der Einschnitt genähte Gleichzeitig wurde eine Testlosung in die Schwanzvene injiziert« Mach 8 Stde wurde die Laparotomie unter Äther-Anästhesie durchgeführt und der Oesophagus an einer Stelle . unmittelbar über der Kardia abgebunden. Der Magen wurde

entfernt, und sowohl die Menge als auch:-.die Acidität der . ' Magensäfte wurde unter Verwendung einer 0,1 E -Matritam-■*■■■-.. . ■ 000830/1711 ". -9-

hydroxidlösung mit Pheno!phthalein als Indikator gemessen. Gleichzeitig wurde das Auftreten von Ulcus an den Magen- und Darmwänden im Vergleich zu einer Eontrollgruppe,der Kochsalzlösung verabfolgt wurde, beobachtet.

Tabelle

Medikament

Dosierung

i, Gewicht

(g)

Menge an Magensäften (ml)

Acidität (ml)*

Auftreten von Ulcus

Magendrüsen

Magen

Kontrolle
(Kochsalz
lösung)

1.0 mg/kg

307

9>5 (1000)

9,00 (10Q

5/5

2/5

Mucοprotein

2.5.

mg/kg

273

2,6 (17,5)

2., 11.

(23,4)

1/5

0/5

Mucopro·
tein

5,0 mg/kg

320

2,1 (21ρβ)

1_f68 (18,7)

0/5

Atropinsulfat

Ur o-

gastros

mg/Im

307 4_S7

5_S
(58,7)

la

HSl _twigc=

BAD ORIGINAL

- ίο -

Aus der vorausgehenden ÜJabelle ist zu ersehen, daß bei den ' Gruppen, denen 2,5 bzw» 5,0 mg/kg Mucoprotein nach der Erfindung verabfolgt wurde, Ulcus bei den-Magendrüsen und im Magen bemerkenswert unterdrückt wurde und daß sowohl die Sekretion von Magensäften als auch von Magensäure auffallend inhibiert wurde. Bei den mit 1_t0 mg/kg Urogastron und 250 mg/kg Sialogastron behandelten Gruppen wurde nur ein begrenztes Ausmaß an Inhibierung von Magendrüsen-Ulcus beobachtet, während fast keine TJlcus-inhibierende Wirkung bei der Gruppe beobachtet wurde, der 1,0 mg/kg Atropinsulfat verabfolgt worden war.

Beispiel 1 ν \ ■

Der Pyiorus-Drüsenbereioli eines gefrorenen "driVfcen Magens eines Wals wurd© allmählich in einer Medertempwaturk-aiamer aufgetaut tmd d±® Mucosa so sorgfältig abgetrennt, daß man 12 kg Sohleialiairt erhielt. Bi@ gehlfdmnaut ward© mit üblichen Il©iöete@l;f ge^&leisfstg uad ü wurden 12 Kg ü@©©©2? svLgQQQtmti uäfi längsrute 30 Miait%@s g@ls©Glito-

s; ia ©im©!¹ IsaX^ta Isiasia??

utss-äo is 1 1 A@Gt@i£ jirSin

BAD ORIGINAL

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wurde erneut 1 Std. gerührt und wieder 16 Stde in eine kalte Kammer (bei 5°C) gebracht·

Der in der Extraktionsflüssigkeit gebildete weiße Niederschlag wurde unter reduziertem Brück saugfiltriert und die Feststoffe gründlich mit Wasser gewaschen. Das feste Material wurde in eine Zentrifugalscheiderröhre üb erführt und· fünf mal mit 500 ml Aceton und zwei mal mit 300 ml Äther gewaschen, bis keine Benzoesäure mehr beobachtet werden konnte» Die feststoffe wurden dann getrocknet, und auf diese Weise wurden 20 g- Rohprodukt erhalten« 10 g" dieses Rohprodukts wurden in 1 1 gereinigtem Wasser gelöst und der pH-Wert auf 8,0 eingestellte line Iiösung aus 100 mg Trypsin wurde in 10 ml Wasser gelöst und 24 Std„ bei 37° C digeriert» Danaeh wurde, um das Trypsin zu inaktivieren, die Flüssigkeit ungefähr 15 Minuten gekocht und dann gekühlt, wonach 1 1 n-Butanol zugegeben und gründlich geschüttelt wurde« Hacn Zentrifugalabtrennung dieses Gemische wurde eine ffasserphase gesammelt, zunächst unter reduziertem Druck auf 200 ml konzentriert und dann mittels Iryophilisierung raffiniert. Auf diese Weise wurden 3 g raffiniertes Mueoproteinpulver erhalten*

Beispiel 2

10 g deß l©hpr©äiiktgmlTers, das nach dem Verfahren von Bei spiel 1 erhalten «urete, wurden in 1 1 gereinigtem Wasser

' -12-

/ ' . 009830/179-0 · ■ ■

■ - 12 -

gelöst«. 20 g Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE-Cellulose) wurden der Lösung zugegeben und die Lösung ungefähr 3 Std. gerührt. Sofort danach wurde die Lösung saugfiltriert, wodurch man Feststoffe erhielt. Die Feststoffe wurden gründlich mit Wasser gewaschen und dann zwei mal, jeweils 30 Minuten, mit 50 ml wäßriger Lösung von 0,1 Έ Natriumhydroxid gewaschen, um die in der DEAE-Gellulose absorbierten

Substanzen auszuschwemmen,. Der Abstrom wurde auf pH 8,0 unter Verwendung von Essigsäure eingestellt, und eine Lösung, die durch Lösen von 100 mg Pronase in 10 ml Wasser hergestellt wurde, wurde zugegeben zur. 24-stündigen Digestierung bei 37⁰Oe Die Lösung wurde dann ungefähr 15 Min. zur Inaktivierung des Trypsins gekocht₀ Danach wurde die Lösung in ein Cellophan-Eohr gebracht und 72 Std· bei reduziertem Druck dialysiert unter Verwendung von Wasser in .dem verbleibenden flüssigen Konzentrate Die konzentrierte Flüssigkeit wurde in salzsaurem Alkohol, der 7 Teile Ithanol und 3 Teile 0,1 Ή Salzsäure enthielt, gelöst, und die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde mittels Zentrifugalabtrennung konzentriert und unter reduziertem Druck getrocknet. Auf diese Weise wurde ein gelblich-weißes Pulver erhalten.·

Beispiel 3 ·

Aus einem gefrorenen männlichen Spermwal j 15 m lang, wurden 4,75 kg obere Dünndarmschleimhaut abgetrennt. Die Schleim-

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BAD

haut wurde mit einem !Fleischwolf zerkleinert und das doppelte Volumen an Wasser zugegeben» !Die Lösung wurde ungefähr 30 Min„ gekocht, bei Zimmertemperatur stehengelassen und dann 16 Std„ in eine kalte Kammer (5 C) gebracht- Die Feststoffe wurden dann unter Verwendung eines Uylongewebes abgetrennt, wodurch man eine Extraktionsflüssigkeit erhielt. Unter Rühren dieser Extraktionsflüssigkeit wurde eine Lösung aus.950 mg Benzoesäure gelöst'in 1 1 Aceton und langsam zugegeben. Die Flüssigkeit wurde dann eine weitere Std. gerührt und erneut in eine kalte Kammer (5°G) 16 Stde gebracht. .

Danach wurde der in der Extraktionsflüssigkeit gebildete weiße Uiederschlag unter reduziertem Druck saugfiltriert und gründlich mit Wasser gewaschen* Der niederschlag wurde darm in einen Zentrifugalabscheider überführt und fünf mal mit 500 ml Aceton und zwei mal mit 300 ml Äther gewaschen, bis keine Benzoesäure mehr festgestellt werden konnte, !lach Trocknen wurden 26,16 g Rohprodukt erhaltene 10 g des Rohprodukts wurden in 1 1 gereinigtem Wasser gelöst und auf pH 8,0 eingestellte Eine Lösung aus 100 mg Trypsin, gelöst in 1Q ml Wasser, wurde ssmgegeben und die Lösung 24 0td» bei 37⁰C digeri@i?t_# Bas !rypsin wurde dann durch ungefähr 15 Minuten.langes lochen und Kühlen inaktiviert, 1 1 n-Butanol wurde zugegeben und gründlich geschüttelt» Durch

wurde die Waas erphass am Boden ge-

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sammelt lind, dann auf 200 ml unter ,.reduziertem Druck kon zentriert« Das raffinierte Mucoproteinpulver wurde gefriergetrocknet» - -

Beispiel 4

25 g rohes Produkt, hergestellt in der gleichen Weise in Beispiel 5> wurden in 500 ml Wasser gelöst und die löaung auf pH 7»0 unter Verwendung von Ammoniak eingestellt.

gekühlt und ungefähr 4 Std. gerührt«

Die Lösung wurde dann ungefähr 5 Min,, bei 100⁰O gekocht,

Nachdem man sie über Nacht stehenließ, wurde ein Niederschlag von dieser Flüssigkeit mittels Zentrifugalabtrennung abgetrennt und 1 1 Wasser mit pH 7₉O zugegeben. Nach Durchführung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 3 wurde die flüssigkeit in einen Niederschlag und Mitrat geteilt, und das Siltrat wurde dem vorherigen Filtrat zugegeben» Das Ultrat wurde dann auf einen pH 4»0 unter Verwendung von Essigsäure, ©ing® st ©lit, ungefähr 5 Min» gekocht, gekühlt, und dann duroß Zentrifugieren abgetrennte Der in dieser Weise erhaltene Niederschlag wurde mit 100 ml Bssigsäur.elösung mit einem pH von 4_?0 gewaschen. Durch Mischen der gewaschene» Flüssigkeit mit dem vorausgehendem Zutrat und durch Ljophiliaieren das Semisoiis wurde eine aktive .

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01830/1718 ' ".

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10 g dieser Substanz wurden dann in 1 1 gereinigtem Wasser," gelöst und nach dem Verfahren von Beispiel 1 unter Bildung' von raffiniertem Mucoprotein raffiniert«

Beispiel 5 ' .

Das in der gleichen Weise wie -in Beispiel 3 hergestellte Rohprodukt wurde in dem 10-fachen Wasservolumen gelöste Eine gesättigte Lösung von Ammoniumsulfat wurde bei 20⁰G hierzu zugegeben und der pH-Wert auf 7»O eingestellt, ao daß man eine Ammoniumsulfat-Konzentration mit 50 #iger Ammoniumsulfatsattigung erhielt. Die Lösung ließ man über Nacht in einer thermostatisch bei 20⁰G gehaltenen Kammer stehen, und sie wurde dann durch Zentrifugieren abgetrennt, wodurch man einen Niederschlag und eine überstehende flüssigkeit erhielt« Der Niederschlag wurde in Wasser suspendiert und danach bei 4⁰G unter Verwendung einer Oellophan-Membrane 48 Std» dialysierto Das Innendf;alysat wurde lyophilisiert und auf die»* Weise der Wirkstoff erhalten. 10 g dieser Substanz wurden wie in Beispiel '3 beschrieben verarbeitet, wodurch man ein raffiniertes Mucoprotein erhielt.

Beispiel 6 ·

2.500 g Magenschleimhaut wurden zerkleinert und das zweifache Wasservolumen zugegeben· Nach 30 Min· langem Kochen - ' war die Extraktion durchgeführt. Nach Abkühlen wurde die Flüssigkeit filtriert und der Rückstand erneut mit dem

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doppelten Volumen Wasser gemischt und- 30 Min» gekocht. Beide Extraktionsflüssigkeiten wurden mit dem Rückstand zusammengegeben und "bei 5⁰C über Nacht stehengelassen» Danach wurde die gemischte Flüssigkeit filtriert» Eine Lösung, die durch Lösen von 500 mg Benzoesäure in 1 1 Aceton gebildet wurde, wurde dem Filtrat unter Rühren zugegeben« Das Rühren wurde 5 Std. fortgesetzt und die flüssigkeit üb-er Nacht bei 5 0 stehengelassen· Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, nacheinander mit 5 1 Wasser, 5 1,Aceton und 1 1 Äther gewaschen und dann luftgetrocknet* Auf diese Weise wurden 20 g Rohprodukt erhalten«, . . .

2 1 Wasser wurden zu 20 g Rohprodukt zugegeben und der pH-Wert auf 7»0 eingestellt» Eine überstehende Flüssigkeit wurde mittels Zentrifugalabtrennung abgetrennt und 2 1 gesättigte Ammoniumsulfatlösung zugegeben» Die Lösung ließ man dann über Nacht bei 5 G stehen, und sie wurde dann zentrifugal abgetrennt, wodurch man einen weiteren Niederschlag erhielt ο Dieser Niederschlag wurde erneut mit 500 ml gesättigter Ammoniumsulfatlosung gewaschen. Der Niederschlag wurde dann in 500 ml Wasser gelöst und pressfiltriert. Das Pressfiltrieren wurde in der Weise vorgenommen, daß man 250 ml der Lösung in einen Behälter gab, der einen Durchmesser von 76 mm und ein Fassungsvermögen von 400 ml aufwies. Die Lösung wurde mit einem magnetischen Rührwerk

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gerührt und das Filtrieren mit einer durchschnittlichen Fließgeschwindigkeit von 50 ml. pro "Std.. unter Verwendung einer UlI-2~Membrane durchgeführt« Druck von 7 kg/cm wurde über einen Kompressor zugeführt» ΨβτΩΆ der Rückstand auf ungefähr 50 ml verringert war, wurden weitere 250 ml « der oben erwähnten Lösung zugegeben und in ähnlicher Weise filtriert. Wenn der Rückstand auf 50 ml verringert war, wurden 100 ml gereinigtes Wasser zur weiteren Konzentration auf 50 ml zugegeben. Nach Gefriertrocknen des Rückstands erhielt man 11_r8 g Eoh-Mucoprotein. 10 g Roh-Mu co protein wurden zu 1.000 ml Wasser zugegeben und die lösung, auf pH 8,0 eingestellt« Eine Lösung, die 100 mg Trypsin enthielt, wurde in 10 ml Wasser gelöst und 24 Std«, bei 57⁰O des Digestion augeführt« Die Lösung wurde 15 Min« gekocht, um das Irypsin zu inaktivieren, und dann wurde druckfiltriert unter Verwendung einer ϊΜ-2-Typ-Membrane und mit einer durchschnittlichen Fließgeschwindigkeit von 120 ml/Std_ae !lach darauffolgender Lyophilisierung wurden 0,372 g raffiniertes Mucoprotein erhalten. Die Ausbeute an Mucoprotein aus der Magenschleimhaut betrug 0,18 g/kg_e

Belapiel 7 ·

1»65Ö g BünndariESChlfimiiaut wurden wie in Beispiel 6 beschrieben behandelt» 5?45 β Mucoprotein wurden erhaltefi_? die mit trypsin aex Digestion- zugeführt wurden» -"Duron nach.-folgend©© Druckfiltrie-ren mat er Verwendung eines³ Momferaae

ORIGINAL

des ÜM-1-Typs und bei einer mittleren IPließgeschwindigkeit von 100 ml/Std» erhielt man O,85g' raffiniertes iffiucoprotein> .

Claims (1)

1. Pat e η t a η s ρ r ü e h e *

   - ' ■■■· :■". -

   Verfahren zur Herstellung eines Mucoproteins dadurch gekennzeichnet, daß man den Verdauungstrakt eines Säugers mit Wasser extrahiert, dem Extrakt ein fällungsmittel zugibt, den Niederschlag sammelt^ den Niederschlag mit Protease behandelt, darin enthaltene Verunreinigungen niederen Molekulargewichts entfernt und MucopiOtein gewinnt»

   2β Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß als Verdauungstrakt der Schieimhautüberzug des Magens- und/ oder der Schleimhautiiberzug des Dünndarms verwendet wird,

   3· Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß als lällungsmittel Benzoesäure, Ammoniumsulfat, Natriumchlorid, Pikrinsäure, lanninsäure, Phosphormolybdänsäure, Trichloressigsäure und/oder SuIfοsalizylsäure verwendet wird.

   4. Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß Verunreinigungen niederen Molekulargewichts durch Druckfiltrieren unter Verwendung eines? vernetzten Dextranmembrane entfernt werden, durch welche gelierte Substanzen mit Molekulargewichten über 1*000 nicht diffundieren können,

   5* Mucoprotein, das nach einem Verfahren der vorausgehenden Ansprüche erhältlich ist.

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   $At> ORIGINAL

   6o Verwendung des Mucoproteins in Arzneimitteln, insbesondere zur Inhibierung der Sekretion sowohl τοπ Magensäften als auch von Magensäure und zur Ulcus-Supp-reasion»

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